דימות פלואורסצנטי עם דיוק אחת ננומטר (FIONA)

Summary

יכול להיות מקומי fluorophores יחיד עם דיוק ננומטר באמצעות פיונה. הנה סיכום של טכניקת FIONA מדווח, וכיצד לבצע את ניסויי FIONA מתואר.

Abstract

דימות פלואורסצנטי עם דיוק אחד ננומטר (FIONA) היא טכניקה פשוטה אך שימושית לאיתור fluorophores היחיד עם דיוק ננומטר במישור XY. הנה סיכום של טכניקת פיונה דיווח ודוגמאות של מחקר שבוצעו באמצעות FIONA יתוארו בקצרה. ראשית, כיצד להגדיר את הציוד דרוש לשם ניסויי פיונה, כלומר, בסך הכל מיקרוסקופ פלואורסצנטי ההשתקפות הפנימי (TIRFM), עם פרטים על יישור אופטיקה, מתואר. אז איך לבצע את ניסוי FIONA פשוט על הלוקליזציה של מולקולות בודדות Cy3-DNA המשותק באמצעות פרוטוקולים מתאימים, ואחריו את השימוש בFIONA כדי למדוד את גודל צעד 36 ננומטר של מנוע Va יחיד שרירן הקטוע שכותרתו עם נקודה קוונטית, בא לידי ביטוי. לבסוף, המאמץ האחרון כדי להרחיב את היישום של פיונה לדגימות עבות מדווח. הוא הראה כי, באמצעות מטרת טבילה במים ונקודות קוונטיות ספוגות עמוקות בסול ג'ל וקרניות עיני ארנב (>200 מיקרומטר), דיוק לוקליזציה של 2-3 ננומטר יכול להיות מושגת.

Introduction

סביב 1882, ארנסט אבה מצא כי הרזולוציה של מיקרוסקופ אור הנראה היא ~ λ / 2nA, או ~ 200 ננומטר (שבו λ הוא אורך הגל וNA הוא הצמצם המספרי) ^1,2. לכן כל חפץ קטן יותר מממד זה יופיע כנקודה עקיפה מוגבלת במיקרוסקופ אופטי. עם זאת, ניתן לקבוע את המרכז של המקום, כלומר, המיקום של האובייקט, עם דיוק גבוה בהרבה ^3. דימות פלואורסצנטי עם דיוק אחד ננומטר (FIONA) היא טכניקה פשוטה אך שימושית לאיתור fluorophores היחיד עם דיוק ננומטר במישור XY ^4. הדיוק של לוקליזציה, _σ μ (כלומר, שגיאת התקן של הממוצע), תלויה במספר הכולל של פוטונים שנאספו, , כאשר N הוא מספר הפוטונים, ים היא סטיית התקן של נקודת הניאון, הואגודל פיקסל של גלאי ההדמיה, וb הוא סטיית התקן של הרקע ^3,4. לfluorophore פולט ~ 10,000 פוטונים, פיונה יכולה להשיג דיוק ננומטר ~ 1 ^4.

FIONA יכול לשמש כדי לקבוע את המיקום של פולט נייח, או אחד מרגש (בהנחה שתמונות ניתן לקחת מספיק מהר) באופן מדויק. יכול להיות מיושם FIONA ברצף למסגרות של הסרט ובכך לעקוב אחר התנועה של המולקולה בודדת ^{4 8.} ריאגנטים תמונה מגן עשויים להיות נחוצים כדי להבטיח כי המדגם אינו מתפרק באור. יתר על כן, עצם הניאון עצמו עשוי להיות בכל גודל, קטן יותר או גדול יותר מעקיפת limit- למשל, זה יכול להיות מורכב מאברון (~ 1 מיקרומטר) עם חלבוני ניאון רבים התפזרו על הממברנה שלו. באמצעות FIONA עדיין יכול להניב ממוצע מדויק מאוד (ננומטר) של המרכז של מסה הממוצע שלה. השיפור הגדול בדיוק לוקליזציה על ידי FIONA מאפשר פתרון nanomeתנועות ter בקנה מידה לאורך זמן. זה דחף את מיקרוסקופיה לתוך קנה המידה האורך המולקולרי ^{4 8.}

מאז המצאתה, וריאנטים של פיונה פותחו. לדוגמא, הדמיה בהירה שדה עם דיוק אחד ננומטר (bFIONA) ^9, גרסה קלה של פיונה, תמונות וlocalizes אובייקטים צפופים כגון melanosomes in vivo (אובייקטים כהים המכילים את פיגמנט המלנין) עם אור מועבר. בנוסף, פיונה כבר מועסק כדי לפתור צבעים מרובים. לדוגמא, הדמיה מולקולה בודדת ברזולוציה גבוהה עם photobleaching (שרימפס) ^10,11 או colocalization ברזולוציה גבוהה מולקולה בודדת (SHREC) ¹² פותחו כדי לפתור שני צבעים בתוך כ10 ננומטר. (שים לב שזה הוא ברזולוציה, כלומר כמה במדויק אחד לא יכול להגיד צבעים זהים זה מזה.) לאחרונה, ניתוח FIONA תרם לתהליך הלוקליזציה של מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר מסוימת, כגון RECO האופטי סטוכסטייםמיקרוסקופיה nstruction (STORM) ^{13- 15} ומיקרוסקופיה לוקליזציה המופעלת תמונה (PALM) ^16, שבי fluorophores הכהה הזמני שמחים, ולאחר מכן הקרינה היא מקומית. על ידי שוב ושוב מרגשת צפיפות נמוכה למדי של צבעים (מקום מוגבל עקיפה לפחות מאחד), ולאחר מכן לאסוף את הקרינה, ניתוח כל אחד מהם על ידי פיונה, אחד יכול לבנות את המפה ברזולוציה גבוהה. הרזולוציה אז מוגבלת רק במספר הפוטונים כל צבע מעביר החוצה, כמו גם דברים כמו שמירה נייחת המדגם (כולל, למשל, את הבמה מיקרוסקופ) במהלך הרכישה.

במאמר זה, סיכום של טכניקת פיונה ויתארו בקצרה דוגמאות של מחקר שבוצע באמצעות FIONA מדווח. ראשית, כיצד להגדיר את הציוד דרוש לשם ניסויי פיונה, כלומר, בסך הכל מיקרוסקופ פלואורסצנטי ההשתקפות הפנימי (TIRFM), עם פרטים על יישור אופטיקה, מתואר. אז איךלבצע ניסוי FIONA פשוט על הלוקליזציה של מולקולות בודדות Cy3-DNA המשותק באמצעות פרוטוקולים מתאימים, בא לידי ביטוי. אחרי זה, את השימוש בFIONA כדי למדוד את גודל צעד 36 ננומטר של מנוע Va יחיד שרירן הקטוע שכותרתו עם נקודה קוונטית מוצג. שרירן Va הוא חלבון מנוע התהליכית חיוני אשר נושא מטען סלולארי בזמן translocating לאורך סיביים אקטין. כאן שרירן Va לבנות קטום משמש כדי להסיר תחומים רלוונטיים לגודל הצעד, ועם תג דגל נוספו לC-הסופי כדי לאפשר הקלות של תיוג עם נקודות קוונטיות פונקציונליות עם נוגדני Anti-FLAG. ניסוי זה נעשה תחת ATP הנמוך להאט את שרירן ולאפשר את השימוש בזמני חשיפה ארוכים מספיק כדי לקבל ספירת פוטון טובה בכל מסגרת. כל תווית ניאון מספיק בהירה יכולה להיות תחליף בפרוטוקול הבא. לבסוף, המאמץ האחרון של הארכת היישום של פיונה לדגימות עבות מדווח. כעיקרון הוכחה של, נקודות קוונטיות היו ספוגותבסול ג'ל וקרניות עיני ארנב ולאחר מכן צילם ומקומי באמצעות פיונה. להדמיה, מטרת טבילת 60X מים עם NA = 1.2 שימשו כי יעד זה יש מרחק כבר לא עובד יותר אובייקטיבי טבילת שמן ששימש בעבר 100X. כדי לפצות על האובדן בהגדלה במטרה, עדשה נוספת להגדלה החזקה (3.3X או 4.0x) הוכנסה בנתיב הפליטה. בנוסף, עלית הקרינה (לא TIR) מיקרוסקופיה צריכה לשמש כדי לגשת אזורים עמוקים בדגימות העבות. הוא הראה כי נקודות קוונטיות ספוגות עמוק בסול ג'ל ובקרניות עיני ארנב (Z> 200 מיקרומטר) יכול להיות מקומיות עם 2-3 דיוק ננומטר.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הצהרת אתיקה: רקמת הקרנית מארנבים נאספה בהתאם לאוניברסיטת אילינוי המוסדית טיפול בבעלי חיים והנחיות שימוש.

התקנת .1 TIRFM

הערה: תלבש משקפי בלייזר בטיחות כל הזמן.

1. ודא שכל הרכיבים האופטיים הדרושים מופיעים ברשימה של חומרים זמינים ומוכנים ליישור. במידת הצורך, להשתמש בתחליפים עם פונקציות מקבילות מחברות אחרות. ודא שמראות ועדשות צריכים ציפוי אנטי רפלקטיבי (AR) הלייזר בשימוש תואם.
2. הגדר את הגבהים של כל הרכיבים האופטיים לגובה של מרכז מיקרוסקופ בחזרה הנמל.
3. הר הלייזר, תריס הלייזר ומסנן ND (ים). השתמש במסנני ND כדי להחליש את כוח הלייזר למטה נמוך ככל האפשר, תוך שמירה על הקרן גלויה. להדק ברגים עם מפתחות משושה מתאימים.
4. לתכנן נתיב קרן ולסמן אותו עם קלטת או סמן על השולחן האופטי (dotקווי טד כחולים באיור 1). לשם פשטות, לשמור על נתיבים ישר לאורך שורות של חורים על השולחן האופטי.
5. מראה מקום M1 (איור 1) בתורו הזווית הנכון הראשון. מניחים שני אירוסים בקטע השני ברציפות של נתיב הקרן המתוכננת. התאם הן את המיקום ואת ההטיה של M1 כך שהליזר עובר דרך האירוסים.
6. מראה מקום M2 (איור 1) בתורו הזווית הישר השני. הנח את ההרחבה 10X קורה (L1 & L2, איור 1) בקטע השלישי ברציפות של הנתיב. התאם ההטיה שלה כך שהרחבת הקרן מקבילה לשניהם את השולחן האופטי ונתיב הקרן המתוכננת.
   1. התאם M1 ו M2 איטרטיבי כך שהליזר הולך צורה ישרה דרך המרכזים של שני העדשות של ההרחבה הקרן. חזור על פעולה זו עד לפרופיל הקרן של הקרן התרחבה הוא שאינם קטוע גאוס.
7. התאם M1 כדי למרכז את הקרן על L1 (Fiתרשים 1) וM2 כדי למרכז את הקרן על L2 (איור 1) איטרטיבי. פרופיל קרן רע בדרך כלל אומר הלייזר נחתך; להשתמש בפיסת נייר לבן כדי לחסום את הקרן לאחר ההרחבה הקרן לבדוק את פרופיל הקרן בעיניים. לניתוח דיוק גבוה, להשתמש מאבחן קרן אופטי.
8. התאם את המרחק בין L1 ו L2 כך שהקרן היא collimated. חזור על שלב 1.8 ו1.9 במידת צורך.
   הערה: כאשר גודל הקרן אינו משתנה עם מרחק, האלומה היא collimated מספיק להתקנת TIRFM. כדי לשפר את collimation הקרן נוספת, יכולים לשמש כלים כגון interferometer גז. גודל קרן טיפוסי לאחר ההרחבה הוא ~ 20 מ"מ.
9. תריס הלייזר. להתיר את מטרת מיקרוסקופ ולדפוק ביעד יישור ניאון. מקום משקף M3 ו M4 (איור 1) לכוון את האלומה המורחבת ליציאת מיקרוסקופ ועל מראה dichroic בתוך הצריח. ודא שקרן הלייזר מוחזרת tהוא dichroic ולכיוון התקרה.
10. התאם M3 כדי למרכז את החלק הבהיר ביותר של הקרן ביעד הניאון, וM4 כדי להתאים את ההטיה הקורה כדי להיות אנכי.
11. תריס הלייזר ולדפוק את מטרתו בחזרה. אם היישור בשלב הקודם נעשה גם שם צריך להיות מקום סימטרי יציאה האובייקטיבית. לכוונן את מטה של ​​M3 ו M4 כדי לייעל את כוח הלייזר ופרופיל קרן מתוך המטרה.
12. הר המצלמה EMCCD למיקרוסקופ ולחבר את המצלמה למחשב. הפעל את התוכנה למצלמה.
13. הר מדגם ניאון (פתרון של fluorophores) במיקרוסקופ. תסתכל על נקודת הניאון הבוהקת על המצלמה. בדוק שהמקום אינו עובר על המסך כמוקד משתנה.
14. מניחים את עדשת TIR (L3, איור 1) בשלב תרגום XYZ במרחק ממישור המוקד האחורי של המטרה שהוא שווה לאורך המוקד של L3 (~ 30 סנטימטר). להתאים את המיקום של L3כך שהליזר עובר דרך מרכז העדשה.
15. תרגום L3 לאורך נתיב הקרן להתאים את collimation הקורה. ודא כי הקרן עדיין מרוכזת בצג וסימטרי בצורה.
    הערה: שטח התאורה בעליות מטוס מדגם עם ירידת אורך מוקד עדשת TIR. באופן כללי, להשתמש באורך המוקד הקטן ביותר שיכול להתאים בהגדרה.
16. תרגום L3 בניצב לנתיב הקרן כדי להטות את הקרן מתוך המטרה. שמור תרגום עדשת TIR כך שTIR מושגת. שים לב לדוגמא של חרוזי ניאון דרך המצלמה EMCCD, וL3 לכוונן כדי לקבל יחס אות לרעש טוב.

איור 1 תצורה אופטית למיקרוסקופיה הכוללת הקרינה ההשתקפות הפנימית (TIRFM).

.2 FIONA על Cy3-DNA

1. Cשקופיות רזה מיקרוסקופ וcoverslips: לשטוף שקופיות מיקרוסקופ וcoverslips עם DDH ₂ O וisopropanol ולייבש אותם עם גז חנקן; במקום השקופיות וcoverslips בשואב הפלזמה למשך 5 דקות תחת פלזמה ארגון.
2. לבנות תאי מדגם (כפי ששורטט באיור 2).
   1. הנח רקמה על הספסל ואז לשים פיסת נייר עדשה על גבי הרקמה. מניחים את השקף על נייר העדשה. ודא שהצד הנקי של השקופית הוא כלפי מעלה.
   2. החל שתי רצועות של נייר דו צדדי לשקופית לאורך הקצוות הארוכים, עוזב פער של 3-5 מ"מ במרכז. מקום coverslip ניקה על גבי השקופית. ודא שהצד הנקי של coverslip פונה השקופיות.
   3. השתמש בקצה פיפטה ללחץ כלפי מטה על הקלטת דו צדדית. השתמש בסכין גילוח כדי להסיר קלטת עודפת מהשקופיות, כך שהקלטת נשארה רק תחת coverslip.
      הערה: הקצוות הפתוחים של החדר נשארים פתוחים ומשמשים ככניסה והחוצהבואו. תא הנפח הוא כמה מיקרוליטר.

איור 2 סקיצה של מדגם קאמרי טיפוסי () יכול לצפות בלמעלה.; מבט צד מהימין (ב); תצוגה (ג) צד מהחזית.

3. לשתק Cy3-DNA על משטחים פנימיים של תאי המדגם.
   1. הכן T-50 חיץ (pH 10 מ"מ טריס-HCl 8.0, 50 mM NaCl). הכן BSA ביוטין בT-50 בריכוז סופי של 1 מ"ג / מ"ל. הכן חיץ T50-BSA על ידי המסת BSA בT-50 בריכוז סופי של 10 מ"ג / מ"ל.
   2. הכן 0.5 מ"ג / מ"ל ​​neutravidin במאגר T50-BSA. הכן DNA Cy3 שכותרתו biotinylated (Cy3-DNA) בT50-BSA בריכוז סופי של 5-10 PM.
   3. פיפטה BSA ביוטין 10 μl (1 מ"ג / מ"ל) לתוך תא המדגם. מתן 5 דקות.
   4. שטוף את החדר עם T50-BSA 40 μl. neutravidin פיפטה 10 μl (0.5 מ"ג / מ"ל) לתוך תא המדגם. דגירה של 5 דקות.
   5. שטוף את החדר עם T50-BSA 40 μl. פיפטה 20 μl Cy3-DNA לתוך תא המדגם. דגירה במשך 5 דקות ולאחר מכן לשטוף את החדר עם T50-BSA 80 μl.
4. התמונה Cy3-DNA מולקולות בודדות תחת TIRFM.
   1. הכן חיץ הדמיה (100 μl) על ידי ערבוב μl 1 Protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD, 5 מיקרומטר), 4 μl חומצת Protocatechuic (PCA, 62.5 מ"מ), 50 μl 6-הידרוקסי-2,5,7,8- tetramethylchromane-2-קרבוקסיליות חומצה (Trolox, 2 מ"מ בT-50), ו45 μl T50-BSA.
   2. פיפטה במאגר ההדמיה 30 μl ולחכות ל8-10 דקות.
   3. הר מדגם הדמיה על TIRFM המצויד בליזר ירוק (ננומטר 532), מטרת 100X טבילת שמן (1.45 NA), ומצלמת EMCCD.
   4. קבע את זמן חשיפה ל100 עד 500 אלפית שניים ורווח EM ל25 ל100. לרכוש סרט של המדגם עבור 1,000 מסגרות.
5. לבצע ניתוח נתונים FIONA על התמונות שתועדו של Cy3-DNA.
   1. לקבוע את גודל פיקסל האפקטיבי (כלומר, גורם המרה מפיקסלים לננומטרים) על ידי חלוקת גודל פיקסל הפיזי (לקרוא מדף המפרט של המצלמה EMCCD) על ידי הגדלת סך הכל (הגדלה של המטרה מיקרוסקופ מוכפלת בכל בהגדלה נוספת).
   2. לקבוע את גורם ההמרה מעוצמות פיקסל לפוטון מספרים על ידי חלוקת רגישות CCD רווח (כלומר, אלקטרונים לספירה / D, לקרוא מדף המפרט של מצלמת CCD) על ידי מכפיל האלקטרונים (EM) משמש במהלך רכישת תמונה.
   3. לקמפל ולהריץ FIONA.pro לניתוח פיונה. השתמש בתכנית IDL זה כדי לייבא את התמונה שנרכשה, לקלט בגודל פיקסל האפקטיבי (מהשלב 2.5.1) ומקדם ההמרה מעוצמת למספר פוטונים (משלב 2.5.2), ולבחור במקומות לניתוח פיונה.
      הערה: בסופו של הדבר, prograפלט מ 'תוצאות הראויה עם פונקציות 2D גאוס, כמו גם כלל מספרי פוטון ודיוק לוקליזציה. תוצאה אופיינית מוצגת בסעיף של תוצאות ומספרים נציג 4c-4d.
   4. לקמפל ולהריץ phcount.pro לאפיין ספירת פוטון. השתמש בתכנית IDL זה כדי למדוד את המספר הממוצע של פוטונים הנפלטים על ידי fluorophore לפני photobleaching, כדי לייבא את התמונה שנרכשה וקלט גורם ההמרה מעוצמת למספר פוטונים (משלב 2.5.2).
      הערה: אז התכנית תאתר כתמי ניאון באופן אוטומטי (בחירה ידנית היא אופציה), לחשב ספירת פוטון כפונקציה של מספר מסגרת, ופלט העקבות של ספירת פוטון.
      1. מחק עקבות רעות ולציין טווחי מסגרת לאחר photobleaching לתיקון בסיס. בסוף, תוכנית פלט רשימה בסך הכל מספרי פוטון לכל הנקודות לא מבוטלות. לאחר מכן לתכנן את חלוקת מספרי הפוטון ולהתאים distribution עם דעיכה מעריכית כדי לקבל את מספר הפוטונים הממוצע. תוצאה אופיינית מוצגת בסעיף של תוצאות נציג ומספרים 4e-4F.

.3 FIONA יישומית לכמת מוטורי (למשל, שרירן בתקטין) הרמקול בננומטר Scale

1. פלמר אקטין (כלומר להכין F-אקטין) יום אחד לפני ניסוי פיונה.
   1. מחדש G-אקטין (מונומר) וביוטין G-אקטין (מונומר) ל10 מ"ג / מ"ל ​​עם חיץ אקטין כללי. מערבבים לוודא ששניהם מומסים באופן מלא, ולשמור על שניהם על קרח.
   2. מערבבים 10 μl G-אקטין (מונומר) עם ביוטין G-אקטין 1.7 μl בצינור 1.5 מ"ל microcentrifuge. הוסף 100 חיץ פילמור אקטין קר כקרח μl.
   3. השאר את תערובת הלילה בשעה 4 מעלות צלזיוס (F-אקטין נוצר) ולאחר מכן להוסיף DDH ₂ O בהיקף כולל של 1 מ"ל.
   4. אחסן את סיבי אקטין (F-אקטין) בשעה 4 ° C לשימוש מאוחר יותר בניסויים.
      הערה: ההצטברויות תתפוררנה ולקצר לאורך זמן, אך יכולות לשמש לשבועות לפחות.
2. הכן מדגם הדמיה.
   1. הפוך מדגם קאמרי (כמתואר בפרוטוקול 2.1 ו2.2). פיפטה ב20 μl biotinylated BSA ב1 מ"ג / מ"ל בDDH ₂ O. דגירה של 10 דקות. לשטוף עם 30 μl DDH ₂ O.
      הערה: זו חוסמת את משטח הזכוכית ומניחה את יוטין לכריכה של סיבי אקטין. פולי-L-ליזין Biotinylated - פוליאתילן גליקול (PLL-PEG) יכול לשרת את אותה פונקציה.
   2. פיפטה ב0.5 מ"ג / מ"ל ​​neutravidin. דגירה של 2 דקות ולאחר מכן לשטוף את החדר עם חיץ M5 30 μl.
   3. פיפטה בF-אקטין מוכן מדוללת 25 פעמים בחיץ אקטין כללי, לריכוז סופי ~ 0.004 מ"ג / מ"ל. חכה 10 דקות, לשטוף את החדר עם 30 חיץ μl.
   4. לדלל שרירן Va עם תגי FLAG פי 30 במאגר M5 (20 HEPES מ"מ (pH 7.6), 2 מ"מ MgCl _2, 25 מ"מ KCl, 1 מ"מ EGTA) לo ריכוז סופיתf 250 ננומטר. מערבבים שרירן μl 1 עם 1 μl Anti-FLAG-Qdot705 (~ 1 מיקרומטר, מצומדות מנוגדני Anti-FLAG וQdot705 באמצעות Qdot705 הנוגדן הצמידה ערכה על פי מדריך ההוראות מהיצרן). להוסיף ב8 μl M5 למלא 10 μl. פיפטה מעלה ומטה כדי לערבב היטב. דגירה של 10 דקות על קרח.
      הערה: זה מניב תערובת של 1 מנוע ל4 נקודות קוונטיות, ב ~ 25 ריכוז שרירן ננומטר.
3. הדמיה של שרירן הליכה על אקטין.
   1. הכן חיץ הדמיה (100 μl) על ידי ערבוב 84 μl M5-BSA (חיץ M5 עם 1 מ"ג / מ"ל BSA), ATP μl 1 (50 מיקרומטר ב DDH ₂ O), 2 μl DTT (500 מ"מ ב DDH ₂ O), 1 μl CK (500 U / ml), 5 CP μl (200 מ"מ), PCD 1 μl, 4 μl PCA, שרירן-qdot μl 1 מדולל אחר זה פי 10 ל2.5 ריכוז ננומטר שרירן, וμl 1 BME.
   2. פיפטה במאגר הדמיה 20 μl לדגום תא דגירה של 8-10 דקות.
   3. תמונת המדגם על Tמיקרוסקופ IRF ב30 חשיפה אלפיות שנייה. לרכוש לפחות 1,000 מסגרות. כוון את עוצמת הקול של שרירן-qdot בשלב 3.3.1 במידת צורך.
4. לבצע ניתוח נתונים ולמצוא את הצעד בגודל של הליכה שרירן.
   1. פתח את קובץ הווידאו בImageJ ¹⁷ ולחתוך את הווידאו סביב מקום מרגש. לחתוך מספיק שטח גדול שהמקום לא מקבל בתוך 20 פיקסלים של הקצה, ולוודא שאין כתמים אחרים בווידאו. ודא שהמקום הזה הוא נע במסלול ליניארי.
   2. עקוב אחר המקום באמצעות הווידאו כדי ליצור x, y קואורדינטות בזמן, בפיקסלים, על ידי יישום ניתוח פיונה (שלב 2.5.3) לכל אחד וכל מסגרת של הווידאו.
   3. המרת פיקסלים לננומטרים, כפי שתואר בסעיף הקודם.
   4. לחשב עקירה מעמדה מקורית כפונקציה של זמן.
   5. הפעל מבחן t על העקירה כדי לקבל את הצעדים של הליכה שרירן.
      הערה: התכנית ניתנת למבחן t (step_t_test.zip) מקודדת בIDL ונגדsists של 14 גרות בתיקייה.
      1. לפתוח את כל שגרות בIDL ולעבד את כל פעמיים. לאחר מכן להפעיל mtltyanalysis_ttest.pro ולבחור קובץ טקסט המכיל את נתוני המרחק רק בעמודה אחת. קובץ Excel פלט יופק, המכיל את הנתונים הגולמיים, בכושר, ואת גודל הצעד.
   6. מחק את כל אפס הערכים מעמודת צעד בגודל. עלילה ההפצה של גדלי הצעד באמצעות מקור או MATLAB. תתאים גאוס להיסטוגרמה.
      הערה: גדלי שלב של אפס ערכים צריכים למחוק, כי צעד של אפס משמעות הדבר היא כי אין צעד נלקח מהמסגרת הקודמת. הראוי נותן לשיא סביב 36 ננומטר (כפי שמוצג באיור 5).

.4 לדוגמא הכנה עבה לFIONA

1. הכן נקודות קוונטיות במארז בסול ג'ל.
   1. מערבבים 4.5 מ"ל TMOS, 1 DDH מ"ל ₂ O ו100 μl HCl (120 מ"מ). Sonicate את התערובת על קרח למשך 30 דקות בsp שואב קוליecified ברשימה של חומרים (תדירות = 40 kHz, דוד = off). מערבבים את הפתרון כל 10 דקות.
   2. לדלל 1.5 μl Qdot605 ב1.5 מ"ל HEPES (pH 50 מ"מ 7.2). מערבבים פתרון עם 1.5 מ"ל TMOS מהשלב הקודם.
   3. יוצקים את התערובת לתוך צלחת תחתית כוס. חותם את צלחת תחתית זכוכית עם Parafilm ולאחסן ב 4 ºC ל.1 5 שעות.
   4. הוסף 2 מ"ל 1% BME ב PBS לצלחת המדגם ו דגירה בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות לפני ההדמיה.
2. הכן מדגם קרנית מוכתם בנקודות קוונטיות.
   הערה: ארנב-עיניים היו מתנות מד"ר מרינה Marjanovic.
   1. הפרד את הקרנית מהעיניים ולחתוך אותו ל3 מ"מ x 3 חתיכות מ"מ.
   2. לדלל μl 1 Qdot 605-streptavidin ב 1 מ"ל של PBS. דגירה רקמת הקרנית עם פתרון Qdots ננומטר 1 ב 4 ºC עבור שעה 1. שטוף את הרקמה עם PBS.
   3. קח את שקופית זכוכית נקייה וcoverslip # 1.5. לשים 4 שכבות של קלטת דו צדדית בשקופית הזכוכית לאורך הצד הארוך יותר,nd לשים עוד 4 שכבות של מקביל קלטת דו צדדית לקלטת הקודמת ולהשאיר את ערוץ על 1 סנטימטר ביניהם. שים את הרקמה מהשלב הקודם באמצע הערוץ, ולכסות אותו עם coverslip.
   4. לחץ בעדינות על צידי coverslip כדי להפוך אותו להיצמד לקלטות. להרטיב את הערוץ עם 50 μl PBS לפני ההדמיה.
3. נקודות קוונטיות תמונה בסול ג'ל וקרנית.
   1. הדמיה FIONA בדגימות עבות, להשתמש אובייקטיבי 60X מים טבילה עם עובד מרחק של 0.27 מ"מ, או אובייקטיבי 60X מים טבילה עם עובד מרחק של 0.28 מ"מ.
   2. הר המדגם במיקרוסקופ. התאם את עדשת TIRF כך שהוא מגיע למצב עלית הקרינה (כלומר קרן הלייזר יוצאת מהמטרה עם זווית נגד coverslip). הכנס עדשה נוספת הגדלה (3.3X או 4.0x).
   3. הזז את מישור המוקד של המטרה למיקום רצוי z (למשל> 200 מיקרומטר). רשומות תמונות של נייחנקודות קוונטיות במדגם.
4. לבצע ניתוח FIONA כפי שתואר בסעיף 2.5 של פרוטוקול זה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

התקנת TIRFM אובייקטיבי מסוג טיפוסית מוצגת באיור 3. ראשון, מדגם Cy3-DNA-משותק משטח היה צילם. תמונה טיפוסית מוצגת באיור 4 א. התמונה צולמה עם זמן חשיפה 0.5 שניות, עם רווח EM = 50 ורגישות CCD = 12.13 למצלמה. נקודת התפשטות הפונקציה (כוחות הביטחון הפלסטיניים) של מולקולת Cy3-DN...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

FIONA הוא טכניקה למקם את עמדתו של פולט ניאון (fluorophore אורגני או נקודה קוונטית) עם דיוק ננומטר ופתרון זמני עד ל1 msec ^{4 8.} כאשר מספיק פוטונים נאספים, טכניקה זו מאפשרת לקבוע את המיקום של פולט ניאון הרבה יותר מדויק מגבול ההשתברות (~ 200 ננומטר) ולכן טכניקה זו פותחת את דרך לקיים...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Double-sided tape	3M		~75 µm thick
EMCCD camera	Andor Technology	DU-897E-CS0-#BV
Ultrasonic cleaner	Branson	2510
Fluorescence filter set	Chroma	49016
Actin polymerization buffer	Cytoskeleton	BSA02
Biotin G-actin	Cytoskeleton	AB07
G-actin	Cytoskeleton	AKL95
General actin buffer	Cytoskeleton	BSA01
Laser shutter (with driver)	Electro-Optical Products Corp.	SH-10-MP
IDL	Exelis Visual Information Solutions
Neutravidin	Fisher Scientific	PI-31000
Coverslip	Fisherbrand	22X30-1.5	0.16-0.19 mm thick
Microscope slide	Gold Seal Microslides	30103X1	0.93-1.05 mm thick
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-001
Glass bottom dish	In Vitro Scientific	D35-20-1.5-N
Cy3-DNA oligos	Integrated DNA Technologies		5'-Cy3/GCCTCGCTGCCGTCGCCA-3'Bio
Fluorescent beads	Invitrogen	T-7280
Qdot 605-streptavidin	Invitrogen	Q10101MP
Qdot605	Invitrogen	Q21301MP
Qdot705	Invitrogen	Q22021MP
Qdot705 Antibody Conjugation Kit	Invitrogen	Q22061MP
MATLAB	MathWorks
Optical table	Newport Corp		RS4000 Series
60X Objective	Nikon	Plan Apo VC 60x WI
100X Objective	Olympus	PlanApo 100X/1.45 Oil ∞/0.17
60X Objective	Olympus	UPlanApo 60X/1.20W
Inverted microscope	Olympus	IX71/IX70/IX81
Origin	OriginLab
Anti-FLAG antibody	Sigma Aldrich	F7425-.2MG
ATP	Sigma Aldrich	A7699
BME	Sigma Aldrich	63689-25ML-F
BSA	Sigma Aldrich	A7906
BSA-biotin	Sigma Aldrich	A8549-10MG
CK	Sigma Aldrich	C3755	Creatine Phosphokinase from rabbit muscle
CP	Sigma Aldrich	P1937	Phosphocreatine di(tris) salt
DTT	Sigma Aldrich	43815	DL-Dithiothreitol
EGTA	Sigma Aldrich	E3889	Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid
HCl	Sigma Aldrich	93363-500G
HEPES	Sigma Aldrich	H0887
KCl	Sigma Aldrich	P9333
MgCl2	Sigma Aldrich	M1028
NaCl	Sigma Aldrich	S7653
PCA	Sigma Aldrich	03930590	Protocatechuic acid
PCD	Sigma Aldrich	P8279	Protocatechuate-3,4-dioxygenase
TMOS	Sigma Aldrich	341436-25G	Tetramethyl orthosilicate
Tris-HCl	Sigma Aldrich	93363
Trolox	Sigma Aldrich	238813	6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid
1” diameter broadband dielectric mirrors with mounts	Thorlabs	BB1-E02, KM100	Quantity: 2
½” diameter posts	Thorlabs	TR4	Quantity ≥ 6
10X beam expander	Thorlabs	BE10M-A
2” diameter f = 300 mm lens with mount	Thorlabs	LA1256-A, LMR2	TIR lens
Fluorescent alignment target	Thorlabs	VRC2SM1
Laser safety goggles	Thorlabs	LG3
ND filter(s)	Thorlabs	FW1AND
Optical beam profiler	Thorlabs	BP209-VIS
Post-mounted iris diaphragm	Thorlabs	ID25	Quantity: 2
Shearing interferometer	Thorlabs	SI100
XYZ translation stage, ½” travel	Thorlabs	T12XYZ
Laser	World Star Technologies	TECGL-30	532 nm, 30 mW