בידוד של תאי Murine לימפה צומת סטרומה

Summary

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

Abstract

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host.

Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Introduction

בלוטות הלימפה הן תאים מיוחדים שבו תגובה חיסונית אדפטיבית נגד אנטיגנים עצמיים-זרים והם יזמו ותאמו. ההליך שהוצג כאן מתאר עיכול אנזימטי קצר בשילוב עם pipetting המכני האוטומטי לקבל השעיה תא בודד בלוטה לימפה ולקבל גישה לתאי סטרומה בלוטה לימפה קיימא השומרים על הבעת פני השטח של כמה מולקולות.

תא סטרומה בלוטה לימפה בצורת הפיגום של בלוטות לימפה ולמלא שלושה תפקידים מרכזיים: ראשון שהם לסנן נוזלי גוף לדגום אנטיגנים, פתוגנים והדפוס שלהם הפתוגן הקשורים המולקולרי (PAMPs), כמו גם ציטוקינים ודפוס מולקולרי הקשורים סכנה (damps) נוכחי בגוף. שנית, הם מושכים ולהורות תאי הצגת אנטיגן (APC) ולימפוציטים מסוג האינטראקציה וליזום תגובה חיסונית אדפטיבית; ושלישית, הם מספקים סביבה מבנית להומאוסטזיס וההתמיינות של לימפוציטים מסוג ¹-3. במהלך תאי סטרומה הבלוטה לימפה לדלקת לייצר גורמי גדילה, ציטוקינים וכמוקינים, להסתגל לנפיחות ובכך ארגון האינטראקציה בין תאים דנדריטים (DCS), טריקו, וB- תאים. התזמור של תגובות חיסוניות אפשרי רק בשל הארכיטקטורה המבנית המורכבת שהוקמה על ידי אוכלוסיות תאי סטרומה שונות.

תאי סטרומה בלוטה לימפה הם תאים שליליים CD45 וניתן להבחין על ידי הביטוי של CD31 או gp38 בתאי fibroblastic ואנדותל ^{1 -6.} Gp38 ⁺ CD31 ^- מגדיר תאי אזור T רשתי (TRC, הידוע גם בFRC: תאי רשתית fibroblastic), gp38 ⁺ CD31 ⁺ מגדיר תאי הלימפה אנדותל (LEC), gp38 ^- CD31 ⁺ מגדיר תאי האנדותל בדם (BEC). יתר על כן, אפיון של האוכלוסיות חשף את קיומם של תאי סטרומה בלוטה לימפה אחרים. ואכן, אוכלוסיית תאים כמו pericyte קטנה התאפיינה בתוךgp38 ^- CD31 ^- אוכלוסיית ^7. לכן, עיבוד של הליך הבידוד הוא יתרון עבור זיהוי ואפיון של התכונות פונקציונליות של תאי סטרומה בלוטה לימפה שונים.

לפני הפיתוח של מערכת עיכול תאי סטרומה בלוטה לימפה פרוטוקולי המחקר של תאי סטרומה בלוטה לימפה היה מוגבל בתצפיות באתר באמצעות סעיף ומיקרוסקופיה רקמה. עם זאת, מחקרים מבניים ותפקודיים הראו מאפיינים חשובים של תאי סטרומה בלוטה לימפה. תאי סטרומה בלוטה לימפה קשורים עם podoplanin, קולגן ומטריצת חוץ תאית חלבונים (ECM) כדי ליצור מבנה מורכב 3 ממדים הנקרא מערכת צינור, שמעביר חלבונים לימפה ומסה מולקולרית הקשורים נמוכה מסינוס subcapsular של הבלוטה לימפה לגבוהה אנדותל venules באזור תאי T ^8. DCs נמצא בקשר הדוק עם תאי סטרומה ואפשר לראות בולט לקון צינורימבנה duit לדגום נוזל ולזהות אנטיגנים ^8. האינטראקציה של תאי בלוטה לימפה סטרומה (TRCs וLECs) עם DCs מתווכת על ידי השחרור וההצגה של CCL21 כמוקינים וCCL19 ^9,10. CCL19 וCCL21 מוכרים על ידי קולטן CCR7 להקל DCs ותאי T לנדוד לאזור תא T הבלוטה לימפה ^4,11. למרות שימוש בכמוקינים דומים, יש לי תאי DCs וT מסלולי נדידה שונים לבלוטות הלימפה ^12. מאוחר יותר, באמצעות עיכול אנזימטי של בלוטות לימפה ובידוד של תאי סטרומה בלוטה לימפה טהורים, מחקרים פונקציונליים בוצעו על עצם את התפקיד של תאי סטרומה הבלוטה לימפה השונים והיכולת שלהם לתקשר עם DCs וT / תאי B ^6,13. ראשית, crosstalk בין תאי IFN-γ ייצור מפעיל T ותאי סטרומה בלוטה לימפה גורם ייצור של תחמוצת חנקן המטבוליט מוצגת לצנן תגובות תא T ושגשוג באיברי הלימפה המשניים ^14-16. שנית, לימפה nתאי סטרומה שיר הלל כבר דיווחו לתמיכה בבידול של תת DC רגולציה באמצעות הייצור של IL-10 ^17, ולווסת הומאוסטזיס תא T נאיבי באמצעות הייצור של IL-7 ^6,18. שלישית, ביטוי TLR בתאי סטרומה בלוטה לימפה מצביע על כך שתאי סטרומה רגישים לאותות הנגזרים מזיהום או מולקולות עצמית שפורסם במהלך פגיעה ברקמות. ואכן, הטיפול בתאים סטרומה בלוטה לימפה עם ליגנד של פולי TLR3 (אני: C) גורם גברת ביטוי צנועה של גדול אני כיתה המורכבת histocompatibility ביטוי וגברת ביטוי של מולקולת שיתוף מעכב PD-L1, אך לא של מולקולות costimulatory, וכתוצאה מכך שינויים דרמטיים ברקמות היקפי אנטיגנים ביטוי ^19. כמה קבוצות הראו תאי סטרומה בלוטה לימפה לבטא אנטיגנים רקמות היקפיים ולגרום לסובלנות של תאי T עצמי תגובתי ^19,21-27. לכן, הבנת יחסי הגומלין בין תאי סטרומה בלוטה לימפה ומחדש נודדים והאחרותתאי בלוטה לימפה sident יעזרו למצוא מולקולות יעד חדשות כדי לאפשר הפעלה או דיכוי של מערכת חיסונית בזמן דלקת. לכן, יש צורך ביישום ההפרדה האנזימטית שפורסמה של בלוטות לימפה.

פרוטוקולים שפורסמו בעבר להשתמש בשילובים שונים של עיכול אנזימטי מבוסס collagenase עם לחץ מכאני נמוך ^6,19,20. עם זאת, incubations הארוך עם אנזימי עיכול או שילוב של אנזים עיכול שונה עלול לבזות מולקולות פני השטח שונות הנדרשות על מנת לנתח את מצב ההפעלה ולזהות תאי סטרומה בלוטה לימפה חדשים. בהתאם לסוג של ניתוח תא סטרומה, פרוטוקול הקישור או פלטשר הפרוטוקול עשוי להיות מתאים יותר. בהליך המתואר, עיכול אנזימטי מעט קצר יותר בשילוב עם פיצול של מכאני אוטומטי כדי למזער השפלה סמן פני השטח של תאי סטרומה הבלוטה לימפה קיימא. הליך זה מאפשר בידוד מאוד לשחזור והבחנה של אוכלוסיות תאי סטרומה בלוטה לימפה עם שונות נמוכות וכדאיות יותר מ 95%. תאי סטרומה הבלוטה לימפה המבודדים הטרי ניתן להשתמש ישירות לביטוי סמן משטח, ניתוח חלבון, ומחקרי תעתיק, כמו גם הקמתה של קווי תאי סטרומה לבצע מבחני תפקודיים במבחנה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

בפרסום הסרטון הזה ופרוטוקול, את כל ההליכים בבעלי החיים נערכו בהתאם לפרוטוקול שאושר על ידי בעלי החיים קנטונלית הרשות באזל, שווייץ.

.1 בלוטות הלימפה הכנה ועיכול

1. מים מראש בחום בכוס ל37 מעלות צלזיוס בבוחש מגנטי עם צלחת חימום.
2. הכן בסיסי בינוני כדלקמן: DMEM בינוני (ללא פירובט) השלים עם FCS 2%, 1.2 מ"מ CaCl ₂ ופן / סטרפטוקוקוס (פניצילין 100 יחידות, של סטרפטומיצין 100 מיקרוגרם).
3. לעקר את כל מכשירים לנתיחה לפני השימוש.
4. להרדים עכברי תורם בלוטה לימפה לCO ₂ מחנק וסביבה נקי מחיידקים לנתח את בלוטות הלימפה. אל לנתח את השומן שמסביב. הערה: פרוטוקול זה הוא מותאם לצומת היקפית-ניקוז עור לימפה (מפשעתי, זרוע, בית השחי).
5. מניחים בלוטות לימפה בצלחת פטרי המכילה סטרילי בינוני בסיסית קר 2 מ"ל קרח.
6. לשבש את ca הבלוטה לימפהpsule באמצעות שתי 25 מחטי G קבועות במזרק 1 מ"ל.
7. העברת רקמת הבלוטה לימפה שיבש בצינור מסביב לתחתית 5 מ"ל פוליפרופילן המכיל 750 בינוני בסיסי μl בתוספת 1 מ"ג / י DNAse 40 מיקרוגרם / מ"ל ​​מ"ל Collagenase IV ו
8. להוסיף בוחש מגנטי סטרילי אחד בצינור אחד.
9. צינור מקום בכוס עם 37 ° C שחומם מראש מים ומערבבים את הצינורות בקצב איטי (סיבוב 1 / sec) עבור 30 דקות.
10. הסר את הצינור מהבוחש המגנטי עם צלחת חימום ולתת שברי בלוטה לימפה להתיישב.
11. מוציא בזהירות את supernatant המועשר ב" תאים לא סטרומה ". הערה: אם הניתוח של T, B, תאים דנדריטיים וCD45 ^- gp38 ^- CD31 ^- הוא צפוי, לשמור את החלק "תאים שאינן סטרומה".
12. לשטוף נותר רקמת בלוטה לימפה פעם אחת עם 750 בינוניים בסיסי μl. הערה: שלב זה הוא הכרחי רק אם עובד עם עכברי חיסון מוסמך.
13. בואו ברי בלוטה לימפה להתיישב.
14. הסר אתשבריר צף תאים שאינה סטרומה.
15. הוסף לברי הבלוטה לימפה בינוניות בסיסי 750 μl בתוספת 3.5 מ"ג / מ"ל ​​Collagenase D ואני DNase 40 מיקרוגרם / מ"ל
16. צינור מקום בחזרה בכוס המכילה 37 ° C שחומם מראש מים.
17. לעכל רקמת בלוטה לימפה במשך 5 דקות תוך ערבוב לאט.
18. שברי Disaggregate הלימפה רקמת צומת על ידי pipetting וערבוב 700 μl ל10 מחזורים במהירות המרבית באמצעות פיפטה רבה אוטומטית. הערה: זה משבש רקמת בלוטה לימפה כדי לשפר את העיכול.
19. מניחים את הצינור בחזרה בכוס עם 37 מעלות מים שחומם מראש C.
20. שברי רקמת הבלוטה לימפה Digest עוד 10 דקות תוך ערבוב לאט.
21. Disaggregate ברי רקמת בלוטה לימפה על ידי pipetting וערבוב ל99 מחזורים במהירות המרבית באמצעות פיפטה רבה אוטומטית.
22. הוספת 7.5 μl של 0.5 M EDTA כדי להבטיח תחזוקה של השעיה תא בודדת.
23. שברי רקמת הבלוטה לימפה Disaggregate על ידי צינורtting וערבוב ל99 מחזורים במהירות המרבית באמצעות פיפטה רבה אוטומטית.
24. הוסף בינוני בסיסית 750 μl ולהעביר תאים דרך רשת ניילון 70 מיקרומטר.
25. ההשעיה תא צנטריפוגה 5 דקות ב1,500 XG, 4 ° C.
26. תאי סטרומה כעת ניתן להשתמש לצורך ניתוח נוסף.

.2 צביעת תאים לימפה צומת סטרומה

1. השתמש בשילוב של אנטי CD45, אנטי podoplanin (gp38), נוגדנים נגד CD31 להכיר בהצלחה תאי TRC, LEC, BEC וDN.
2. דגירה רקמת הבלוטה לימפה מתעכל עם גשש חי / מת, אנטי CD45-FITC (1: 200), אנטי gp38-PE (1: 200), אנטי CD31-APC (1: 200) ב100 μl HBSS המכיל 2 FCS% לפחות 20 דקות, 4 ° C, בחושך.
3. שוטף את התאים והוסיפו 500 l של HBSS המכילים 2% FCS
4. ההשעיה תא צנטריפוגה 3 דקות XG ב 1500, 4 ° C..
5. להשעות Re בשל HBSS 100 μl המכיל 2% FCS.
6. הפעל את התאים המוכתמים בזרימה cytometer equippעורך עם אופטיקה הבאה: מקור עירור עם עד שלושה לייזרים: כחול (488 ננומטר,, מצב מוצק 20 mW מקורר אוויר), אדום (633 ננומטר, 17 mW HeNe), וסגול (405 ננומטר, 30 mW מצב מוצק) .
7. השער CD45 ^- תאים שלא לכלול תאי hematopoietic.
8. singlets השער (FSC-W) ותאי חיים (LIVE / גשש DEAD) שלא לכלול כפילויות ותאים מתים.
9. gp38 עלילה לעומת CD31 לדמיין TRC (gp38 ⁺ CD31 ^-), LEC, BEC (gp38 ^- CD31 ⁺⁾ (gp38 ⁺ CD31 ⁺⁾ וDN (gp38 ^- CD31 ^-) תאים (ראה איור 1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הפרוטוקול הנוכחי הוא פרוטוקול עיכול שונה פורסם על ידי קישור et al., 2007 ⁶ עם זמן קצר יותר לעיכול (45 מרבי דקות) בשל פיצול של מכאני עם פיפטה רבה אוטומטית. בנוסף, ההליך הוא סטנדרטי יותר, ממזער פירוק של סמני משטח בתאי סטרומה בלוטה לימפה שונים ומאפשר את הטיפול במדגם אח...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

המחקר של תאי סטרומה בלוטה לימפה לאחרונה הפך למוקד מחקר עקב התפתחותם של שני פרוטוקולי עיכול פורסם ^6,13. שני הפרוטוקולים מספיקים כדי לקבל תאי סטרומה הבלוטה לימפה בודדת אך שונים בשימוש באנזימי עיכול ואת הזמן של עיכול. מאחר ותאי סטרומה וסמני פני השטח שלהם רגישים לעי?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	LifeTechnologies-Gibco	41965-039
FCS			Final concentration 2%
CaCl2	Sigma	499609	Final concentration 1.2 mM
Collagenase IV	Worthington Biochemical Corporation		>160 units per mg dry weight, use at final concentration of 1 mg/ml
Collagenase D	Roche	11088882001	use at 3.5 mg/ml
DNAse I	Roche	11284932001	use at 40 µg/ml
Stiring magnets	FAUST		5 mm long-2 mm ø
Polystyrene round bottom tubes 5 ml	Falcon-BD Bioscience
Magnetic stirrer with heating function	IKA-RCT-standard	9720250
Petri dishes 100 mm, sterile	TPP	6223201
25 G needles	Terumo
anti mouse CD45 Ab	Biolegend		Clone 30-F11
anti mouse CD11c Ab	Biolegend		Clone N418
anti mouse Podoplanin Ab	Biolegend		Clone 8.1.1
anti mouse CD31 Ab	Biolegend		Clone MEC13.3
Eppendorf Xplorer plus, Multichannel	Eppendorf	4861 000.821/830	1.250 µl max. volume
anti mouse CD140a	Biolegend		Clone APA5
anti mouse CD80	Biolegend		Clone 16-10A1
anti mouse CD40	Biolegend		Clone 1C10
anti mouse I-Ab	Biolegend		Clone AF6-120.1
anti mouse CD274 (PD-L1)	Biolegend		Clone 10F.9G2
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell stain kit	Invitrogen	L10119