ייצוב Hepatocellular הפנוטיפ באמצעות משטחים סינטטיים אופטימליים

Summary

מאמר זה יתמקד בפיתוח משטחים מצופים פולימר לטווח ארוך, תרבות היציבה של תאי גזע המופקת hepatocytes האנושי.

Abstract

Currently, one of the major limitations in cell biology is maintaining differentiated cell phenotype. Biological matrices are commonly used for culturing and maintaining primary and pluripotent stem cell derived hepatocytes. While biological matrices are useful, they permit short term culture of hepatocytes, limiting their widespread application. We have attempted to overcome the limitations using a synthetic polymer coating. Polymers represent one of the broadest classes of biomaterials and possess a wide range of mechanical, physical and chemical properties, which can be fine-tuned for purpose. Importantly, such materials can be scaled to quality assured standards and display batch-to-batch consistency. This is essential if cells are to be expanded for high through-put screening in the pharmaceutical testing industry or for cellular based therapy. Polyurethanes (PUs) are one group of materials that have shown promise in cell culture. Our recent progress in optimizing a polyurethane coated surface, for long-term culture of human hepatocytes displaying stable phenotype, is presented and discussed.

Introduction

חומרים ביולוגיים היו בשימוש נרחב בתחזוקה וההתמיינות של תאי גזע pluripotent ^1. תוך שהוא מאפשר, מצעים ביולוגיים אלה לעתים קרובות מכילים מספר עצום של מרכיבים בלתי מוגדרים. Matrigel הוא מצע נפוץ לתרבית תאי גזע ובידול. לרוע המזל, ההרכב משתנה משפיע על תפקוד תא ופנוטיפ. למרות מגוון רחב של מטריצות חלופיות, מוגדרות יותר ביולוגיות היה בשימוש ^2-7, מן החי או מן מדרגיות עניים שלהם הופכת אותם למועמדים שאינם מתאימים לייצור תעשייתי. לכן זיהוי של חלופות סינתטיות, עם הרכב מוגדר וביצועים אמין, הן מטרות מרכזיות במחקר בתאי גזע.

בניסיון להתגבר על המגבלות של מצעי תרבית תאים לא מוגדרים, שיתופי פעולה בין תחומיים בין הכימיה והביולוגיה זיהו חומרים סינטטיים עם היכולת לתמוך בפנוטיפ תא. Synthמצעי etic הם ניתנים להרחבה, חסכוניים, ויכולים להיות מיוצרים לתוך מבנים מורכבים 3D, מחקה את סביבת in vivo. בשל מאפיינים אלה מצעים סינטטיים היו בשימוש נרחב כדי לתמוך ולהוביל בידול של סוגי תאים רבים ^8-10.

מבחני תפוקה מתקדמים וגבוהים הקלו סינון המהיר של חומרים סינטטיים, מספריות גדולות, ונמסרו חומרים חדשים בעלי תכונות גמישות עם יישומים רחבים במחקר ופיתוח ביו ^11-13. ניצול תפוקה גבוהה, טכנולוגית הקרנת מיקרו מערך פולימר, אנו במהירות זיהינו פוליאוריטן פשוט (PU134), מתאים לתחזוקה של תאים כבדים בתאי גזע אנושיים נגזרים. פולימר זה נמצא להיות עדיף על מצעים מן החי בנוגע לבידול hepatocyte ותפקוד ^14-16. לאחר מכן יש לנו אופטימיזציה תהליך תנאי ציפוי, הטופוגרפיה ועיקור כדי לגשת להשפעותעל ביצועי פולימרים בייצוב תפקוד הפטוציט ותוחלת חיים. יש לכך השלכות משמעותיות בכל קשור להבנת יסודות הביולוגיה הפטוציט לדוגמנות תא מבוססת ויישומי רפואה רגנרטיבית.

הטכנולוגיה שתוארה כאן מייצגת דוגמא לאופן שעל פני השטח של פולימר סינטטי יכול להיות מותאמים כדי לשמר את הפנוטיפ של תאים. אנו מאמינים כי שילוב של טכנולוגיה זו עם פרוטוקול בידול hepatocyte סרום ללא יעיל יש את הפוטנציאל לספק ייצור להרחבה של תאים כבדים לשימוש במודלים במבחנה ורפואת רגנרטיבית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

.1 סינתזה של PHNGAD (פולי [1,6-hexanodiol / neopentyl גליקול / די (אתילן גליקול) חומצת -alt-adipic] דיאול)

1 תכנית: סינתזה של PHNAGD ייצוג סכמטי של הסינתזה של PHNAGD.. PHNAGD הוכן על ידי התגובה של 1,6-Hexanodiol, גליקול דיאטילן, גליקול neoppentyl וחומצת adipic. PHNAGD, פולי [1,6-hexanodiol / neopentyl גליקול / די (אתילן גליקול) החומצה -alt-adipic] דיאול.

1. החל טיפול בחום למונומרים 1,6-hexanediol, di (אתילן גליקול) וגליקול neopentyl ב40 מעלות צלזיוס למשך 48 שעה בתנור ואקום כדי להסיר כל שאריות מים. לאפשר לקור עד לRT תחת ואקום.
2. הוספת 22 mmol של כל מונומר וחומצת adipic (55 mmol) לבקבוק תחתון עגול שני צוואר מצויד בבר עורר ומחובר למנגנון דיקן-סטארק.
3. מניחים את כל ההרכבה תחת ואקום ובעדינות לחמם את glassware בC ° 40 ל6 שעות, כדי להימנע מכל ספיגת לחות במהלך התוספת של החומר הכימי לתוך הבקבוק.
4. הוסף דרך מזרק, טיפה אחרת טיפה, 0.0055 mol של טיטניום הזרז (IV) butoxide.
5. מערבבים את תערובת התגובה ב180 ° C, תחת אווירת N ₂ ל24 שעות, ולאסוף שאריות מים במלכודת הדיקן-סטארק. אפשר למוצר להתקרר לRT.

.2 סינתזה של PU134

תכנית 2: סינתזה של PU134 ייצוג סכמטי של הסינתזה של פוליאוריטן 134. PU134 הוכנה על ידי התגובה של 1.0 equiv של PHNGAD עם 2.0 equiv של 4,4'-Methylenebis (isocyanate פניל), ואחריו התוספת של 1.0. equiv של מאריך שרשרת 1,4-butanediol.

1. מערבבים מקבילה של PHNGAD polyol אחד (Mn ~ 1,800 Da, 3.2 mmol) עם שני שווה של 4"4-Methylenebis (isocyanate פניל) (6.4 מילימול) בN נטול מים, N -Dimethylformamide (12 מ"ל).
2. מערבבים את תערובת התגובה על 70 מעלות צלזיוס, תחת אווירת N _2.
3. הוסף דרך מזרק, טיפה אחרת טיפת טיטניום הזרז butoxide (WT 0.8%) (IV).
4. אחרי שעה 1, להוסיף שווה ערך אחד מאריך שרשרת 1,4-butanediol (3.2 מילימול). להעלות את הטמפרטורה ב90 ° C ומערבבים ל24 שעות תחת אווירת N _2.
5. בעקבות התגובה, לאסוף פוליאוריטן על ידי משקעים על ידי הוספת אתר diethyl (הקסאן או מים יכולים לשמש גם) שחרר חכם לפתרון התגובה עד הממטרים מתרחש.
6. צנטריפוגה הפתרון ב5,300 XG למשך 5 דקות.
7. למזוג supernatant ולהתנגב ב40 מעלות צלזיוס בתנור ואקום עד מתאדה הממס.
   שים לב: על מנת להבטיח כי המוצר הסופי של התגובה יש את הפרמטרים הנכונים בנוגע לחלוקת המשקל המולקולרית, grou הפונקציונליps של הפולימר, וטמפרטורת ההיתוך והמעבר זכוכית, ניתן להשתמש בטכניקות אנליטיות שונות ושיטות, כגון כרומטוגרפיה חלחול ג'ל או ספקטרוסקופיה פיטר.

.3 הכנת פתרונות PU134

1. שוקל 200 מ"ג של PU134 לתוך בקבוק זכוכית.
2. לדלל PU134 לריכוז סופי של 2% במספר הממסים: כלורופורם, שילוב של כלורופורם וטולואן ב1: 1, tetrahydrofuran, ושילוב של tetrahydrofuran וdicloromethane ב1: 1.
   הערה: בחירתו של הממס הנכון משתנה בהתאם לפולימר לשימוש. ממסים שונים יש נקודות רתיחה שונות שיכול להשפיע על solubilization של הפולימר.
3. לנער את הפתרון נמרצות ל20 דקות ב RT באמצעות שייקר במהירות של 200 mot / דקה, עד שהפתרון הופך הומוגנית ולא משקע הוא ציין.

.4 ציפוי של זכוכית שקופיות עם PU134

1. הנח ROU15 מ"מ ² coverslip nd על coater הספין.
2. החל 50 μl של פתרון PU134 לכל באמצעות פיפטה. כוון את עוצמת הקול של פתרון PU134 בהתאם לגודל coverslip נדרש שמירה על הנפח על פני השטח יחסי יחס.
3. ספין כל coverslip ל7 שניות ב23 x גרם.
4. coverslip האוויר היבש ב RT לפחות 24 שעות לפני העיקור.

.5 הקרנה של Coverslip

1. Gamma-להקרין coverslip מצופה פולימר על ידי יישום מינון של 10 אפורים באמצעות irradiator מעבדה ל12 דקות.
2. UV- להקרין coverslip מצופה פולימר באמצעות 30 W, הנורה UV ל16 דקות מכל צד.
3. מקום coverslip מצופה הפולימר בצלחת תרבית הרקמה מתאימה בהתאם לגודל השקופית.

.6 מיקרוסקופית אלקטרונים סורק

1. coverslip זהב מעיל פולימר על ידי מקרטעות ל200 שניות באווירה של 5 x 10 ^-1 מיליבר של לחץ.
2. ללכוד את micrographs של coverslip מצופה הפולימר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק במתח מאיץ של 20 ק במצב שני אלקטרונים הדמיה.

.7 תצפיות מיקרוסקופית כוח האטומי

1. לסרוק שטח של 20 x 20 מיקרומטר של משטח הפולימר.
2. הגדר את קצב סריקה מ1.32 הרץ ל1.60 הרץ.
3. הגדר את רזולוציה של 512 x 512 פיקסלים באזור שנסרק.
4. לחשב את שורש ממוצע ריבוע (RMS או RQ) של הציפוי על ידי שימוש בממוצע של סטיות גובה נלקחו ממטוס נתוני תמונה הממוצע, הביע כ:
   
   איפה זי הוא ערך Z הנוכחי, וN הוא מספר הנקודות בתוך השטח נתון.
5. 7.5 חשב את הסטייה או מתכוון חספוס פני השטח (Ra) של התמונה באמצעות,
   
   כאשר Z (x) היא הפונקציה שמתארת ​​tהוא משטח הפרופיל מנותח במונחים של גובה (Z) ומיקום (x) של המדגם על פני אורך ההערכה "L". Ra מייצג את הערך הממוצע של פני השטח ביחס למישור המרכז.

.8 תרבות והתמיינות של תאים

1. תרבות ולבדל את שורת תאי גזע עוברית (hESC) H9 האנושי כפי שמתואר בHay ^17.
2. לנתק את התאים באמצעות מגיב ניתוק וreplate על גבי שקופיות מצופים PU134 ביום 9 של תהליך ההתמיינות, בנוכחותו של מדיום סרום ללא כלתאר בSzkolnicka ^18,19.
   הערה: השימוש בתא דיסוציאציה האנזימטית הוא מועדף לניתוק תא פיזי.

.9 ציטוכרום P450 Assay פונקציונלי

1. למדוד את פעילות CYP3A הבאה הוראות היצרן.
2. דגירה hepatocytes hESC נגזר ביום 13 או יום 19, ותקשורת ללא תאים - כביקורת שלילית, עם substr המתאיםאכלתי במשך 5 שעות על 37 מעלות צלזיוס.
3. לאסוף supernatants מהתאים ותקשורת, לבצע את assay לפי הוראות יצרן.
4. מדוד את רמת פעילות CYP והיחסי מנורמלים לשטח הפנים ⁽² סנטימטר).

10. Immunostaining

1. לשטוף hESC נגזר hepatocytes עם PBS, 1 דקות, חוזר שתי פעמים.
2. הוספת מתנול קרח קר 100% לתקן תאים, מקום ב-20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
3. שטוף תאים עם PBS במשך 5 דקות וחזור פעמיים.
4. דגירה תאים עם PBS / BSA / 10% עבור שעה 1 ב RT T (tween 0.1%).
5. לשאוב את פתרון PBST ולהוסיף הנוגדן הראשוני המתאים מדולל PBS / BSA / 1% T (tween 0.1%), דגירה על 4 מעלות צלזיוס עם O תסיסה עדין / N.
6. שטוף תאים עם PBS / BSA / 1% T (tween 0.1%) במשך 5 דקות ולחזור על שלוש פעמים.
7. לדלל את הנוגדן המתאים בPBS / BSA / 1% T (tween 0.1%), להוסיף לתאי דגירה בחושך בRT עבור שעה 1 עם תסיסה עדינה.
8. שטוף תאים עם PBS במשך 5 דקות ולחזור על שלוש פעמים.
9. הוספת Mowiol 488 (המכיל 1 DAPI: 1,000) זה טוב, להוסיף coverslip בעדינות כדי להפחית את מספר בועות אוויר. חנות קבועה תאים על 4 מעלות צלזיוס בחושך. שים לב מכתים באמצעות מיקרוסקופ עם מסנן מתאים ומנורת ניאון. הנוגדנים ראשוניים ומשניים המותאמים מופיעים בטבלה 1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

ממס פולימר משפיע על הטופוגרפיה של פני השטח מצופה פולימר

פוליאוריתן 134 היה solubilized בכלורופורם, לבד או בשילוב עם טולואן או tetrahydrofuran או dichloromethane ושקופיות זכוכית ספין מצופות בניסוחים השונים. במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) ומיק...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

רבים מהשיטות הנוכחיות משמשות ליצירת תאים כבדים מתאי גזע להסתמך על מטריצות מוגדרות מן החי. מצעים אלה יכולים להיות יקרים ומשתנים מאוד, המשפיעים על תפקוד תא ויציבות, המייצג חסם משמעותי ליישום. לכן, ביצענו מסך לחומרים סינטטיים התומכים בתרבות של תאים כבדים שמקורן בתאי גז?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Synthesis, preparation, coating and characterization of polymer PU134 coated coverslips
Shaker	Edmun Bühler	KS-15
Irradiator	CIS Biointernational	IBL 637
Spin coater	Specialty Coating System	P-6708
Scanning Electron Microscope	Philips	XL30CPSEM
Atomic Force Microscope	DimensionV Nanoscope, VEECO
p4-GLO CYP3A4	Promega	V8902
UV bulb	ESCO
NanoScope analysis software	VEECO		version 1.20
Fluorescence microscope	Olympus	TH45200	Use Volocity 4 Software
Tissue culture plates	Corning, UK	3527
glass slides	Scientific Laboratory Supplies	MIC3308
Diethylene glycol	Sigma–Aldrich	93171
1,6-hexanediol	Sigma–Aldrich	240117
Neopentyl glycol	Sigma–Aldrich	408255
Adipic acid	Sigma–Aldrich	9582
anhydrous N,N-Dimethylformamide	Sigma–Aldrich	227056
Diethyl ether	Sigma–Aldrich	676845
titanium (IV) butoxide	Sigma–Aldrich	244112
1,4-butanediol	Sigma–Aldrich	493732
Vacuum oven	Thermoscientific
4,4’-Methylenebis(phenyl isocyanate)	Sigma–Aldrich	101688
Tetrahydrofurane	Sigma–Aldrich	401757
Sputter coater	Bal-Tec SCD 050
Inmunostaining
Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2)	Gibco	10010031	Store at room temperature
PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20	Scientific Laboratory Supplies Ltd	EC607
Methanol	Scientific Laboratory Supplies Ltd	CHE5010
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich, UK	A7906
MOWIOL 488 DAPI	Calbiochem	475904	Made up in Tris HCl and glycerol as per manufacturers instructions
Cell culture and Functional assay
CYP3A activity pGLO kit	Promega	V8902
Hepatozyme	Gibco	17705021
TryLE express	Life Technologies	12604013