תרבויות Organotypic Slice ללמוד oligodendrocyte Dynamics וmyelination

Summary

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Abstract

תאי NG2 להביע (polydendrocytes, תאי מבשר oligodendrocyte) הם אוכלוסיית תאי גלייה הגדולה הרביעית במערכת העצבים המרכזית. במהלך התפתחות עוברית ואחרי לידה הם פעילים להתרבות וליצור oligodendrocytes myelinating. תאים אלה בדרך כלל נחקרו בתרבויות עיקריות ניתקו, cocultures נוירון, וברקמות קבועות. קווים מהונדסים זמינים עתה באמצעות עכבר פורסים מערכות תרבות יכולות לשמש כדי לחקור התפשטות והתמיינות של תאי שושלת oligodendrocyte בשני אזורי החומר האפורים ולבנים של המוח הקדמי ובמוח קטן. תרבויות פרוסה מוכנות מעכברים לאחר לידה מוקדמות ונשמרות בתרבות לתקופה של עד חודש 1. ניתן הדמיה פרוסות אלה מספר רב של פעמים על פני תקופת התרבות לחקור את התנהגות ואינטראקציות הסלולר. שיטה זו מאפשרת הדמיה של חלוקת תא NG2 ואת המדרגות מובילות לבידול oligodendrocyte תוך שהוא מאפשר ניתוח מפורט של אזור-תלויהתא ent NG2 והטרוגניות פונקציונלית oligodendrocyte. זוהי טכניקה רבת עוצמה שיכול לשמש כדי לחקור את האותות הפנימיים וחיצוניים המשפיעים על תאים אלה לאורך הזמן בסביבה סלולרית שדומה מאוד שמצאו in vivo.

Introduction

תרבויות פרוסה Organoytpic של מערכת העצבים המרכזית הוכיחו להיות מאוד שימושי לחקר תא עצב וביולוגיה של תא גליה במערכת semiintact ^{1 - 4.} תרבויות אלה הן פשוטות יחסית לאמץ ולשמור על יתרונות רבים של תרביות תאים ניתק עיקריות כגון מניפולציה של הסביבה תאית וגישה קלה להדמית תא חי לטווח ארוך חוזר ונשנה וקלטות אלקטרו ^{5 - 9.} בנוסף, תרבויות פרוסה לשמור cytoarchitecture רקמה 3 ממדים, קישוריות עצבית אזורית, ואת רוב סוגי תאים קיימים במערכת. תכונות אלו הופכות את תרבויות אלה מערכת ייחודית ונוחה לחקור בודדת התנהגות תא ופיזיולוגיה עם אינטראקציות הסלולר וסביבתיות.

תאי NG2 הם אוכלוסייה של תאי גליה במערכת העצבים המרכזית של היונקים שממשיכות להתרבות וליצור מ 'yelinating oligodendrocytes במהלך עוברי ולאחר לידה פיתוח ^10. הם נחקרו רבים בתרביות תאים ראשוניים ניתק, והפיתוח האחרון של קווי עכבר מהונדסים עם ביטוי תא ספציפי NG2 של חלבוני ניאון יש להקל במיפוי גורל vivo וקלטות אלקטרו בהכנות פרוסה חריפות. גם בלימודים אלה, מעט מאוד ידוע על הדינמיקה הזמנית של התפשטות תאי NG2 ובידול oligodendrocyte. למרות שתרבית תאים ניתקים היא בשימוש נרחב למתקן היחסי במניפולציות תרופתית וגנטיות, זה לא מתאים לחקירת הבדלים פונקציונליים של תאים אלה באזורי מוח שונים ובמיוחד כאשר הוא רצוי לשמור על ההקשר של microenvironment הסלולרי. תרבויות פרוסה לספק אלטרנטיבה פשוטה שניתנים למניפולציות תרופתיים והיה בשימוש כדי לחקור myelination oligodendrocyte ^11,12, תאתגובת ular לאחר lysolecithin (LPC) או נוגדן מושרה פגיעה במיאלין ^13,14, ואינדוקציה של חידוש יצירת המיאלין באמצעות טיפול תרופתי ^15.

שיטה לחקור ולבצע הדמיה חיה ורקמות קבועות (או postfixation) ניתוח של התפשטות NG2 והתמיינות של תאי oligodendrocyte בתרבויות פרוסה organotypic נלקחו משני המוח הקדמי ובמוח הקטן מתוארת. זוהי שיטה רבת עוצמה שיכול לשמש כדי לחקור את גורל התא של תאי NG2 אחד לאחר חלוקת ¹⁶ ולגלות הבדלי region- ותלוי גיל בהתפשטות תאי NG2 המושרה גורם גדילה ^17. טכניקה פשוטה יחסית זו היא נגישה לציבור רחב כדי לחקור תא נוסף פנימי ו / או סביבתי מנגנונים המסדירים את הפיסיולוגיה של תאי גליה אלה ותגובתם לפעילות עצבית או נזק המיאלין.

Protocol

הערה: כל נהלי בעלי החיים פועלים בהתאם להנחיות ואושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) באוניברסיטת קונטיקט.

הערה: בניסויים אלה (JAX # 008,538) המכוננים NG2cre ¹⁸ (JAX # 008,533) ועין מתנהלת NG2creER ¹⁶ עכברים הטרנסגניים חצו לZ / EG ¹⁹ (JAX # 003,920) או gtRosa26: בהתאמה שמשו כתב YFP (# 006,148 JAX) קווי ²⁰ לתאי NG2 תמונה וצאצאיהם. לoligodendrocytes הבוגרת תמונה, עכברים הטרנסגניים PLPDsRed ²¹ היו בשימוש. להישרדות עולה בקנה אחד, יכולות להיות מבודדות מעכברי פרוסות עד לאחר לידה יום 10 משני המוח הקדמי ובמוח הקטן.

.1 Slice הכנה

1. במנדף תרבות, המקום מוסיף תרבית רקמה בשש צלחות גם ולהוסיף בינוני 1 מ"ל פרוסת תרבות (מתכון בסעיף חומרים כימיים). שים את הצלחות בחממת תרבות תא ב37 ° C עם 5% CO ₂ לפחות 2 שעות לפני לנתיחה.
2. לעקר את כל הכלים ומסוק רקמות עם 70% אתנול.
3. חיץ בועת דיסקציה (מתכון בסעיף חומרים כימיים) עם 95% O _2, 5% CO ₂ על קרח לפחות 15 דקות לפני תחילת הנתיחה.
4. הרדימי גורי עכבר על ידי הצבת אותם על קרח ל5-10 דקות על פי פרוטוקולים של בעלי חיים שאושרו. לברר את העומק המתאים של הרדמה על ידי המאשר כי העכברים אינם מגיבים לזנב וצביטת הבוהן.
5. לערוף בעלי חיים באמצעות מספריים חדים בעקבות פרוטוקולים של בעלי חיים. להסיר במהירות את הגולגולת מעל המוח הקדמי ובמוח הקטן על ידי ביצוע חתך sagittal ואחריו חתך לרוחב, תוך שימוש בכלים מעוקרים הראשון. לחתוך עצבי גולגולת מפני שטח הגחון של המוח והמוח הקטן על ידי גלגול הרקמה לצד בזהירות.
6. הנח רקמה בצלחת 35 מ"מ סטרילית המכילה מאגר נתיחת חומצן קר כקרח.
7. באמצעות סכין גילוח, לנתק את המוח הקטן ומוח קדמי. ואז לעשות חתך באמצע sagittal throאיכס המוח הקדמי ובמוח קטן, שמפריד בין האונות.
8. חותך 300 סעיפי העטרה וsagittal מיקרומטר בעובי של המוח הקדמי ובמוח קטן עם מסוק רקמה ידני. הערה: מסוק רקמה ידני מאפשר עיבוד מהיר מנתיחה כדי דגירה התרבות ללא הצורך בהטבעת agarose. גם vibratome יכול לשמש כפי שתואר לעיל ^9.
9. העבר את הפרוסות מופרדות לחיץ לנתיחה קרה טרי מבעבע על קרח.
10. השתמש לנתח קטן או במשקל מריות להפריד חלקים בודדים ולהעבירם לpreincubated שש מנות היטב עם התרבות מוסיף.
11. הסר את כל חיץ נתיחה עודף מפני שטח של להכניס את התרבות באמצעות פיפטה העברה חד פעמית או קצה pipet P 200. שתיים עד שלושה מוח קדמי או שלוש פרוסות של מוח קטנים יכולים להיות ממוקמים על להכניס את התרבות אחד.
    הערה: לקבלת תוצאות בקנה אחד עם תרבויות מוח קדמיות, הוא אידיאלי לקחת פרוסות פורש קדמי שליש מכפיס המוח(איור 1 א) כדי ללמוד את שני אזורי החומר האפורים ולבנים באותו פרוסה. כל בעל חיים, בדרך כלל מניב 6 פרוסות מוח קדמיות ו6 פרוסות המוח הקטן.
12. מניחים את שש הצלחות גם בחממה ולהחליף את המדיום פרוס עם 1 מ"ל של מדיום פרוס יום 1 לאחר הכנת פרוסה ולאחר מכן בכל יום אחר, עד שקיבעון פרוסה.
13. בהתאם לניסוי, להשתמש פרוסות אחרי 5-7 ימים בתרבות. השתמש רק בפרוסות שנעשות שקוף לאחר הימים הראשונים וזורקים אותם שיש להם אזורים אטומים אחידים. הערה: אזורים אטומים בתוך פרוסות נראים על ידי העין ומופיעים כגוש של תאים שחורים מתחת לניגוד שלב. לאחר הטכניקה כבר שולטת, פרוסות אטומות מתות מתרחשות רק לעתים נדירות, בפחות מ 1-5% מפרוסות.

2 זמן לשגות הדמיה של חלוקת תא NG2 וoligodendrocyte בידול

הערה: כדי לבצע הדמיה זמן לשגות של התפשטות תאי NG2 ובידול אנו משתמשים NG2cre: עכברי ZEG ¹⁶המבטא EGFP בתאי NG2 וצאצאיהם (תרשים 1C-E). ביטוי עיתונאי בתחום הזה הוא מספיק חזק כדי להשיג תמונות חיות של GFP + תאים בפרוסות מייד לאחר חתך לתקופה של לפחות ארבעה שבועות זמן. התמונות הברורות ביותר מתקבלות לאחר תקופת הדילול הראשונית של הפרוסה, אשר מתרחשת על 3-5 הימים הראשונים בתרבות.

1. לאורך כל הניסוי, לשמור את הפרוסות בתרבית תאי חממה ב 37 מעלות צלזיוס ולהסיר רק לפרקי זמן קצרים (פחות מ -15 דקות לכל פרוסה), שמירה על המכסה על הצלחת גם שש תוך הדמיה.
2. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך מצוידים במצלמה דיגיטלית, ללכוד תמונות בנקודת הזמן הראשונה באמצעות מטרת 10X. הערה: נקודות בפעם ראשונה משתנות בהתאם לניסוי ויכול להיות היום שבו את הפרוסות הוכנו או כל נקודה לאחר זמן.
3. צלם תמונות מאזורים מרובים בנקודה אחת בזמן בשני אזורי החומר האפורים ולבנים של הפרוסה. ה הערהאזור הדואר צילם על ידי ציוני דרך ספציפיות בתוך הפרוסה ועל ידי מיפוי מיקום תמונה על סכמטי שיכול לשמש לפגישות הדמיה הבאות. ציוני דרך שימושיים יכול לכלול קצוות של הפרוסות ו / או נטייה של שטחים בחומר לבנים. תמונה 7:56 מקומות על כל פרוסה בכל נקודת זמן.
4. צלם תמונות שלאחר מכן בהפרש של 4-6 hr אם בוחנים חלוקת תאי NG2 ובידול oligodendrocyte, באופן אידיאלי על 5-7 ימים.
5. ללכוד תמונה סופית של כל האזורים ולתקן את הפרוסות באופן מיידי. הוסף 1 מ"ל של מקבע (PFA 4% עם 0.1M l-ליזין meta-periodate 0.01 M נתרן) לתחתית להכניס את התרבות, ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל נוסף על גבי פרוסות. יש להיזהר שלא להשפריץ מקבע ישירות על הפרוסה כפי שהוא יכול להתנתק מהקרום. לתקן את הרקמות ל30 דקות ולהמשיך עם אימונוהיסטוכימיה באמצעות סמנים בשלב מסוים התפתחותי כפי שתואר בסעיף 4.
6. פרוסות לשטוף עם חיץ פוספט 0.2 M נתרן 3 x 10 מ 'ב. אם פרוסות נחוצות, לאחסן ב 4 ° C ב0.2 חיץ פוספט M נתרן ל1-3 ימים לפני immunostaining אבל באופן אידיאלי לבצע צביעה בתוך 24 שעות. להמשיך עם אימונוהיסטוכימיה כמתואר להלן בסעיף 4 על מנת לקבוע את חלקם של תאים שמובחנים לoligodendrocytes (איור 2 ד-F).

.3 גורל מיפוי של צאצאיהם של תאי NG2 באמצעות עכברים והעין מתנהל כתב מהונדס בתרבויות פרוסה

הערה: כדי לעקוב אחר גורלם של תאי NG2 מנקודת זמן מסוים בתרבות, NG2creER מושרה: ניתן להשתמש בעכברים מהונדסים YFP.

1. לגרום רקומבינציה Cre וביטוי עיתונאי על ידי הוספת 100 4OHT ננומטר מומס באתנול למדיום התרבות. הערה: תאים חיוביים Reporter אמורים להופיע בטווח של 1-2 ימים ביעילות גיוס של ~ 20-25% YFP + NG2 + / NG2 + תאים ובנקודה זו בזמן הכול יהיו תאים בשלב תא NG2 (איור 2A-C)
2. לתקן ולשטוף את הפרוסהים בנקודות זמן שונה לאחר מניפולציות שונות (כמתואר בסעיפים 2.5 ו2.6).

.4 Slice אימונוהיסטוכימיה

1. חותך את הקרומים עם פרוסות המצורפות מתוך מוסיף באמצעות אזמל.
2. העבר את הפרוסות לבארות בודדות של מלח 24 פוספט צלחת המכילה גם סליין (PBS) באמצעות סדרה של פינצטה, נזהר שלא לשבש את ההרכב של הפרוסה כאשר מרים את הקרום.
3. העבר את הפרוסות לצלחת גם 24 עם חסימת תמיסה המכילה 5% עזים בסרום נורמלי (NGS) ו0.1% Triton-X100 בPBS עבור שעה 1.
4. דגירה את הפרוסות בO נוגדן הראשוני / N ב5 NGS% PBS על 4 מעלות צלזיוס. לזיהוי תאים בשלב תא NG2, להשתמש נוגדנים לNG2 וPDGFRα. לזיהוי oligodendrocytes מובחנת, להשתמש נוגדן לאנטיגן coli polyposis adenomatous (APC; גג 1 'שיבוט).
5. על פרוסות לשטוף היום השניה בדקות 3 x15 PBS, אז דגירה בantibo המשניתמת ב5 NGS% PBS עבור שעה 1 ב RT. לשטוף פרוסות בPBS 3 דקות x15 והר בשקופיות. הר עם פרוסות וקרום מול השקופיות, כך שהקרום לא יהיה בין המטרה והרקמה.

תוצאות

דוגמאות לנתוני נציג הם כדלקמן שהתקבלו באמצעות תרבויות פרוסה משני המוח הקדמי ובמוח הקטן של P8 NG2cre: ZEG, NG2creER: YFP וPLPDsRed קווי עכבר מהונדסים. ניתן הדמיה תאי NG2 מעל ימים במוח קדמי ובמוח קטן פרוסות (איור 1 ב-D, 1 וידאו) ואת הפנוטיפ של תאים אלה ניתן לקבוע לאחר הקיבוע וimmunostain...

Discussion

Myelination במערכת העצבים המרכזית הוא חיוני לתקשורת עצבית יעילה והישרדות axonal ^22. תאי NG2 ברציפות ליצור oligodendrocytes myelinating לבגרות תוך שמירה על אוכלוסיית תושב באזורים במוח ביותר ^{16,23 - 25.} כמה מנגנונים גנטיים ומולקולריים המסדירים את ההתמיינות של תאים אלו תוארו אבל הרבה ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Slice Culture Medium
Minimum Essential Medium	Invitrogen	11090	50%
Hank’s Balanced Salt Solution	Invitrogen	14175	25%
HEPES	Sigma-Aldrich	H-4034	25mM
L-Glutamine	Invitrogen	25030	1mM
Insulin	Sigma-Aldrich	I6634	1mg/L
Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A-0278	0.4mM
Horse Serum	Hyclone	SH30074.03	25%
Titrate to pH 7.22 with NaOH, filter with bottle top filter, and store at 4 degrees Celsius
Dissection Buffer
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	124mM
KCl	Sigma-Aldrich	P5405	3.004mM
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655	1.25mM
MgSO4 (anhydrous)	Sigma-Aldrich	M7506	4.004mM
CaCl2 2H2O	Sigma-Aldrich	C7902	2mM
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761	26mM
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021	10mM
Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A-0278	2.0mM
Adenosine	Sigma-Aldrich	A4036	0.075mM
Filter with bottle top filter and store at 4 degrees Celsius, oxygenate with 95%O2 5%CO2 before use
Other Reagents and Supplies
4-hydroxy tamoxifen (4OHT)	Sigma-Aldrich	H7904	100nM
Paraformaldehyde (PFA)	EM Sciences	19200	4%
L-Lysine	Sigma-Aldrich	L-6027	0.1M
Sodium Metaperiodate	Sigma-Aldrich	S-1878	0.01M
Rabbit anti NG2 antibody	Chemicon (Millipore)	AB5320	1:500
Mouse anti CC1 antibody	Calbiochem (Millipore)	OP80	1:200
Mouse anti Ki67 antibody	Vision Biosystems	NCL-Ki67-MM1	1:300
Mouse anti NeuN antibody	Chemicon (Millipore)	MAB377	1:500
Species specific secondary antibodies	Jackson Immunoresearch
Normal Goat Serum (NGS)			5%
Triton X-100			0.10%
Mounting medium with DAPI	Vector Labs	H-1200
Millicell culture membrane inserts 0.45μm pore size	Fisher Scientific	PICM03050
Bottle top filters	Fisher Scientific	09-740-25E
Ethanol
95% O2 5% CO2 gas mix
Phosphate Buffered Saline (PBS)
Sterile six well plates
Dissecting (hippocampal) or weighing spatulas
Manual or automatic tissue chopper
Razor blades
Disposable transfer pipettes
35mm and 60mm sterile Petri dishes
Stereomicroscope
Inverted Phase Microscope
Laminar Flow Hood
Tissue Culture Incubator
Inverted Fluorescence Microcope