Electroporator למשלוח סדרתית מולקולרי בסיוע וורטקס microscale

Summary

פלטפורמת electroporation סייע מערבולת microfluidic פותחה למסירה רציפה של מולקולות מרובות לתוך אוכלוסיות תאים זהות עם שליטה מדויקת ובלתי תלויה מינון. electroporation צעד טיהור תא המטרה שקדמו מבוסס גודל של המערכת סייע לשפר את יעילות אספקה ​​מולקולרית וכדאיויות תא מעובד.

Abstract

Electroporation זכתה לתשומת לב הולכת וגובר בשנים האחרונות, כי זה הוא טכניקה חזקה מאוד להחדרה פיזית בדיקות מולקולריות אקסוגני שאינו permeant לתוך תאים. עבודה זו מדווחת פלטפורמת electroporation microfluidic מסוגל לבצע משלוח מולקולה מרובה לתאי יונקים עם שליטה מדויקת ומולקולרית תלויה פרמטר. היכולת של המערכת לבודד את התאים עם התפלגות גודל אחידה מאפשרת פחות וריאציה ביעילות electroporation לעוצמת שדה חשמלית נתון; מכאן משופר כדאיות מדגם. יתר על כן, תכונת ההדמיה תהליך שלה מאפשרת להתבוננות בתהליך הניאון המולקולרי הספיגה בזמן אמת, המאפשר התאמות פרמטר מסירה מולקולריות מהירה באתר לשיפור יעילות. כדי להראות את היכולות עצומות של הפלטפורמה דיווחה, מקרומולקולות עם גדלים שונים ומטענים חשמליים (למשל, Dextran עם MW של 3,000 ו -70,000 Da) היהנמסר לתאי סרטן השד גרורתי עם יעילות גבוהה משלוח (> 70%) עבור כל המולקולות שנבדקו. הפלטפורמה שפותחה הוכיחה את הפוטנציאל שלה לשימוש בהרחבה של תחומי מחקר שבו טכניקות electroporation יכולות להיות על שבב מועילות.

Introduction

בשנים האחרונות, השימוש בפולסים חשמליים כדי להקל על משלוח cytosolic של מולקולות תאיים הפך אמצעי אטרקטיבי של מניפולציה תאי יונקים. ¹ תהליך זה, המכונה גם electroporation, הפיך permeabilizes קרום התא, המאפשר למולקולות בלתי חדירים קרום מטבע כדי לקבל גישה לסביבה תאית של התאים. כי כמעט כל מולקולה יכולה להיות מוחדר cytosol באמצעות הנקבוביות שנוצרו זמניות בקרום של כל סוג של תאים באמצעות electroporation, הטכניקה דווחה כיותר לשחזור, ישים באופן אוניוורסלי, ויעיל יותר מאשר שיטות אחרות, כוללים וירוס בתיווך, כימי וגישות אופטיות. ^2-3 טכניקה זו נוצלה להציג את מולקולות ניאון, ⁴ תרופות ⁵ וחומצות גרעין ^6-7, תוך שמירה על תאי קיימא ושלמים. בהתחשב ביתרונות הללו, electroporation אומצה כעבודה משותפתטכניקת atory לtransfection DNA, in vivo ריפוי גנטי ⁸ ומחקרי חיסון תא. היא, לעומת זאת, עדיין קשה למערכות electroporation קונבנציונליות כדי להשיג בו זמנית יעילות מעשית ויכולת קיום לדגימות עם הטרוגניות גדולה בגודלם ועוצמת השדה החשמלי הנדרשת לelectroporation המוצלח בקורלציה הדוקה עם הקוטר של התא. יתר על כן, מערכות אלה אינן מאפשרים שליטה מדויקת של הכמויות מולקולריות מרובות מועברת עקב הסתמכות על תהליך משלוח בתפזורת סטוכסטיים מולקולרי. ⁹ על מנת לטפל בבעיות אלה, קבוצות רבות פיתחו פלטפורמות electroporation microfluidic, המציעות את היתרון של מתחי poration נמוכים יותר, יעילות טובה יותר transfection, ירידה גדולה בתמותת תאים, והיכולת לספק מולקולות מרובות. ^10-13 יתרונות אלה התאפשרו הודות לטביעות הרגליים הקטנות של מערכות electroporation microscale אלקטרודה שהמגרשאורכים הם תת מילימטרים, באופן דרמטי ירידת מתח הנדרש למשלוח מוצלח. יתר על כן, מערכות electroporation microscale אלה יכולים להשיג הפצת שדה חשמלית אחידה ובמהירות לפזר חום שנוצר, מניב תמותת תא מופחת תוך שיפור יעילות משלוח. הניצול של חומרים שקופים לשבבים אלה נוספים מאפשר בתצפית באתרו של תהליך electroporation לשינויים פרמטר הפקודה. ^2,12 עם זאת, שליטה במינון מדויקת ושליטה פרמטר מולקולרית ותאית תלויה, הנדרשת למחקר חדש ויישומים טיפוליים, ^{6, 14-16} עדיין נותר לא פתור.

עבודה זו מציגה מערכת microfluidic בסיוע מערבולת electroporation, מסוגל לספק מולקולות מרובות ברצף לאוכלוסייה זהה שנבחר מראש של תאי מטרה. תאים עם התפלגות גודל האחיד מבודדים לפני electroporation באמצעות si שדווח בעברמנגנון ze סלקטיבי השמנה. ^17-18 על ידי בעל התפלגות אחידה בגודל, פחות וריאציה ביעילות electroporation וכדאיות משופרת לעוצמת שדה חשמלית נתון הושגו. ¹⁹ יתר על כן, ברציפות התססה תאים לכודים באמצעות מערבולות microscale אפשר למסירה אחידה של מולקולות על פני cytosol כל, בהסכם עם התוצאות שדווחה בעבר באמצעות פלטפורמה אחרת electroporation בסיוע מערבולת. ²⁰ כדי להוכיח כי מערכת זו תהיה ישימה למגוון רחב של המולקולות בשימוש הנרחבים ביישומים ביולוגיים, מקרומולקולות עם מגוון רחב של משקלים מולקולריים הועברו ל תאי סרטן השד גרורתי. בנוסף, בעזרת ניטור תהליך בזמן אמת, עבודה זו מספקת ראיות נוספות כדי לשים קץ לוויכוח הארוך הימים בנוגע למנגנון של משלוח מולקולרי לבמהלך electrporation, מכיוון שרוב תושבי אלקטרופורזה בתיווך מול בתיווך דיפוזיה. ¹⁴ בניגוד למערכות electroporation אחרים, פלטפורמה ייחודית זה מספקת יתרונות בשילוב של מסירה מדויקת מרובה מולקולה, יעילות אספקה ​​מולקולרית גבוהה, תמותת תאים מינימאלית, תוחלת רחבה של גודל וחיובים של מולקולות נמסרו, כמו גם להדמיה בזמן אמת של electroporation תהליך. בהתחשב ביכולות אלה, מערכת electroporation פיתחה יש פוטנציאל מעשי ככלי תכליתי ללימודי תכנות מחדש של תאים, אספקת יישומי ^6,14,21-22 תרופה ^10,19 ויישומים הדורשים להבנה מעמיקה של מנגנוני אספקה ​​מולקולריים electroporation.

Protocol

.1 תא הכנה

1. צלחת 1 × 10 ⁵ / מ"ל תאים של שורת תאי סרטן שד גרורתי מד"א-MB-231 בנפח של 10 מ"ל לבקבוק T75 בתרבית רקמה בשל ליבוביץ L-15 בינוניים בתוספת 10% (v / v) בסרום שור העובר ו1 פניצילין, סטרפטומיצין%.
2. דגירה מד"א-MB-231 תאים בחממה humidified על 37 מעלות צלזיוס עם 0% CO ₂ בסביבה.
3. קציר תאים לניסויים 2 ימים לאחר זריעה על ידי טיפול בתאים עם 0.25% טריפסין-EDTA למשך 2 דקות ולהשבית את הפעילות האנזימטית של טריפסין על ידי הוספת 8 מ"ל של תקשורת הצמיחה.
4. תאים גלולה על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות בגרמו 200 × וגלול בתמיסת מלח של Dulbecco פוספט (DPBS, 1x, ללא Ca ^{2 +} וMg ^{2 +)} לריכוז סופי של 5 × ⁵ 10 תאים / מ"ל.

2 עיצוב מכשיר וייצור

הערה: המסכה, בדותות עובש אב ותהליך תוחם microchannel הוא להתנהל בתוך חדר נקי בזמן שניתן לבצע תהליך ליהוק microchannel polydimethylsiloxane (PDMS) על benchtop מעבדה רגיל.

1. עיצוב מכשיר microfluidic כפי שמודגם באיור 1 עם AutoCAD. המכשיר צריך להיות מורכב של כניסה עם יציאות מרובות הזרקה, מסננים גסים ושני ערוצים מקבילים ישר מלבניים אינרציה התמקדות (L = 7 מ"מ, W = 40 מיקרומטר, וH = 70 מיקרומטר). ערוץ ישר פרט מורכב 5 תאים electroporation, אשר ממוקמים 800 מיקרומטר מזה (W _C = 400 מיקרומטר) עם שניים מהם דרך חורים עבור אלקטרודות אלומיניום. שני תאי electroporation transversally סמוכים חולקים את החור להאלקטרודה השלילית. שני ערוצים ישר למזג לשקע במורד הזרם של אזור electroporation.
2. להמיר את קובץ CAD עם מיקרו דפוסים לקובץ GDSII באמצעות LinkCAD. לכתוב מיקרו דפוסים על 5 "X 5" photomask ריקבאמצעות סופר מסכת לייזר. לפתח את המסכה על ידי ביצוע הפרוטוקול של היצרן. הערה: תהליך פיתוח המסיכה כולל פיתוח photoresist, תחריט כרום ולהתנגד להסרת. לחלופין, מיקרו דפוסים מודפסים על שקיפות רזולוציה גבוהה (> 20,000 dpi) ניתן לרכוש מיצרן צד שלישי ומשמש כphotomask. תכונות מיקרוסקופיות סופית על photomask צריכה להיות שקופות כדי להתאים את הקוטביות של photoresist שלילי.
3. לפברק עובש הליהוק של עיצוב המכשיר תוך שימוש בטכניקות ליתוגרפיה רכה סטנדרטית ²³ עם מעיל photoresist השלילי הסתובב על פרוסות סיליקון 4 אינץ ב2,000 סל"ד כדי לקבל את העובי הסופי של 70 מיקרומטר.
4. Prebake הרקיק עם photoresist השלילי עבור 20 דקות על 95 מעלות צלזיוס.
5. צור את המסכה עם הרקיק ולחשוף למקור UV (17.4 mJ / ² סנטימטר) ל80 שניות באמצעות aligner מסכה.
6. לפתח את הרקיק החשוף למשך 4 דקות במפתח SU-8.
7. מדוד אתעובי photoresist מפותח באמצעות profilometer משטח.
8. בקפדנות לערבב 10: 1 יחס של אלסטומר לסוכן ריפוי (ערכת אלסטומר סיליקון) ויוצקים את התערובת על תבנית היציקה כדי ליצור העתקים PDMS. דגה אלסטומר הליהוק ל30 דקות ולרפא את תבנית היציקה עם אלסטומר degassed בתנור על 70 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
9. Delaminate העתק PDMS נרפא עם דפוסי microchannel מחורי העובש ואגרוף להוספות פתחי הכניסה, יציאה ואלקטרודה באמצעות צבת סיכה. הערה: קוטר חוד החנית הרגיל של צבת הסיכה צריכה להיות 0.76 מ"מ, מתאים לחוזקה מחזיק צינורות הצצה (OD של 1/32 ") ואלקטרודות אלומיניום (OD של 0.029") במקום.
10. ליצור ערוצי microfluidic מוקפים העתקים PDMS מליטה לשקופיות זכוכית שטופלו בשואב חמצן פלזמה ל7 שניות בלחץ חלקי כוח וחמצן בתדר רדיו של 75 W ו500 mTorr, בהתאמה.

.3 ניסויי זרימה

1. הכנסאלקטרודות אלומיניום (0.029 "OD) וצינורות הצצה לשקע (1/32" OD) למקומות המיועדים באמצעות חורים בmicrochannel (ראו איור 3 ב).
2. חיבור הציוד החשמלי ¹⁸ האחראי ליצירת פולסים מרובע גל קצר במתח גבוה לאלקטרודות האלומיניום (ראה איור 3 ג) שנמצאים בקשר עם זורם פתרונות בעובש PDMS. הערה: הציוד צריך להיות מורכב של גנרטור דופק ומגבר מתח גבוה שנבנה בבית ^18.
3. הכן ארבעה 50 צינורות מ"ל צנטריפוגות בנפרד מכילים DPBS, פתרונות עם תאים ומולקולות ביולוגיים, ולצרף כל צינור לבעל הבקבוקון שלו בהתאמה מחוברת למערכת בקרת זרימת פנאומטי (ראה איור 3 א). ¹⁸
4. חיבור צינורות הצצה כניסה ממחזיקי הבקבוקון לתוך חורי כניסה המתאימים במכשיר microfluidic.
5. הגדר את סדר הגודל של פולסים מרובעים גל, V, ל100 V כדי שיהיה לי אוף החשמליכוח ld, _דואר E = V / L, על פני תא electroporation להיות שווה ערך ל0.7 ק ו / סנטימטר. הערה: הנה, _דואר L הוא המרחק בין שתי נקודות שבן אלקטרודות החיוביות ושליליות נמצאות בקשר עם הפתרון הזורם (ראה איור 1).
6. הגדר את וסת לחץ 40 psi. הערה:. מקור חנקן להתאמה באופן ידני אחת משמש לחצים באופן אחיד את כל בקבוקוני המדגם וסעפת במהירות גבוהה היא מנוצלת להפעלה בזמן יציאות פתרון בודדות באמצעות תוכנת LabVIEW שהותקן ¹⁸
7. לבקרת שסתום, לפתוח את תוכנת LabVIEW שהותקן שכותרת Valve ראנר, ולחץ לרוץ מהתפריט הנפתח הזכאי לפעול.
8. הפעל סתום על ידי לחיצה על כל אחד מסמלים שסתום המתאימים. הערה: סמל השסתום צריך להפוך ירוק כאשר הוא מופעל. לחיצה על הסמל הפעיל לבטל ולסגור את הברז. סמל השסתום הסגור צריכה להאפיר.
9. פתח את השסתום למאגר DPBS (כלומר., פתרון כביסה) לראש מהירות זרימה הנדרשת לדור מערבולת תא לכידה יציב ל1.5 דקות.
10. לעבור את יציאת פתרון הפעילה מפתרון הכביסה לפתרון התא לתאי מלכודת בתא electroporation ל30 שניות (כלומר, צעד לכידת התאים).
11. לזרום פתרונות הכביסה ותא הן באמצעות המכשיר בו זמנית עבור 10 שניות לפני צעד לכידת התאים כדי להבטיח זרימה בלא הפרעה במהלך שלב מיתוג הפתרון. הערה: שיתוף זרימת צעד קצר זה יש לחזור בכל שלב מיתוג פתרון.
12. הפעל את יציאת הכביסה ולשטוף את המכשיר ל20 שניות כדי להסיר שאינם לכודים תאים מזהמים.
13. הזרק התמיסה המכילה את המולקולה הראשונה של ריבית (0.2 מ"ג / מ"ל ​​של 3,000 מולקולות דה dextran הניטרלי ואניוני או 1.5 מ"ג / מ"ל ​​של 70,000 מולקולת dextran הניטרלי Da) לתוך המכשיר.
14. החל חמישה פולסים קצרים (Δt = 30 אלפיות שניים עם 2 מרווחי שניות) מייד לאחר ההזרקה שלפתרון ומולקולרי לפקח על הגודל ומשך הזמן של פולסים החשמליים המיושמים בזמן אמת באמצעות אוסצילוסקופ.
15. שיימסר חזור על שלב 3.10 כמה פעמים שמספר מולקולות נוספות. עבור כל משלוח מולקולרי, תאי דגירה ל100 של בפתרון המולקולרי אז לשטוף את המכשיר עם פתרון הכביסה ל100 של להסיר מולקולות עודפות.
16. שחרר את התאים בצלחת 96 היטב לניתוח במורד הזרם על ידי הורדת לחץ ההפעלה מתחת ל -5 psi. הערה: כ 100 μl של פתרון עם 100 תאים שנאספו מכל מהדורה.
17. הפעל את הניסוי על השלבים 3.9 דרך 3.16 שלוש פעמים כדי לאסוף מספיק תאים לcytometry זרימה.
18. צנטריפוגה 96 גם הצלחת המכילה תאי מעובד במשך 5 דקות ב228 × גרם.
19. הסר את supernatant המכיל מולקולות ניאון עודפות.
20. Resuspend תאים בDPBS לניתוח cytometry זרימה.
21. תאי עומס בזרימה cytometer עבור U המולקולריptake ניתוח יעילות.

תוצאות

Electroporator microfluidic המקביל פיתח נמסר מקרומולקולות עם גדלים מגוונים ומטענים חשמליים לתוך תאי חיים סרטן השד גרורתי. משלוח מולקולרי מוצלח נקבע איכותי על ידי מעקב אחר שינויים בעוצמת ניאון של electroporated תאים המקיפים באתר ואושר על ידי מדידות כמותיות באמצעות ניתוח cytometry זרימ...

Discussion

עם הפלטפורמה החדשה parallelized electroporation, השיפור של פי 10 בתפוקה ויעילות של משלוח מרובה מולקולה הושגה, בנוסף לכל היתרונות שהמערכת אחת קאמרית שפותחה בעבר מספקת. ¹⁸ יתרונות זמינים בעבר כוללים (i) לפני טיהור יעד תאים עם התפלגות אחידה גודל לשיפור כדאיות, (ii) שליטת מינון מולקו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MDA-MB-231 cancer cell line	American Type Culture Collection (ATCC)	HTB-26
Leibovitz’s L-15 Medium	Cellgro, Mediatech, Inc.	10-045-CV
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco, Life Technologies	16000-044
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)	Cellgro, Mediatech, Inc.	21-030
Trypsin	Gibco, Life Technologies	25200-056
Flow Cytometer easyCyte HT	Millipore	0500-4008
Oxygen Plasma Cleaner	Technics Micro-RIE
Dektak 6M surface profiler	Veeco
KMPR 1050	Microchem
SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT	Dow Corning
Compressed Nitrogen gas	Airgas	NI 300
High Pressure Regulator	McMaster-Carr	6162K22
Downstream regulator	McMaster-Carr	4000K563
High-speed 3/2way-8 valve manifold	Festo
Inline Check Valve	Idex Health and Science	CV3320
5/32" OD x 3/32" ID Polyurethan tubes	Pneumadyne	PU-156F-0
1/4" OD X 0.17" ID Polyurethan tubes	Pneumadyne	PU-250PB-4
1/16" PEEK tubings	Festo	P1533
1/32" PEEK tubings	Idex Health and Science	P1569
PEEK tubing unions	Idex Health and Science	P881
Pulse Generator	HP	8110A
Aluminum Wire	Bob Martin Company	6061 ALUM
Oscilloscope	Agilent	DSO3062A
50 ml centrifuge tubes	VWR	21008-178
15 ml centrifuge tube	VWR	21008-216
T75 culture flask	VWR	82050-862
Dextran, Tetramethylrhodamine, 3,000 MW, Anionic	Gibco, Life Technologies	D3307
Dextran, Tetramethylrhodamine, 70,000 MW, Neutral	Gibco, Life Technologies	D1819
Dextran, Texas Red, 3,000 MW, Neutral	Gibco, Life Technologies	D3329