RNA Catalyst ככתב להקרנת סמים נגד RNA עריכה בtrypanosomes

Summary

A highly sensitive ribozyme-based assay, applicable to high-throughput screening of chemicals targeting the unique process of RNA editing in trypanosomatid pathogens, is described in this paper. Inhibitors can be used as tools for hypothesis-driven analysis of the RNA editing process and ultimately as therapeutics.

Abstract

התקדמות משמעותית נעשתה בקביעת המנגנון של עריכת רנ"א המיטוכונדריה בtrypanosomes. בדומה לכך, התקדמות ניכרת נעשתה בזיהוי הרכיבים של מתחם editosome כי לזרז עריכת רנ"א. עם זאת, זה עדיין לא ברור כיצד חלבונים אלו לעבוד יחד. תרכובות כימיות המתקבלות ממסך תפוקה גבוהה נגד editosome עלולות לחסום או להשפיע שלב אחד או יותר במחזור העריכה. לכן, זיהוי של תרכובות כימיות חדשות יפיק בדיקות מולקולריות רבות ערך עבור לנתח את פונקצית editosome והרכבה. במחקרים קודמים, במבחני חוץ גופית עריכה בוצעו באמצעות RNA שכותרתו רדיו. מבחני אלה הם זמן רב, לא יעיל ואינם מתאים למטרות תפוקה גבוהה. כאן, המבוסס על הקרינה הומוגני "לערבב ולמדוד" פטיש ribozyme במבחנה assay כתב לפקח על עריכת רנ"א, מוצג. רק כתוצאה של עריכת RNA שלribozyme פטיש מצע oligoribonucleotide תהודה העברת אנרגיית הקרינה (סריג) עובר מחשוף. זה בתורו גורם להפרדה של fluorophore מהמרווה ובכך לייצר אות. לעומת זאת, כאשר פונקצית editosome היא עצורה, אות הקרינה תהיה הרווה. זה assay רגיש והפשוט ביותר שצריכה להיות באופן כללי החלים על לפקח בעריכת RNA חוץ גופית או הקרנת תפוקה גבוהה של כימיקלים שיכולים לעכב את פונקצית editosome.

Introduction

תהליך עריכת רנ"א, שינוי mRNA לאחר תעתיק, התגלה לראשונה בtrypanosomatids ^1. מאז, עבודה משמעותית כבר נערכה בלומדת את המנגנון עומד מאחורי עריכת רנ"א בTrypanosoma brucei ^2,3. בסדרה של תגובות אנזימטיות, editosome, מורכב ליבה של כ 20 חלבונים, יוצר mRNAs המיטוכונדריה הבוגר לרכיבים מרובים של מערכת זרחון חמצוני להפקת אנרגיה. סדר אירועי קטליטי הוא מחשוף endonucleolytic, uridylate בנוסף (U) או מחיקה, וקשירה, כפי שהוכתב על ידי RNAs מדריך (gRNAs) ^4.

בנוסף לחלבוני editosome המורכבים הליבה, מספר גורמי אבזר יש גם זוהה ^5-7. חלבונים אלה נראים בעיקר מקובצים במתחמים עצמאיים. עם זאת, את סדר ההרכבה חלבון במתחם editosome הליבה ודפוסי האינטראקציה של מתחם הליבה עם האבזרמתחמים הם עדיין לא נקבעו. מיקוד תהליך עריכת רנ"א בtrypanosomatids עשויה לספק dissectors הכימי המסייעים בלימוד ההרכבה והתפקוד של מתחם editosome. יתר על כן, מחקרים תפקודיים בכמה חלבוני editosome הראו חיוניות פני שלבי חיים שונים, המצביע על הפוטנציאל שלהם כתרופת מטרות ^8-12. לכן, מעכבים מצאו של editosome יכולים גם לפעול כתרכובות עופרת נגד trypanosomatids. זה זמן, כמו תרופות הקיימות כיום נגד מחלות הנגרמות על ידי trypanosomatid הן רעילות, לא יעילות ויקרות ^13,14.

Assay יעיל ונוח במבחנה יש צורך לחקור את היקום הכימי למעכבים ספציפיים שחוסמים עריכת רנ"א. שלושה מבחני פותחו ומשמשים לניטור פעילות editosome: (א) עגול מלאה בassay עריכת רנ"א המבחנה ^15, (ב) לפני שהבקיע בassay עריכת רנ"א המבחנה ^16,17,nd (ג) ribozyme פטיש (HHR) מבוסס assay ^18. שני מבחני הראשונים מסתמכים על הדמיה ישירה של המוצר בעריכה (ATPase 6 mRNA) עם העזרה של קרינה רדיואקטיבית. Assay מבוסס HHR משתמש בגרסה שונה של mRNA ATPase 6 שהוא מודל להתנהג כribozyme על עריכה. Ribozyme הפונקציונלי אז דווקא דבק מצע RNA רדיואקטיבי, המשרת ככתב. לאחרונה, Moshiri et al. פיתח 'לערבב ולמדוד "מבוסס HHR בassay כתב מבחנה כדי לפקח על עריכת RNA שבו מצע RNA רדיואקטיבי מוחלף בהעברת תהודה הקרינה אנרגיה (סריג) מצע ^19. יתרונות העיקרון של assay זה הם: (א) זה הוא שילוב מהיר ונוח וסוג המידה של assay, כמו הייצור של ribozyme הפעיל ומחשוף מצע מתרחש בו זמנית באותו הצינור בנפח נמוך (כלומר 20 μl), (ב רגישות) זה ימנע את השימוש בחומרים שכותרתו רדיואקטיבית, (ג) שהואfforded ידי מכשור הקרינה בפורמט צלחת מייקר כייל, ואות גבוהה יחס רעש (ד). שימוש assay זה, ההשפעה של מעכבים ידועים RNA עריכת האנזים נגד editosome מטוהר אושרה ^19. ניסוי זה תוקף את assay לזיהוי מהיר של מעכבי עריכת רנ"א, בעיקר נגד editosomes השלם מט brucei.

איור 1 הוא סכמטי צעד אחר צעד מפורט של בassay עריכת רנ"א מבחנה הקרינה מבוסס. פרוטוקול זה יכול לשמש לניטור עריכת RNA במבחנה או בקלות להיות מותאם להקרנת ספריות מתחם של קני מידה שונות.

Protocol

הפרוטוקול שלהלן מתאר את ההליך לביצוע assay עריכת RNA המבוסס על הקרינה. Assay יכול להתבצע בצינור PCR יחיד, 96 היטב, או צלחות תלוי בהיקף של הניסוי 384 גם. בהמשך לכך אות הקרינה ניתן לקרוא במערכת איתור PCR בזמן אמת מתאימה. Assay כאן מתואר בהקשר של צלחות 384 גם.

1. Culturing ט תאי brucei

1. הכן את מדיום גידול לט brucei procyclic תאי טופס. עבור 1 ליטר של מדיום:
   1. לפזר אבקת SDM-79 25.4 גרם במי 800 מיליליטר miliQ.
   2. הוסף 2 גרם של NaHCO ₃ וה-pH ל 7.3 עם 10 M NaOH.
   3. מוסיף מים nanopure לנפח סופי של 900 מיליליטר, לסנן לעקר.
   4. להוסיף סרום שור עוברי (FBS), פתרון וhemin (2.5 מ"ג / מיליליטר) פניצילין, סטרפטומיצין לריכוזים סופיים של 10% (V / V), 100 U / ml ו7.5 מ"ג / ליטר בהתאמה.
2. לגדול 300 מיליליטר של ט סוג 1.7A brucei פראי (טופס procyclic) תאים ב28 ° C, רועד בסל"ד 70 לצפיפות של 1.5 x 10 ⁷ תאים / מיליליטר. הערה: זה אמור לייצר 3 מיליליטר של editosome הפעיל עם ~ 0.5 מ"ג של חלבון סך הכל, מספיק ל600 תגובות עריכה.
3. קציר התאים על ידי צנטריפוגה ב6,000 XG 10 דקות ב 4 ° C.
4. שטוף את הכדור עם 50 מיליליטר של חיץ PBSG המקורר (10 מ"מ Na ₂ HPO _4, 10 מ"מ אא ₂ PO _4, 145 mM NaCl, ו6 גלוקוז מ"מ), וספין למטה התאים שוב על ידי צנטריפוגה ב 10,000 XG 10 דקות ב 4 ° C.

2. בידוד של גולמי המיטוכונדריה

הערה: יש לבצע את כל הצעדים על קרח או על 4 מעלות צלזיוס לשמר editosome פעילות.

1. Resuspend התאים שנקטפו ב30 מיליליטר של חיץ DTE (1 מ"מ טריס-HCl pH 8.0 ו1 mM EDTA). השתמש homogenizer 40 מיליליטר סטרילי Dounce (טרום צונן) לשבש את קרום התא על ידי מלטף את מעלה ומטה לפחות 10 פעמים על קרח.
2. מייד להוסיף סוכרוז 4.3 מיליליטר של 60% (w / v, כלומר 1.75 ז) לhomogenate לריכוז סופי של 0.25 מ צנטריפוגה ב XG 15,800 עבור 10 דקות ב 4 ° C, כדי להפיל מעדיף מיטוכונדריה.
3. Resuspend את כדור המיטוכונדריה ב4.6 מיליליטר של חיץ STM (20 מ"מ טריס-HCl pH 8.0, 250 סוכרוז מ"מ ו 2 מ"מ MgCl _2). הוספת 13.8 μl של 0.1 M CaCl ₂ ו -4 μl של DNase RNase ללא לריכוזים סופיים של 0.3 מ"מ ו -9 U / ml, בהתאמה. דגירה את התערובת במשך שעה 1 על קרח.
4. הוספת 4.6 מיליליטר של חיץ STE (20 מ"מ טריס-HCl pH 8.0, סוכרוז 250 מ"מ ו2 mM EDTA) כדי להשבית DNase I. צנטריפוגה ב XG 15,800 עבור 10 דקות ב 4 ° C.
5. Resuspend את הכדור ב400 μl של חיץ תמוגה (10 מ"מ טריס-HCl pH 7.2, 10 מ"מ MgCl _2, 100 מ"מ KCl, 1 מיקרוגרם / מיליליטר pepstatin, 1 מ"מ DTT, ומעכבי פרוטאז 1x שלמים ללא EDTA) והעברה ל צינור microfuge.
6. הוסף 10% טריטון X-100 לריכוז סופי של 1% nd דגירה lysate ל15 דקות ב 4 ° C על הכתף צינור.
7. נקה את lysate המיטוכונדריה על ידי צנטריפוגה פעמיים ב17,000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C; שמירה על supernatant פינה בכל פעם.

3. Editosome טיהור

1. יוצקים 10 מיליליטר 10% -30% (v / v) גליצרול שיפוע ליניארי (טבלה 1) בצינור ultracentrifuge באמצעות חיץ שיפוע 2x hhe (40 HEPES מ"מ pH 7.9, 20 מ"מ Mg (OAC) _2, 100 מ"מ KCl, ו 2 mM EDTA) ומכונת שיפוע על ידי ביצוע הוראות במדריך.
2. מוציא בזהירות 500 μl של פתרון מהחלק העליון של שיפוע גליצרול ועדינות לטעון 500 μl של lysate המיטוכונדריה פינה. ספין על 178,000 XG במשך 6 שעות על 4 מעלות צלזיוס באמצעות ultracentrifuge.
3. לאסוף 500 שברים μl ברצף מהחלק העליון לחלק התחתון של השיפוע ב 4 ° C. לאחר מכן הצמדתי להקפיא את השברים באמצעות חנקן נוזל חנות ב -80 ° C עד שימוש.

s = "jove_title"> 4. RNA הכנה

1. לחשל את תבנית ה-DNA המתאימה המכילה רצף משלים רצף אמרגן T7 (טבלה 2) עם oligonucleotide אמרגן T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ") ביחס טוחנת 1:01 על ידי חימום ב90 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות וקירור ב RT לפחות 10 דקות.
2. לתמלל RNA באמצעות ערכת שעתוק במבחנה על ידי ביצוע הוראות במדריך.
3. עצור את תגובת השעתוק על ידי הוספת נפח שווה של 7 M צבע אוריאה (שתנן 7 M, 0.05% Cynol קסילן, ו0.05% bromophenol כחולים). לרוץ על מסנן מעוקר 9% denaturing ג'ל polyacrylamide (acrylamide 9%, 7 M אוריאה, 1x TBE).
4. השתמש בהצללת אולטרה סגול (UV) עם מנורת UV בגלים קצרים כדי לאתר וRNA בהתאמה בלו. מניחים את חתיכת ג'ל נכרתה בצינור microfuge ולהוסיף 400 μl של חיץ elution ג'ל (20 מ"מ טריס-HCl pH 7.5, 250 מ"מ NaOAc, 1 mM EDTA ו0.25% SDS). Elute הלילה בשעה RT על הכתף צינור.
5. Precipitate RNA eluted על ידי הוספת 1 מיליליטר של אתנול 100% קרים ודוגר גם ב-80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות או -20 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
6. צנטריפוגה ב XG 16,000 ל30 דקות ב 4 ° C, כדי גלולה למטה RNA.
7. שטוף את הכדור עם 1 מיליליטר של 75% אתנול. צנטריפוגה ב XG 16,000 עבור 20 דקות ב 4 ° C.
8. Resuspend את כדור RNA כראוי במי RNase ללא כדי להשיג את הריכוזים הרצויים, כפי שמוצג בטבלה 2.

5. Assay RNA עריכת הקרינה מבוססת

1. לתגובה אחת, לשלב pmol 1 (μl 1) של preA6Rbz ו2.5 pmol (μl 1) של gA6Rbz (יחס טוחנת 1:2.5) בצינור microfuge, לדגור על 70 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ולתת לו לשבת על RT במשך שעה לפחות 10 דקות.
2. בינתיים מכין תערובת הורים באמצעות טבלה 3, ללא preA6Rbz וgA6Rbz, לתגובת העריכה המכילה חיץ 1x hhe (25 HEPES מ"מ pH 7.9, 10 מ"מ Mg (OAC) _2, 50 מ"מ KCl ו10 mM EDTA), 1 מ"מה-ATP, 5 מ"מ CaCl _2, 16 ng / μl של RNA Torula שמרים, 0.1% טריטון X-100, וeditosome המטוהרים.
3. הוספת preA6Rbz annealed וgA6Rbz כדי להשלים את מיקס מאסטר.
4. לוותר 18 μl של מיקס מאסטר (לוח 3) לתוך בארות המכילות גם 2 μl מים RNase חינם (בארות ללא תרכובות) או 2 μl של 200 תרכובות כימיות מיקרומטר וכולל דגימות שליטה בצלחת על פי איור 5.
5. חותם את הצלחת עם אוטם צלחת ומסובב את הצלחת, כדי להסיר כל בועות אוויר. לדגור על C ° 28 במשך 4 שעות.
6. הוסף 25 pmol (2 μl) של המתחרה gA6Rbz היטב כל אחד. הנח אוטם טרי, לסובב את הצלחת ומניח אותו על מכונה ה-PCR בזמן אמת. לתכנת את הניסוי הבא:
   שלב 1: 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; שלב 2: 24 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות; שלב 3: להפסיק.
7. הוסף 15 pmol (μl 1) של מצע סריג היטב כל אחד לנפח סופי של μl 23. חותם את הצלחת עם אוטם טרי.מהירות לסובב את הצלחת ומניח אותה בחזרה במכונה ה-PCR בזמן אמת.
8. תכנית ניסוי חדש בשלבים הבאים:
   שלב 1: 37 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות; שלב 2: קראו; שלב 3: עבור לשלב 1, 40 פעמים; שלב 4: להפסיק.
9. התקנת הצלחת על ידי בחירת כל הבארות הדורשות קריאה ולבחור את מסנן FAM. קלט נפח כמו 23 μl ולהתחיל לרוץ.
10. לחשב את השיפוע של הערכים המתקבלים מכל טוב / מדגם להשיג מדידה קינטית על ידי התוויית המדרונות על גרף עמודות לצורך הניתוח. הערה: קריאה הקינטית משפרת את יחס אות לרעש בין המדגם והרקע; כמדגם הרקע יהיה מדרון קרוב לאפס. יש קריאת נקודת סיום רעש רקע גבוה יותר.

תוצאות

כדי להדגים הנדרשים להקמת מסך בקנה מידה גדולה בכל הצעדים הדרושים, איורים 2-5 הם ניסויי שליטת נציג הקשורים לאיכות של assay. אלה הם ניסויי שליטה חיוניים לassay עקבי על פני כמה ימים של הקרנה או להשוואה בין מסכים שונה.

הערכת יחס ...

Discussion

שיטת הקרנת תפוקה גבוהה רומן לזהות מעכבים נגד מורכב עריכת RNA של trypanosomes הוצגה, מתן כלי חדש לגילוי תרופות נגד מחלות הנגרמות על ידי trypanosomatids. assay ribozyme מבוסס סריג כבר נעשה שימוש נרחב למטרות שונות ^20-22; עם זאת, יש לנו מנוצלים הקיבולת של assay ribozyme מבוסס סריג לניטור במבחנה<...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SDM-79 Medium	Gibco by Life Technologies
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	12483-020	heat inactivation at 55 °C for 1 hr
Hemin, minimum 80%	Sigma	H5533-10G
Penicillin-Streptomycin Sollution	Fisher Scientific	MT-30-002-CI
Dnase 1 recombinant, Rnase Free	Roche	4716728001
T7 RiboMax Express Large  scale RNA  production system	Promega	P1320
Kimble Kontes Dounce Tissue Grinders	Fisher Scientific	K885300-0040
Gradient Master, ver 5.25	Biocomp	107-201M
Ultra Clear Tube, 13.2 ml	Beckman Coulter	344059
Optima L-100XP  Ultracentrifuge	Beckman Coulter	392052
SW 41 Ti ROTOR	Beckman Coulter	331336
MicroSeal 'B' Seal, Seals	Biorad	MSB1001
CFX 384 Touch Real-Time PCR Detection System	Biorad	185-5484
Acryl/Bis solution (19:1), 40% (w/v)	Bio Basic	A0006-500ML
Urea, Molecular biology grade, 1 kg	Life Technologies	AM9902