מערכת תרבות עכבר העוברי שלם מעי ל<em&gt; Ex Vivo</em&gt; מניפולציה של מסלולי איתות והדמית חיה תלת ממדית של פיתוח שליה

Summary

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Abstract

רוב התהליכים המוךפו"גנטי במעי של העובר כבר משתמעים מסעיפים דקים של רקמות קבועות, מתן תמונות של שינויים לאורך שלבי התפתחות. מידע תלת ממדים מסעיפים סידוריים דקים יכול להיות מאתגר לפרש בגלל הקושי של שחזור קטעי סדרתי בצורה מושלמת ושמירה על הכיוון נכון של הרקמות על סעיפי סדרתי. הממצאים אחרונים על ידי Grosse et al., 2011 מדגישים את החשיבות של שלושה מידע ממדי בהבנת המורפוגנזה של villi הפיתוח של המעי ^1. שחזור תלת ממדי של תאים במעי שכותרתו בנפרד, הוכיח כי רוב תאי אפיתל במעי פנו שני משטחי הפסגה ובסיסיים. יתר על כן, השחזור תלת ממדי של שלד התא אקטין במשטח הפסגה של האפיתל הראה שחלל המעי הוא רציף ושלומן המשני הוא חפץ של יםectioning. אלה שתי נקודות, יחד עם ההפגנה של הגירה גרעינית interkinetic באפיתל במעי, שהוגדרו אפיתל במעי מתפתח כהאפיתל pseudostratified ולא רובדו כפי שחשבו בעבר ^1. היכולת להתבונן האפיתל בתלת הממד הייתה זרע להוכחת נקודה זו ומגדירה מחדש המורפוגנזה אפיתל במעי של העובר. עם התפתחות טכנולוגית הדמיה רב פוטון ותוכנת שחזור תלת ממדים, היכולת לדמיין ללא פגע, פיתוח איברים משתפר במהירות. שני פוטונים עירור מאפשר חדיר פחות מזיק עמוק יותר לתוך רקמות עם רזולוציה גבוהה. שני פוטונים הדמיה ושחזור 3D של המעיים עכבר העובריים השלם בולטון et al., 2012 עזרו להגדיר את הדפוס של סיסי תולדה ^2. כאן אנו מתארים מערכת תרבות איבר שלמה המאפשרת פיתוח vivo לשעבר של villi והרחבות של מערכת שהתרבות כדי לאפשרהמעיים להיות בתלת ממד הדמיה במהלך הפיתוח שלהם.

Introduction

Each intestinal villus is composed of two main tissue compartments: an epithelial surface layer and a mesenchymal core. The mouse small intestine is formed at embryonic day 10 when a sheet of endoderm closes and seals to form a tube of epithelium surrounded by mesenchymal cells³. This flat tube of epithelium undergoes rapid proliferation, growing both in length and girth and undergoes dramatic rearrangements involving dynamic cell shape changes¹. At the same time, the surrounding mesenchyme also undergoes many developmental processes including the formation of the vascular plexus, differentiation of smooth muscle and recruitment of enteric neurons⁴. In the proximal small intestine at embryonic day 14.5, condensations (clusters) of Hedgehog- and PDGF-responsive cells begin to form adjacent to the epithelium^2,5. Formation of mesenchymal clusters continues to spread along the length of the intestine so that they cover the entirety of the small intestine by embryonic day 16.5². As mesenchymal clusters form, the epithelial cells closest to the clusters begin to withdraw from the cell cycle, while the other epithelial cells continue to proliferate. Those cells directly above the mesenchymal cluster that have withdrawn from the cell cycle begin to change shape as the emerging villus buckles into the lumen. Further growth of the villus is driven in part by the continued proliferation of the epithelium between the emerging villi. The mesenchymal clusters remain tightly adhered to the epithelium of the growing villus and continue to express a variety of signaling molecules. The wave of villus emergence propagates along the length of the small intestine following the formation of mesenchymal clusters. As the intestine continues to grow and the intervillus region extends between emerging villi, new mesenchymal clusters form adjacent to the intervillus epithelium and further rounds of villus emergence and growth ensue⁶.

Synchronized development of the epithelium and mesenchyme is essential for villus morphogenesis. Signaling molecules are secreted from one layer to the other where receptors receive and transduce the signal message in order to coordinate development between the epithelium and mesenchyme. Mesenchymal clusters act as signaling centers and express a variety of developmental morphogens^7-10. Disruption of cluster formation or pattern results in loss of villus emergence and pattern. Inhibition of PDGF signaling results in fewer clusters and fewer villi and those villi that do form are misshapen following the abnormal clusters¹¹. Loss of Hedgehog signaling results in complete loss of cluster formation and failure of villus emergence^2,12. Together, these data demonstrate that clusters coordinate development of the villus epithelium with its mesenchymal core.

Using this whole organ culture system, we are able to alter signaling involved in epithelial-mesenchymal cluster cross-talk to determine the role of those signals in villus morphogenesis. Two-photon confocal optical sectioning and reconstruction afford the ability to visualize cluster formation and villus emergence in three-dimensions and better understand the spatial relationships between the mesenchymal clusters and their overlying epithelium. Extending the culture system to four dimensions, we can capture z-stacks of developing clusters and villi over time and observe these interactions. Ultimately, the ability to follow villus development in this manner and observe changes that occur with altered signaling will revolutionize the understanding of epithelial mesenchymal interactions in villus morphogenesis.

Protocol

הערה: כל העכברים טופלו באנושיות תוך שימוש בפרוטוקולים שאושרו על ידי אוניברסיטת מישיגן בית הספר לרפואת היחידה לבעלי חיים במעבדה לרפואה ובהתאם להנחיות ועדת האוניברסיטה על שימוש וטיפול של בעלי חיים.

מערכת האיברים תרבות .1 שלמה

1. הכנה של תקשורת ותרבות צלחות
   1. בשכונת תרביות רקמה, להסיר 5 מ"ל של תקשורת BGJb ממניות הבקבוק ולהוסיף 5 מ"ל של העט / סטרפטוקוקוס. הכן מלאי עבודה של תקשורת בצינור חרוטי 50 מ"ל, על ידי הוספת 1 מ"ל של 5 מ"ג / מ"ל ​​חומצה אסקורבית ל49 מ"ל של תקשורת BGJb (עם פן / סטרפטוקוקוס).
   2. הכן צלחת תרבות 6 היטב על ידי הוספת 1 מ"ל מתחת לכל של transwells.
      הערה: אם לא השתמש בכל 6 transwells, להעביר transwells נוסף לצלחת 6 היטב סטרילי טרי לשימוש מאוחר יותר. הוסף 3 מ"ל של עבודה תקשורת BGJb לכל אחת משלוש צלחות פטרי 10 סנטימטר סטרילי.
2. הכנה לנתיחה
   1. משרים כלים לנתח בetha 70%נול ולהיות בטוחים כדי לשמור על הכלים נקיים תוך כדי העבודה.
   2. הגדר את האזור לנתח עם דלי קרח גדול ולמקם את צלחת תרבות 6 היטב ו10 פטרי מנות סנטימטר עם תקשורת BGJb על קרח. לעבוד על קרח ככל האפשר, תוך ביתור והכנת המעיים לתרבות.
   3. הרדימי נקבת עכברים בוגרים בתא עם isofluorane (100 μl) לפני euthanization נקע בצוואר הרחם לאסיף מעיים של העובר.
   4. לאחר קצירת העוברים מאמם, לביים כל עובר על פי זהירות לTheiler בימוי תרשים ^13. אין לסמוך על ימים שלאחר משגל-כדי לקבוע את הגיל של כל עובר כוריאציות של עד 24 שעות בשלב התפתחותי הם נצפו באופן שיגרתי בהמלטה אחת.
3. Dissection של מעיים של העובר
   1. להרדים עוברים על ידי עריפת ראש לפני הסרת מעיים.
   2. לנתח כל מעי בשל 1x Dulbecco פוספט שנאגר מלוח (DPBS) ולאחר מכן PLACe אותו לתוך צלחת פטרי 10 סנטימטר עם העבודה תקשורת BGJb.
   3. מוציא בזהירות את הטחול מהבטן והלבלב מהבטן והעליון תריסריון.
   4. בעדינות להפריד את omentum דואג להשאיר את omentum המצורף ככל האפשר ומפריד את הקשרים רק מספיק כדי לאפשר למעי להיות יישר.
      הערה: למעיים מבוגרים מן E14.5 או אלה שתרבית יותר מ24 שעות, בעדינות להפריד את המעי ל3 חלקים שווים, כדי לאפשר לתוכן luminal לזרום דרך המעי ולהיות מגורש מקצות החתך. עם זאת, לתרבויות התחילו לפני E13.5, לחכות עד אחרי 24 שעות של culturing לפני פרידת 3 המגזרים של המעי כדי לאפשר serosa לגדול כראוי על פני האורך של המעי.
   5. השתמש pipet פה כדי להעביר את חתיכות מעיים על transwells של צלחת התרבות (1.1.2).
   6. בעדינות למקם מחדש את המעיים לפי צורך, כך שהם ישר transwell.
      הערה: ברגע שהמעיים מתחילים לנוע תוכן luminal דרך הצינור, סטיות כל במעי יגרמו גיבוי ונזק למעי.
4. תרבות וטיפול
   1. הסר את המדיה מתחת transwell, להוסיף 700 μl של תקשורת טיפול (עבודה תקשורת עם חלבונים הוסיפו רקומביננטי או מעכבים תרופתיים) תחת transwell.
   2. הוסף 300 μl של תקשורת טיפול ירידה מבחינת על גבי המעיים ולאפשר לו לספוג דרך transwell. למקם מחדש את המעיים על פי צורך.
   3. שינוי בתקשורת טיפול לפחות פעם ביום או לעתים קרובות יותר בהתאם לזמן מחצית החיים של מגיב הטיפול.
5. הכנת חרוזים agarose חלבון ספוגה למקור מקומי של מגיב טיפול
   1. Resuspend חרוזים agarose במכל האחסון שלהם ולהעביר את חרוזים agarose 100 μl לתוך צינור 1.5 מ"ל microfuge.
   2. מלא את הנפח הנותר של הצינור עם סטרילי 1x Phosphate שנאגר מלוח (PBS) ומערבבים את החרוזים כדי לשטוף אותם. מניחים את צינור microfuge במעמד לכמה דקות כדי לאפשר חרוזים להתיישב לתחתית ואז pipet את PBS מעל גבי חרוזים. למלא את צינור microfuge עם סטרילי 1x PBS ולחזור על תהליך השטיפה פעמיים נוספת.
   3. הכן את החלבון של עניין בשתי פעמים הריכוז רצוי לטיפול.
   4. מערבבים 5 μl של חרוזים agarose נשטפו עם 5 μl של מניית חלבון 2x ועדינות להתסיס את חרוזים בחלבון. מניחים את הצינור על קרח במשך שעה 1, ערבוב בעדינות כל דקות 10-15.
   5. יש לשטוף את חרוזים קצר בסטרילי 1x PBS לפני הצבת חרוזים במעיים.
6. מיקום של חרוזים agarose
   1. מניח בעדינות את חרוזים agarose על גבי המעיים באמצעות pipet פה עם מחטי נימים משכו. מניחים את חרוזים בזהירות רבה כטיפול אגרסיבי יפגע המעי ולמנוע התפתחות סיסי באזור הפגוע.
   2. הנח חרוזי פעמיים רבים ככל נדרשים לניתוח מאז המעיים יעברו תנועות peristaltic וכמחצית מהחרוזים להציב יגלגל את המעיים על פני זמן culturing.
7. קיבוע של מעיים בתרבית
   1. מוציא בזהירות את תקשורת הטיפול מלמטה transwell ולאפשר את המעיים לייבוש באוויר במשך 3 דקות.
   2. הוסף 1 מ"ל של מקבע תחת transwell למשך 2 דקות, לאחר מכן לכסות את החלק העליון של המעי עם 2 מ"ל של מקבע למשך שארית זמן הקיבעון. לתקן עם 4% O paraformaldehyde / N ב 4 מעלות צלזיוס או לשעה 2 ב RT.

.2 הדמיה של מעיים קבועים

1. הדמיה Wholemount
   1. מניחים את המעיים שלמים (עם הקרינה אנדוגני) בשקופית עם של 1x DPBS 100 μl. שימוש במלקחיים כדי לסדר בעדינות את המעיים.
   2. השתמש במטלית מעבדה כדי להסיר בזהירות את DPBS ומייד להוסיף של גליצרול 70% 100 μl כדי להפוך את מו הרקמהמחדש שקוף ולהגדיל את העומק האפשרי של הדמיה.
      הערה: אם חדירה נוספת של המעי היא רצויה, במקום הרכבה המעי ב70 גליצרול%, להשרות את המעי בכמה טיפות של תמיסת המוקד ברורה ל10-30 דקות. Pipet את פתרון המוקד ברור והר המעי עם הר ברור.
   3. טובלים כל אחת מארבע הפינות של coverslip לפלסטלינה ולהרים כמות קטנה של חומר שישמש כמפרידים בין השקופיות וcoverslip כדי לשמור על coverslip ממשטח את המעי.
   4. לאטום את coverslip לשקופית עם VALAP מומס מיושם עם מקלון צמר גפן.
   5. תמונת המעיים משני מיקרוסקופ confocal זקוף או הפוך. נא עיין בדיון לפרטים נוספים.
2. חתך Vibratome של מעיים קבועים (עבור תצוגת חתך רוחב של מבני מעיים)
   1. מעיים להטביע בagarose 7% בתבניות פלסטיק קטנים (10 x 10 x 15 מ"מ) ולאפשר ללוקי agarose ללצנן ולחזק.
   2. להסיר בלוקים agarose מתבניות הפלסטיק ואובניים agarose הדבק לשלב איסוף vibratome עם דבק מיידי.
   3. מלא את שלב האיסוף עם קרח הקר 1x DPBS.
   4. לחתוך חלקים בעובי בין 100-150 מיקרומטר. עבור חלקים עבים יותר להשתמש בפתרוני סליקה (שתוארו בסעיף 2.1.2) כדי לחזות עמוק יותר לתוך החתך.
   5. יוצקים vibratome חלקים מהשלב האיסוף לתוך באר של צלחת 6 היטב לאחסון ב 4 ° C..
3. מכתים immunofluorescence של רקמות קבועות, מחולק vibratome
   1. הנח 5-12 חלקים vibratome לכל גם לתוך צלחת 24 גם עם 1x DPBS.
   2. הסר 1x DPBS ולהוסיף 500 μl של פתרון permeabilization בכל טוב. נער בעדינות את הדגימות ל25 דקות ב RT.
   3. לאחר permeabilization, לשטוף את הדגימות 3 פעמים עם 1x PBS.
   4. חסום את הדגימות לפחות 30 דקות ב500 μl של חסימת פתרון.
   5. לאחר חסימה, דוארXchange פתרון החסימה עם 500 μl של הנוגדנים עיקריים בדילול מלא בחסימת פתרון ולשמור את הדגימות על 4 מעלות CO / N.
      הערה: דילולים הנוגדן הראשוניים שפועלים היטב על חלקים קפואים ופרפין בדרך כלל עובדים גם על vibratome סעיפים מדי, לעומת זאת נוגדנים הדורשים אחזור אנטיגן גרעיני בדרך כלל לא עובד טוב עם פרוטוקול זה (למשל, BrdU).
   6. למחרת, לשטוף את הדגימות 3 פעמים במשך 15 דקות בכל פעם עם פתרון חסימה.
   7. לאחר כביסה, להחיל 500 μl של הנוגדנים משני בדילול מלא בחסימת פתרון. לעטוף את צלחת 24 גם בנייר אלומיניום כדי להגן fluorophores מן האור ולטלטל את הדגימות ל45 דקות לשעה 2 ב RT.
   8. שטוף את הדגימות 3 פעמים עם 1x PBS ל15 דקות כל אחד והר חלקי vibratome בשקופיות כפי שתואר בסעיף 2.4.
4. הרכבה חלקי vibratome
   1. הכן שקופיות עבור vibratome הרכבה על ידי חיתוך פרוסות דקות של כפול STIקלטת ck ומציב אותם בצדי המגלשות הארוכים.
   2. בזהירות להניח 5-10 חלקי vibratome בין הקלטת דו המקל בשקופיות בירידה של של 1x PBS 100 μl.
   3. לפתוח את כל החלקים ולהפיץ אותם לשכבה אחת על פני השקופית.
   4. הסר את כל agarose עודף או חתיכות לא אחידות שימנע coverslip מיושב שטוח.
   5. להשתמש בזהירות רקמת מעבדה כדי לספוג את עודף 1x PBS מכל רחבי חלקי vibratome.
   6. הוסף טיפה של מדיום גובר מימיים על גבי חלקי vibratome ולאחר מכן coverslip.
   7. חותם את coverslips על השקופיות עם נמס VALAP מיושם עם מקלון צמר גפן.
   8. תמונת חלקי vibratome משני מיקרוסקופ confocal זקוף או הפוך. נא עיין בדיון לפרטים נוספים על בחירה של מערכת הדמיה.

.3 הדמיה חיה של מעיים שלמים

מעיים שנקטפו מן fetuseים לאחר E12.5, עם omentum המחובר נותר בשלמותו, לפתח בהצלחה villi בתרבות שימוש במערכת לעיל. לכן, מערכת זו vivo לשעבר מאפשרת הלכידה של תמונות z-סעיף חיים של המעיים פיתוח שניתן לשחזר לתצוגה תלת ממדית של המורפוגנזה לאורך זמן.

1. הגדרת הדמיה חיה
   1. השתמש בדבק מיידי לדבוק קרום פוליקרבונט פרט למסך רשת בסדר. זה מספק פיגום תמיכה כדי להחזיק את המעי במקום מתחת לעדשת הטבילה של המיקרוסקופ confocal הזקוף. נא עיין בסעיף הדיון לפרטים נוספים על בחירה של מיקרוסקופי הדמיה לחיות.
   2. הנח את מסך הרשת במרכז גם צלחת תרבות.
   3. הנח את המעי גזור על הממברנה פוליקרבונט ולהוסיף טיפה של דבק מיידי בכל צד. השתמש אך ורק מספיק דבק להדביק המעי, אבל זה לא מעיל!
   4. להוסיף חופשי תקשורת ותרבות של פנול אדום מתחת לפוליקרבונטקרום במרכז גם מצלחת התרבות.
   5. מוסיף מים עד לשפה החיצונית של צלחת התרבות כדי לספק לחות.
   6. מאז המעי העוברי עובר גלים כמו נפיחה של התכווצות בתרבות, להוסיף של 1 100 μl: פתרון 5 של xylazine ב1x PBS עד 3 מ"ל של תקשורת כדי לשלוט בתנועה של המעי תוך הדמיה. מינון זה לשלוט בתנועות מעיים במשך כ8-10 שעה מבלי להתפשר על פיתוח סיסי.
   7. לתצוגה רוחבית של המעי, להטביע את המעיים חיים בפתרון agarose 3-4% ולחתוך חלקים עבים (150-500 מיקרומטר) על vibratome. התאם את הנוקשות של agarose עם הקשיחות של המעי נחתך ואמפיריים נקבע השלב ההתפתחותי. באופן כללי, פתרון agarose 3% עובד היטב עבור מעיים צעירים מן E14.5 ופתרון 4% עובד היטב עבור המעיים E15-E16.
   8. מדביק את חלקי vibratome לקרום פוליקרבונט מודבקים מסך רשת (כמו בסעיף 3.1.1) והתרבות כפי שתוארה בסעיף 3.1.2-3.1.6.
   9. לנהל את ההדמיה בשידור החי באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים confocal הקרינה (לייזר עירור בין 690-1,040 ננומטר) על עמדה זקופה עם שולחן מתכונן.
   10. לייזר שני פוטונים מכוון ל900 ננומטר מספק חדירה עמוקה עם הרזולוציה הטובה ביותר עבור אותות GFP. זה מפחית את נזק לרקמות בזמן ההדמיה. בנוסף, הגדרת כוחו של הלייזר לפליטה הנמוכה ביותר האפשרית מפחיתה נזק לרקמות. בדרך כלל כדי להשיג עירור טוב של GFP, להשתמש 12% כוח בליזר שני פוטונים.

תוצאות

תרבות של explants של מעיים של העובר כולו מאפשרת לניתוחים של המיקום, הפצה, ומשך הזמן של מולקולות האיתות שלתאם פיתוח מעיים, כמערכת זו מאפשרת המניפולציה של האיתות עם ריאגנטים תרופתיים או חלבונים רקומביננטי. מערכת תרבות transwell (איור 1 א, לשכפל ומולטון et al., 2012) ²

Discussion

האופי הדינמי ואינטראקציות רקמה מורכבות של המעי המתפתח דורשים 3D להדמיה יש הערכה מלאה של אירועי המוךפו"גנטי אלה. עם התפתחות טכנולוגיית הדמיה, היכולת לבחון המורפוגנזה סיסי בפירוט מפתחת / שיפור ועם זה, ההבנה של התקשורת ואינטראקציה מרחבית במהלך organogenesis היא מאוד משופרת....

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fine dissecting forceps	Fine Science Tools	11254-20	2 pairs
70% Ethanol
1x sterile Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14040-133	500 ml
6 well plates	Costar	3516
24 well plates	Costar	3524
60 x 15 mm petri dishes	Falcon	451007
Transwell plates, 24 mm inserts, 8.0 mm polycarbonate membranes	Corning Costar	3428	6 inserts per plate
BGJb media	Invitrogen	12591-038	500 ml
PenStrep (10,000U/ml Penicillin; 10,000 mg/ml Streptomycin)	Gibco	15140
Ascorbic Acid	Sigma	A0278	make 5 mg/ml stock, filter, aliquot and store at -20 °C
Mouth pipet (Drummond 1-15 inch aspirator tube assembly)	Fisher	21-180-10	remove the aspirator assembly and replace it with a 1,000 µl pipet tip which acts as an adaptor to plug in a 6 inch glass Pasteur pipet.
6 inch glass pasteur pipets
Capillary Tubes	World Precision Instruments	TW100F-4	pull to needles
4% Paraformaldehyde			made in 1 x PBS, pH to 7.3
Culture plates	Falcon	353037
Fine mesh stainless steel screen	purchase at hardware store
Polycarbonate membranes	Thomas scientific	4663H25	alternatively, cut Corning Costar 3428 membranes off of transwell supports
Instant glue	purchase at hardware store	gel based preferrably
35 x 10 mm plates	Falcon	351008
7% agarose	Sigma	A9414	prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath
minutien pins	Fine Science Tools	26002-20
Phenol red free media (DMEM)	Gibco	21063-029
Xylazine (100 mg/ml)	AnaSed	139-236
Matrigel	BD	356231	basement membrane matrix, growth factor reduced, phenol red-free
3-4% agarose	Sigma	A9414	prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath
Imaging of fixed intestines
Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
vaseline	purchase at pharmacy		used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin
lanolin	Sigma	L7387	used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin
paraffin	Surgipath	39601006	used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin
70% glycerol in 1 x PBS
Focus clear and Mount Clear	CelExplorer Labs Co.	F101-KIT
Modeling clay	purchase at art supply store
double stick tape
cotton applicator swabs
plastic molds, 10mm x 10mm x 5 mm)	Tissue Tek	4565
slides
coverslips
lab wipe	Kimberly Clark	34155	lint free delicate task wipe
Theiler staging chart			http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/ downloads/theiler2.pdf
Leica SP5X confocal microscope	Leica		Used to conduct the live imaging
Leica DMI 6000 stand	Leica		Used to conduct the live imaging
Aqueous mounting medium (Prolong Gold)	Molecular Probes	P36930
Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
24 well plate	Costar	3524
Triton X-100	Sigma	T-8787	used to make Permeabilization solution: 0.5% Triton X-100 in 1 x PBS
Goat serum			used to make Blocking Solution: 4% Goat serum, 0.1% Tween20 in 1x PBS
Tween20	Sigma	P9416