הידרוג'ל Nanoparticle קציר של פלזמה או שתן לגילוי חלבונים שפע נמוך

Summary

Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.

Abstract

גילוי סמן ביולוגי חדשני משחק תפקיד משמעותי במאמץ לספק גילוי מחלה יותר רגיש וספציפי. למרבה הצער רב סמנים ביולוגיים נמוך שפע שקיימים בנוזלים ביולוגיים לא ניתן לאתר בקלות עם ספקטרומטריית או immunoassays כי הם נמצאים בריכוז נמוך מאוד, הם יציבים, ולעתים קרובות הם רעולי פנים על ידי חלבונים גבוה שפע כגון אלבומין או אימונוגלובולינים המוניים. פיתיון המכיל פולי (N-isopropylacrylamide) (NIPAm) חלקיקים מבוססים מסוגלים להתגבר על מחסומים פיסיולוגיים אלה. בצעד אחד שהם מסוגלים ללכוד, להתרכז ולשמור על סמנים ביולוגיים מנוזלי גוף. analytes משקל מולקולרי הנמוך להיכנס לליבה של החלקיק ונתפס על ידי צבעים שונים אורגניים כימיים, המשמשים כפיתיונות חלבון זיקה גבוהה. חלקיקים הם מסוגלים להתרכז החלבונים של ריבית על ידי צווים שונים של גודל. גורם ריכוז זה מספיק כדי להעלות את רמת החלבון באופן שהחלבונים הם בתוךגבול גילוי של ספקטרומטרים הנוכחיים המוניים, מערבי סופג, וimmunoassays. ניתן מודגרות חלקיקים עם שפע של נוזלים ביולוגיים והם יכולים להעשיר מאוד את הריכוז של חלבוני משקל מולקולריים נמוכים ופפטידים ואילו בניכוי אלבומין וחלבונים במשקל מולקולרי גבוהים אחרים. הנתונים שלנו מראים כי הגברה של פי 10,000 בריכוז של אנליטי מסוים ניתן להשיג, מה שמאפשר ספקטרומטריית המסה וimmunoassays כדי לזהות סמנים ביולוגיים לגילוי בעבר.

Introduction

למרות השלמת רצף הגנום האנושי, התקדמות משמעותית לא נעשתה בסמנים ביולוגיים לזיהוי ניבוי של מחלה בשלב מוקדם, או שמתאם עם תוצאה טיפולית, או הפרוגנוזה ^1. אחת סיבות לחוסר ההתקדמות היא שרבים סמנים ביולוגיים שעלולים להיות משמעותיים קיימות בריכוז מתחת לגבול הגילוי של ספקטרומטריית מסה המוסכמת ופלטפורמות גילוי סמן ביולוגי אחרות. ספקטרומטריית מסה (MS) וניטור תגובה מרובה (MRM) יש רגישות זיהוי בדרך כלל גדול יותר מ50 ng / ml בעוד רוב analytes שנמדד על ידי immunoassays במעבדה נפילה קלינית בטווח שבין 50 pg / ml ו10 ng / ml . משמעות דבר היא כי סמנים ביולוגיים רבים, במיוחד בשלב המוקדם של מחלה יכולים לא להיות מזוהים על ידי MS הקונבנציונלי וMRM ^2. בנוסף הנוכחות של חלבונים גבוה שפע כגון אלבומין ואימונוגלובולינים בנוזלים ביולוגיים מורכבים לעתים קרובות להסוות על ידי EXC מיליארדים פינמוך שפע ESS, חלבוני משקל מולקולריים נמוכים ופפטידים ^{3, 4.} מסיבה זו מספר צעדי הכנה מדגם נדרשים לפני רצף ספקטרומטריית מסה והזדהות. צעד הכנה אחד כזה מעסיק הדלדול של חלבונים גבוה שפע עם עמודות דלדול זמינות מסחרי ^5-8. לרוע המזל שלב זה מוביל להפחתה של התשואה של סמנים ביולוגיים מועמד בגלל שהם קשורים לעתים קרובות שאינם קוולנטית עם חלבונים נשאים שהוסרו. אתגר נוסף הוא מיוצג על ידי היציבות של סמנים ביולוגיים מועמד לשעבר vivo פעם אחת הדגימות שנאספו. חלבונים הם נושא לשפלה על ידי פרוטאזות אנדוגני או אקסוגני ^9. חלקיקי הידרוג'ל יכולים להתעלות מעל אתגרים קריטיים אלה על ידי הגברת ריכוז הסמן הביולוגי המשוערת לרמה בטווח של assay, תוך הגנה על החלבון מן השפלה ^10-13.

חשוב לציין הבLMW חלבונים בדם הם תערובת של חלבונים ללא פגע קטנים, כמו גם שברים של חלבונים גדולים. חלבונים המופקים מרקמות גדולות יותר מ60 kDa הם גדולים מדי כדי להיכנס לזרם הדם באופן פסיבי דרך הקרום במרתף של כלי דם, אבל הם יכולים להיות מיוצגים בדם כפפטידים או שברי חלבון ^14. המטרה שלנו היא למדוד סמנים ביולוגיים חדשניים במחזור שיכול להיות מועמדים לגילוי מוקדם של מחלה, ריבוד מטופל לטיפול, ומעקב אחר התגובה לטיפול. חלקיקים שלנו נוצרו כדי לשלול באופן סלקטיבי נוגדנים גבוה שפע ואלבומין, בעת לכידתו זמנית חלבונים ופפטידים קטנים יותר ומתרכזים אותם ל100 פי תלוי בהתחלת הנפח.

הקבוצה שלנו זיהתה שורה של צבעים אורגניים קטנים אשר יכול לפעול בהצלחה פיתיונות מולקולריים גבוהה כזיקה לחלבונים ופפטידים. הוא חשב חלבון צבען מחייב להיות בגלל שילוב של אינטראקציה הידרופובי ואלקטרוסטטיים. הטבעות ריחניות בצבע Interleave עם חלבונים באמצעות כיסים הידרופובי על פני השטח חלבון ^11.

הפיתיונות, תלוי בכימיה שלהם, להראות זיקה מסוימת לשיעורים נבחרים של analytes. הפיתיונות להתחרות עם החלבונים מובילים, כגון אלבומין, לחלבונים או פפטידים. חלבונים / פפטידים המשקל מולקולריים נמוכים נלכדו בחלקיקים. חלבוני משקל מולקולריים גבוהים כגון אלבומין ואימונוגלובולינים מנוע מלהיכנס לחלקיק בגלל יכולת הסנון בשל נקבובית המגבילה של הידרוג'ל ¹¹ (איור 1).

חלקיקי הידרוג'ל מסונתזים על ידי פילמור ממטרים ביוזמת persulfate אמוניום ^11. N-isopropylacrylamide (NIPAm), שיתוף מונומרים של חומצה אקרילית (AAC) וallylamine (AA) וצולב מקשר N, N'-Methylenebisacrylamide (BIS) מותר להגיב ב70 מעלות צלזיוס במשך 6 שעות בתנאים לדלל ¹1, 13. הזיקה גבוהה מחייבת חלבון של פולי (N-isopropylacrylamide-שיתוף אקריליק חומצה) (פולי (NIPAm-CO-AAC) nanoparticlesis מושגת על ידי קוולנטית שילוב צבעים המכיל אמינו (כלומר., צבעי sulfonatedanthraquinonetriazine) לחלקיקים דרך תגובת amidation בוצעה בממסים מימיים או אורגניים בהתאם למאפיינים הידרופילי / הידרופובי של הצבעים ^{11, 13} חילוף. Nucleophilic של הקבוצות האמינים בחלקיק עם אטום כלוריד של צבע anthraquinonetriazine מנוצל ליצירת פולי המכילים צבע (NIPAm -co-Allylamine) (AA) חלקיקים ^{11, 12.} תהליך פילמור שני שלבים הוא מנוצל כדי ליצור חלקיקי הידרוג'ל המכילים מעטפת חיצונית של חומצת vinylsulfonic (VSA) ^{11, 13.}

יכולים להיות מיושמים חלקיקי הידרוג'ל לנוזלים ביולוגיים שונים, ובכלל זה כל דם, פלזמה, סרום, נוזל השדרתי, זיעה, ושתן. בצעד אחד, בפתרון, nanoparticles לבצע מהיר (תוך דקות) תפיסה וריכוז של משקל מולקולרי נמוך analytes ^{10, 11, 13, 15-18.} חלבונים eluted לאחר מכן מהחלקיקים וזוהו באמצעות מערביים סופג ^19-21, ספקטרומטריית ^{10, 11, 13, 15, 18, ​​22 המוני, 23,} immunoassays / ^{10 ELISA, 11, 15, 18,} ​​או microarray חלבון שלב הפוך ^{16, 24} מבחני. חלקיקים פונקציונליות עם פיתיון כימי, והצגת ארכיטקטורת פגז ליבה או ליבה, לכידה ולהתרכז חלבונים המבוססים על מאפייני physicochemical פיתיון / פגז. צבעים שונים שולבו בחלקיקים ולכן יהיו ללכוד תת שונה של חלבונים עם משתנה יעילות המבוססת על זיקת הצבע, pH של התמיסה, ונוכחות / היעדרות של מתחרות חלבונים גבוהים בשפע ^13. יתר על כן, כמות חלקיקים ביחס להיקף הפתרון תשפיע על תשואת החלבון מהחלקיקים. היבטים אלה שלקציר nanoparticle הידרוג'ל הם הפגינו באמצעות שלושה פיתיונות nanoparticle שונים לחלבוני קצירה מדגימות פלזמה שמכילות כמויות גדולות של חלבון, ומדגימות שתן שבדרך כלל לא מכילות כמויות גדולות של חלבון. בפרוטוקול זה אנו מדגימים קצירה וריכוז אלפא גורם נמק גידול (TNFα) מדגימות פלזמה באמצעות פולי (NIPAm-CO-AAC), midi (NIPAm / צבע), וחלקיקי קליפת core- (פולי (NIPAm-CO-VSA)) . חלקיקי midi (NIPAm / צבע) מוצגים להתרכז אנטיגן מיני Mycobacterium שנוסף לדגימות שתן אנושיות, לחקות אנשים נגועים שחפת Mycobacterium.

Protocol

פלזמה ובשתן אנושיים נאספו מתורמים מתנדבים בריאים, עם כתב הסכמה מדעת, הבאים באוניברסיטת ג'ורג מייסון מוסדי המועצה לביקורת שאושרה פרוטוקולים. תורמים חולקו שווים בשווים בין זכרים ונקבות קווקזי בין גילאי 25 ו42. דוגמאות נותחו בנפרד ולא אספו.

.1 Nanoparticle עיבוד דגימות סרום או פלזמה

סמנים ביולוגיים בשפע פוטנציאל נמוך בפלזמה נלכדים, בפתרון, עם חלקיקי הידרוג'ל. החלקיקים מתווספים לפלזמה, מודגרות, מופרדת על ידי צנטריפוגה, שטף, והחלבונים שנתפסו הם eluted. חלבוני eluted מיובשים תחת זרימת חנקן עבור סידור במורד הזרם המוני ספקטרומטריית והזדהות.

1. לדלל 500 μl של סרום 1: 2 עם 50 מ"מ TrisHCl pH 7 (500 סרום μl + 500 μl TrisHCl) בצינור microcentrifuge.
2. הוסף 500 μL (NIPAm / AAC) nanop ליבה של פולימאמרים. דגירה של 15 דקות ב RT.
3. ספין המדגם ב 16,100 XG, 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בצנטריפוגה מצוידת בהרוטור קבוע זווית. להסיר ולסלק supernatant.
4. הוסף 500 thiocyanate μl נתרן (25 מ"מ) לגלולה. Resuspend חלקיקים על ידי מרץ pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים.
5. ספין המדגם ב 16,100 XG, 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בצנטריפוגה עם הרוטור זווית קבוע. להסיר ולסלק supernatant.
6. הוסף 500 μl מים MilliQ לגלולת החלקיק. Resuspend חלקיקים על ידי מרץ pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים.
7. ספין המדגם ב 16,100 XG, 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בצנטריפוגה עם הרוטור זווית קבוע. להסיר ולסלק supernatant.
8. הכן חיץ elution טרי: הוסף 700 μl אצטוניטריל 300 אמוניום הידרוקסיד μl בצינור נקי. זהירות: הידרוקסיד אמוניום הוא מאכל. השתמש עם אוורור מתאים. הערה: חיץ elution חייב להיות הכנהared מייד לפני השימוש. אל תאחסן את חיץ elution.
9. הוסף 300 μl של חיץ elution לגלולת החלקיק. Resuspend חלקיקים על ידי מרץ pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים. דגירה של 15 דקות ב RT.
10. ספין המדגם ב 16,100 XG, 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בצנטריפוגה עם הרוטור זווית קבוע. הסר ולשמור את eluate בצינור נקי, שכותרתו microcentrifuge.
11. חזור על שלבים 1.9-1.10. לשלב את שני eluates לתוך צינור microcentrifuge אחד.
12. ייבש את eluates תחת זרימת חנקן בסעפת מאייד חנקן ב42.1 ° C, עם זרימת אוויר מוגדרת 8 (איור 2F).
13. אחסן את eluate המיובש ב RT לO / אחסון N, או ב -20 מעלות צלזיוס עבור אחסון לטווח ארוך, לפני ספקטרומטריית מסה, מערבי סופג, או מבחני ELISA (אופציונליים).

.2 עיבוד Nanoparticle של דגימות שתן

שתן נורמלי מכיל פחות מ 30 מ"ג / ד"ל חלבון ופחות מ 1 + דם. עם זאת, מחלות רבות / תנאים עשויות לשנות את הרמות נורמליות של חלבון בשתן ודם של. כדי לסייע בקביעת הנפח האופטימלי של חלקיקים כדי להוסיף לדגימת השתן, בדיקת שתן מבוצעת לפני קציר חלקיק. סמנים ביולוגיים שתן עשויים להתקיים בריכוזים נמוכים מאוד, שעשויה לדרוש אופטימיזציה של היחס של חלקיקים לנפח שתן. הליך זה מתאר את קצירת חלקיק של דגימות שתן לניתוח כתם מערבי במורד הזרם.

1. לאסוף דגימות שתן בכוס פלסטיק נקייה, יבשה. היקף מינימאלי 22 מ"ל נדרש. שתן חנות דגימות ב -80 ° C עד מוכן לנתח.
2. להפשיר את השתן הקפוא ב RT או על 4 מעלות CO / N. מערבבים בקצרה על מיקסר מערבולת. יוצקים לפחות 22 מ"ל של שתן לתוך צינור פוליפרופילן תחתון 50 מ"ל חרוטי.
3. ספין השתן בצנטריפוגה עם הרוטור את הנדנדה ב3,700 XG במשך 15 דקות. למזוג השתן, מבלי להפריע גלולה, לpolypr תחתון 50 מ"ל חרוטי נקיצינור opylene. זורק את הכדור.
4. לבצע בדיקת שתן באמצעות רצועה רב אנליטי "מדיד שתן" מגיב. הערה: לאחסן את הרצועות מגיב במכל סגור היטב הרחק מאור שמש ולחות ^{17, 18} ישירים.
   1. הנח את הרצועה מגיב, עם הפנים כלפי מעלה, על מגבת נייר נקיה ויבשה.
   2. השתמש בפיפטה חד פעמית כדי לשאוב 1 מ"ל של השתן מוכן בשלב 2.3.
   3. להגדיר טיימר למשך 2 דקות, אבל לא להפעיל אותו. מהירות לוותר 1 - 2 טיפות של שתן על כל משטח בדיקה של הרצועה מגיב. מייד להתחיל את הטיימר. הערה: אל להטביע את הרצועה מגיב ישירות במכל השתן. מחווני צבע / הכימיים ברצועה מגיב עלולים לדלוף החוצה של הרצועה מגיב לתוך מיכל השתן.
   4. בזמן מצויינים על גבי מיכל הרצועה מגיב, רשום את התוצאות איכותיות עבור analytes השונים ברצועה מגיב על ידי השוואת הצבע של הרצועות מגיב פרט לאינדיקה בצבעים המקבילהtors על המכל מגיב. תוצאות שתן נורמליות אופייניות הן: (רגילות או שליליות) לדם, חלבון, לויקוציטים, ניטריט, גלוקוז, קטון, בילירובין, וurobilinogen; pH שתן (5.5-7.0); משקל סגולי (1.001-1.020). הערה: רמות חלבון גבוה בדגימת שתן עשויות להתחרות עם החלבון של עניין לאתרי קישור על חלקיקים. על מנת למקסם את קצירת חלבון עם חלקיקים, חלקיק הנפח / יחס נפח השתן יכול להיות מותאם לכל אחד תחרות גבול מחלבונים שפע גבוהים, או יכול להיות מותאם למסוק חלבונים שקיימים בריכוזים נמוכים מאוד. אם ערך חלבון בשתן הוא 1+ או גדול יותר, להוסיף כרכי 2x של חלקיקים בשלב 2.5 להלן. אם אנליטי של עניין הוא חלבון נפוץ מאוד נמוך, ייתכן שיהיה צורך להגדיל את ההיקף של חלקיקים עד 2 מ"ל (איור 3).
5. העברה 20 מ"ל של השתן הבהיר מצעד 2.3 לתוך צינור פוליפרופילן נקי 50 מ"ל תחתון חרוטי. האם לאלהפריע כל פסולת / גלולה שיכולה להיות בחלק התחתון של צינור השתן. הוסף 200 μl של חלקיקים לדגימת שתן 20 מ"ל. מערבבים בקצרה על מיקסר מערבולת. הערה: אם ערך חלבון בשתן הוא 1+ או גדול יותר, להוסיף 400 μl של חלקיקים ל20 מ"ל שתן.
6. דגירה את תערובת שתן / חלקיק ל30 דקות ב RT, ללא נדנדה / ערבוב.
7. ספין ההשעיה שתן / חלקיק בצנטריפוגה מצוידת ברוטור את נדנדה ב3,700 XG עבור 10 דקות. הערה: אם גלולה היא לא צנטריפוגה הבאה נראית לעין, לסובב את הדגימות ל2 נוספות - 7 דקות.
8. להסיר ולסלק supernatant. מוסיף המים 500 μl MilliQ לגלולת החלקיק.
9. Resuspend חלקיקים על ידי מרץ pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים. מעבירים את פתרון nanoparticle לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל נקי.
10. ספין חלקיקים בצנטריפוגה מצוידת בהרוטור קבוע זווית ב16,100 XG 10 דקות. הערה: אם גלולה היא לא מספק מתה גלויגעיית צנטריפוגה, לסובב את הדגימות ל2 נוספות - 7 דקות.
11. להסיר ולסלק supernatant.
12. חזור על שלבים 2.8 ו2.11 (פעמיים) עם 200 μl 18 MilliQ מים כדי לשטוף את חלקיקים.
13. הכן חיץ elution טרי: הוסף 970 μl אצטוניטריל ל30 אמוניום הידרוקסיד μl בצינור נקי. זהירות: הידרוקסיד אמוניום הוא מאכל. השתמש עם אוורור מתאים. הערה: חיץ elution חייב להיות מוכן מייד לפני השימוש. אל תאחסן את חיץ elution.
14. הוסף חוצץ elution 20 μl לגלולת החלקיק. Resuspend חלקיקים על ידי מרץ pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים. דגירה של 15 דקות ב RT.
15. ספין דגימות החלקיק ב16,100 XG 10 דקות. הסר ולשמור את supernatant ב, צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל נקי. אל תפריע לגלולת החלקיק. זורק את הכדור בפסולת הביולוגית.
16. מניחים את הדגימות במעמד במנדף הכימי. פתח את הכובעים, וincubate ב RT למשך 30 דקות. לחלופין, למקם את הדגימות תחת זרימת חנקן ב40 מעלות צלזיוס עד יבשה (1 - שעה 2).
17. הוסף 15 μl חיץ טריס-גליצין SDS מדגם (2x) לדגימות. חום ב100 מעלות צלזיוס בגוש חום יבש ל5 דקות עם הכובעים פתוחים או עד שהנפח שנותר בצינור היא לא יותר מ 20 μl. שים לב: אין להשתמש באמבט מים רותח. לחות מאמבט המים תהיה למנוע אידוי של החיץ.
18. מניחים את הכובע על הצינורות. הסר את הצינורות מהגוש החום. המדגם יכול להיות מאוחסן ב-80 מעלות צלזיוס או בשימוש באופן מיידי לניתוח כתם מערבי במורד הזרם.

תוצאות

גודל הידרוג'ל Nanoparticle ואחידות

חלקיקי midi (NIPAm-AAC) שהופקו בתשואה גבוהה במיוחד ושחזור בין ובתוך קבוצות. יש לי החלקיקים יציבות colloidal טוב מאוד ב RT בזמן הנדרש עבור לכידה, אחסון, וelution של חלבונים (לפחות 48 hr), וממטרי חלקיק לא נצפו

Discussion

רלוונטיות קליני

הוא חשב מדגם סרום או פלזמה להכיל נמוך שפע במחזור חלבונים ופפטידים אשר יכול לספק מקור מידע עשיר על מצבו של האורגניזם כולו. למרות ההבטחה של פרוטאומיקה סרום, יש שלושה חסמים פיסיולוגיים בסיסיים ורציניים סיכ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hydrogel nanoparticles	Ceres Nanoscience	CS003	NanoTrap ESP particles
18 MΩ-cm water			Type 1 reagent grade water
Tris HCl, 50 mM pH 7.0	VWR	IC816116	50 mM, pH 7
Acetonitrile	BDH	BDH1103-4LP	Available from VWR
Ammonium Hydroxide NH4OH	BDH	BDH3014	Available from VWR, assayed at 28-30% NH3
Sodium thiocyanate 25 mM	Acros Organics	419675000	For serum/plasma samples
Multi-analyte Urine Reagent Strips	Siemens	2161	For urine samples
Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X)	Life Technologies	LC2676	Use at RT to prevent SDS from precipitating
Dry bath incubator (100 oC) with heating block	Barnstead	11-715-125DQ	Do not substitute a boiling water bath
Nitrogen evaporator manifold	Organomation Associates	Microvap118	For serum/plasma samples
Centrifuge, swing-out rotor	Sorvall	Legend series	50 ml tube capacity, rcf 3,700 x g
Centrifuge, fixed angle rotor	Eppendorf	5424	1.7 ml microcentrifuge capacity, rcf 16,000 x g
50 ml conical centrifuge tubes	Fisher Scientific	14-432-22	With screw caps for urine samples
1.5 ml microcentrifuge tubes	Eppendorf	22363204
Vortex mixer	Fisher Scientific	50-949-755
Timer	Fisher Scientific	S04782	Seconds/minutes