הקפאה בלחץ גבוהה טנדם ומהיר הקפאת חילוף של צמח רקמות למיקרוסקופים אלקטרונים חודרים

Summary

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

Abstract

מאז מיקרוסקופ האלקטרונים ההילוכים 1940s (TEM) היה לספק ביולוגים עם תמונות רזולוציה גבוהה במיוחד של חומרים ביולוגיים. ובכל זאת, בגלל פרוטוקולים מייגע וגוזל זמן שגם דורשים ניסיון בהכנת דגימות נטול חפץ, TEM אינו נחשב טכניקה ידידותית למשתמש. הכנת מדגם מסורתית לTEM משמשת fixatives הכימי לשימור מבנים הסלולר. הקפאה בלחץ גבוהה היא cryofixation של דגימות ביולוגיות תחת לחצים גבוהים כדי לייצר שיעורי קירור מהירים מאוד, ובכך מגביל את היווצרות קרח, שהוא מזיק לשלמות ultrastructure הסלולרי. הקפאה בלחץ גבוהה ותחלופת הקפאה כרגע שיטות בחירה להפקת המורפולוגיה באיכות הגבוהה ביותר בסעיפי שרף עבור TEM. שיטות אלו למזער את החפצים קשורים בדרך כלל עם עיבוד קונבנציונלי לTEM של חלקים דקים. לאחר cryofixation המים קפואים במדגם מוחלפים בנוזלממס אורגני בטמפרטורות נמוכות, תהליך הנקרא חילוף הקפאה. החלפת הקפאה מבוצעת בדרך כלל על פני כמה ימים בציוד ייעודי, יקר. חידוש האחרון מאפשר לתהליך להסתיים בשלוש שעות, במקום שני הימים הרגילים. זה ואחריו בדרך כלל על ידי עוד כמה ימים של הכנת מדגם הכוללת חדירה והטבעה בשרף אפוקסי לפני חתך. כאן אנו מציגים פרוטוקול שילוב הקפאה בלחץ גבוה ותחלופת הקפאה מהירה המאפשרת קיבוע מדגם צמח כדי להיות מושלם בתוך שעות. הפרוטוקול יכול בקלות להיות מותאם לעבודה עם רקמות או אורגניזמים אחרים. רקמות צמח הן בעלי עניין מיוחד בגלל הנוכחות של חללי סודה ווקואולות מלא מים המונעים הקפאת קרח חינם של מים. בנוסף, התהליך של קיבוע כימי הנו ארוך במיוחד בצמחים בשל קירות תא המעכבים את החדירה של הכימיקלים לעמוקים בתוך הרקמות. רקמות צמח ולכן particularly מאתגר, אך פרוטוקול זה הוא אמין ומייצר דגימות באיכות הגבוהה ביותר.

Introduction

הידע של ultrastructure התא שלנו מגיע בעיקר ממיקרוסקופ אלקטרונים, אשר יכולה לפתור את הפרטים בטווח של ננומטרים ספורים ^1. למרות היותו כל כך חזק בTEM רזולוציה אינו נחשב ידידותי למשתמש, כהכנת מדגם דורשת זמן רב ופרוטוקולים מייגע, ודורשת מומחיות כלשהי מהרופא. קיבעון מסורתי של דגימות יש בשילוב השימוש באלדהידים וtetroxide אוסמיום לפני עיבוד נוסף הכולל התייבשות, הטבעה בשרף ולאחר מכן חתך לייצר חלקים דקים במיוחד שלאחר מכן מוכתמים במתכות כבדות. עם זאת, ידוע כי קיבעון כימי יכול לייצר חפצים כוללים צבירת חלבון ואובדן של שומני ^1, ושינויים בממברנות שסופו של דבר משפיעים על מספר תאים סלולריים ^2. ממצאים אלה מיוחסים במידה רבה לקצב האיטי של קיבעון והתייבשות בטמפרטורת חדר ^{3, 4, 5.}

"Jove_content"> Cryofixation על ידי לחץ גבוה הקפאה (HPF) נמנע מרוב החפצים שנגרמו על ידי קיבוע כימי. עיקרון cryofixation הוא שזה מוריד את נקודת הקיפאון של מים על ידי 20 מעלות, מאיטה את ההתגרענות והצמיחה של גבישי קרח ומגביר את הצמיגות של מים בדגימה ביולוגית, כך שמרכיבים הסלולר בעצם הם משותקים ^{6, 7.} HPF יורד של מדגם טמפרטורה לזו של חנקן נוזלי, בלחץ גבוה מאוד (210 מגפ"ס או 2,100 בר) באלפיות שני. כאשר נעשה כראוי HPF מונע היווצרות של גבישי קרח גדולים שיכול לגרום נזק גדול לultrastructure תא. HPF ניתן להשתמש כדי לתקן את הדגימות של 100-200 עובי מיקרומטר בריכוזים טיפוסיים של מומסים ביולוגיים ^7. ישנם מספר רב של ביקורות על הפיזיקה ועקרונות שבבסיס HPF, למשל ^{1, 7, 8.}

לאחר HPF, דגימות מודגרת בטמפרטורה נמוכה (-78.5 ° C ל -90 &# 176; C) בנוכחות fixatives הנוזל האורגני ממס המכיל חומר כימי כמו tetroxide אוסמיום, בדרך כלל לכמה ימים. בטמפרטורה נמוכה זו, המים במדגם הוא הוחלף על ידי הממס האורגני, בדרך כלל אצטון או מתנול ^{1, 9.} לפיכך, תהליך זה נקרא החלפת הקפאה (FS). המדגם אז חימם בהדרגה ובמשך הזמן הזה הוא קבוע, בדרך כלל עם tetroxide אוסמיום וuranyl אצטט ^9. יש crosslinking בטמפרטורות נמוכות היתרון של תיקון מולקולות שהם משותקים ^1. FS לכן מייצר דגימות באיכות מעולה בהשוואה לאלו שנקבעו על ידי קיבוע כימי קונבנציונלי בטמפרטורת חדר, במיוחד שזה גורם לשימור ultrastructural משופר, שימור טוב יותר של antigenicity והפחית את ההפסד של רכיבים מאוגדים סלולריים ^{10, 11.}

רוב FS מתבצע על פני תקופות זמן ארוכות, בדרך כלל עד מספר ימים. הדבר נכון במיוחד Truדואר עבור דגימות צמחים ^{12, 13, 14.} פרוטוקול האחרון שפותח על ידי מקדונלד 'ס והווב מקטין באופן משמעותי את הזמן לFS מכמה ימים לכמה שעות ^15. בהליך שלהם מהיר תחלופה הקפאה (QFS), FS מתבצע מעל 3 שעות, ואילו בFS סופר מהיר דגימות (SQFS) מעובדות ב90 דקות. האיכות של דגימות המיוצרות על ידי שיטות אלה היא דומה לאלה שהניבו על ידי פרוטוקולי FS מסורתיים. אנחנו אימצנו את פרוטוקול QFS לעיבוד במורד הזרם של דגימות צמח לאחר HPF. זה הוכיח עצמו כדי להציל את לא רק זמן אלא גם כסף, כQFS וSQFS להשתמש בציוד מעבדה משותף במקום מכונות FS הזמינות מסחרי יקרות.

רקמות צמח הן לעתים קרובות מאוד מאתגרות כדי להתכונן לTEM. בממוצע, תאי צמח הם גדולים יותר מאשר כל אחד תאי חיידקים או בעלי חיים. הנוכחות של ציפורן הידרופובי שעווה, קירות תא עבים, וקואולות מלא מים גדולים המכילה חומצות, hydrolases אורגני ופנוליות גompounds שעשוי לכבוש עד 90% מכלל נפח התא ^16, ואת הנוכחות של חללי סודה קשה מקטינה את מוליכות חום של המערכת ^17. יתר על כן, במקרה של צמחים, עובי המדגם כמעט תמיד עולה על 20 מיקרומטר, המגבלה לשימוש בקיבוע כימי. בעוביים אלה, מוליכות החום הנמוכה של מים מונעים שיעור הקפאה יותר מ -10000 ° C / sec במרכז המדגם. השיעור שנדרש כדי למנוע היווצרות מזיקה משושה קרח (גבישי קרח עם צפיפות נמוכה יותר וגדולות יותר מ10 עד 15 ננומטר) ^8. יחד, אתגרי הווה אלה לשתי ההקפאה הנכונה של המדגם וFS שלאחר מכן. יחד עם זאת, cryofixation היא השיטה הטובה ביותר לתיקון דגימות צמח. הנה פרוטוקול לHPF-QFS של דגימות רקמת צמח מוצג. הוא מתמקד בthaliana ארבידופסיס מיני מודל, אלא גם נוצל בעבר עם benthamiana Nicotiana. התוצאות האופייניות להוכיח כי HPF-QFS מייצרת samples באיכות דומה לHPF-FS המסורתי בשבריר של הזמן. עם התאמות נכונים, פרוטוקול זה יכול לשמש גם עבור דגימות ביולוגיות עבות יחסית אחרות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הערה: הליך QFS דורש טיפול קיצוני וזהירות על ידי המשתמש ואנו מדגישים אמצעי בטיחות אלה כאן כהתראות והערות היכן שאפשר.

1.Preparation לHPF הפעלה

1. לפני שיתחיל בהכנת מדגם, להפעיל את המקפיא בלחץ גבוה הבאים הוראות יצרן.
   הערה: יחידת HPF שימוש בפרוטוקול זה היא יחידת Wohlwend הקומפקטי 02 (איור 1 א), וזה לוקח בערך אחד חלקים וחצי שעות של הליך הזנק לפני HPF פועל יכול להתחיל.
   1. מיתוג בלחץ גבוה Wohlwend הקומפקטי 02 מקפיא.
      1. הפעל את המכשיר על ידי סיבוב המתג הראשי מ" 0 "ל" 1 ".
      2. לשחרר אוויר דחוס למכונה.
      3. לשחרר חנקן נוזלי למכונה.
      4. לחץ על הכפתור "SYSTEM מתייבש".
      5. לאחר 30 דקות, לחץ על "התוכנה לM מתייבש "כפתור שוב.
      6. לחץ על לחצן "ON / OFF" כדי לעבור על המכשיר.
      7. לחץ על לחצן "חנקן".
      8. לאפשר להתקן להתקרר למשך 20 דקות גם אם "DRIVE IN" כפתור כבר האיר.
      9. "לנהוג ב" אורות עד כפתור.
      10. לחץ על "הכונן ב" כפתור.
      11. לחץ על לחצן "AUTO".
      12. אורות הכפתור "מערכת המוכן" עד.
      13. הנח את הבדיקה הטמפרטורה ולחץ לתוך תא הלחץ ולנעול אותו עם הסיכה.
      14. לחץ על לחצן "AUTO JET". בדיקות בשלב זה, כי הגידול בלחץ והירידה בטמפרטורה הם כרצוי; בעצם הרצה. ירידות חדות בטמפרטורה ועלייה חדה בלחץ צפויים (איור 1).
      15. לבצע עוד שני מחזורי JET.

2 הכנה לReceiviדוגמאות ng קפואים

1. מלא תיבה מבודדת המכילה בעלי cryovial עם חנקן נוזלי (ראה אזהרות בטיחות), כך שהמחזיקים מכוסים לחלוטין (תרשים 1C).
   הערה: השתמש PPE כולל cryogloves ומשקפי מגן בעת ​​טיפול בחנקן נוזלי.
2. מניחים את המספר המתאים של בקבוקונים המכילים את מדיום FS לתוך מחזיקי צינור אלומיניום בחנקן הנוזלי (איור 1 ג). עם פרוטוקול זה עד ארבעה דיסקים המכיל כל אחד מדגם יחיד יכול להיות ממוקם בcryovial אחד.
   הערה: הבקבוקונים צריכים להיות מסומנים עם מכשיר חד כמו סופר שקצהו יהלומים ועיפרון רך מאוד.
   1. למקבע במהלך QFS להשתמש 1% ₄ Oso ו0.1% אצטט uranyl באצטון ^9. הכן את הפתרון בנפח גדול, לוותר aliquots של 1.5 מ"ל לתוך cryovials וחנות קפוא בחנקן נוזלי.
      הערה: בצע את אזהרות בטיחות לטיפול _ב4 Oso ויצטט uranyl.
      הערה: ₄ Oso ותצטט uranyl הם כימיקלים מסוכנים וצריכה להיות מטופל במנדף בעת לבישת ציוד מגן אישי מתאים (PPE) כוללים נעליים סגורות אצבעות, חלוק מעבדה וכפפות.
      הערה: cryovials נהג להחזיק דגימות לQFS צריכה O-טבעת קשה כדי להבטיח שהצינורות נשארים אטומים במהלך QFS כדי למנוע דליפה של ₄ Oso.
3. הכן שמרים להדביק על ידי ערבוב שמרי אופה עם נפח שווה פחות או יותר של מתנול 10% עם קיסם או מכשיר אחר מסוג זה עד שהעיסה חלקה. השמרים להדביק פועל כcryoprotectant תאי, והוא משמש כדי למלא את החלל סביב המדגם במנשא הדגימה. כמות הדבק תלויה במספר הדגימות; ל10 דוגמאות או פחות רסק (1 מ"ל) יכולות להיות מעורבות בצינור microcentrifuge.

הקפאת .3 לחץ גבוה של דוגמאות

1. הסר עלה (או רקמות אחרות) של ריבית מהמפעל ובעדינות מניח אותו על פיסת Dentaשעוות l או משטח חיתוך אחר. השתמש אגרוף של 2.0 מ"מ או גודל רצוי לחתוך מדגם מתוך העלה. ידית המדגם בעדינות עם זוג המלקחיים ולעבוד מהר ככל האפשר.
2. העבודה תחת מיקרוסקופ לנתח, הכנס את הדיסק עלה בצד 0.2 מ"מ של סוג מנשא דגימה ולכסות לחלוטין בשמרים להדביק. ודא שהדיסק מתמלא לחלוטין ולהדביק הוא רמה עם שפתו של בעל על ידי החלקה החוצה להדביק עם מכחול דק (איור 2).
3. מניחים את המנשא בבעל הדגימה. כסה את המדגם עם מוביל דגימת סוג B, המשטח שטוח למטה.
   הערה: בעל הדגימה צריך להיות יבש ובטמפרטורת חדר.
4. קח לדוגמא בבעל דגימה, להכניס אותו לתוך מכונה וליזום מחזור הקפאה על ידי לחיצה על הכפתור "AUTO JET", שאמורה להשלים בשנייה או שתיים.
5. עבודה מהר ככל האפשר, להסיר את בעל מהמכונה ומניח את הקצה מחזיק sample לתוך חנקן נוזלי בתיבה מבודדת בחלק העליון של המכונה HPF. לטבול את קצות שני זוגות מלקחיים בחנקן הנוזלי כדי לצנן אותם.
   הערה: לאחר הקפאה, יש לטפל בנישאים רק עם מלקחיים מקוררים חנקן נוזליים. מלקחיים חמים (בטמפרטורת חדר) הם לעתים קרובות הסיבה לכישלון בcryotechniques.
6. פתח cryovial המכיל תקשורת FS, והנח את המכסה בצד של הקופסה. בעזרת זוג מלקחיים מקורר חנקן נוזליים, להסיר בעדינות את התקליטור מבעל הדגימה, על מנת להבטיח כי הדיסק תמיד בחנקן או אדים נוזליים. העבודה באדי החנקן הנוזלי, להחזיק את צינור FS עם אחד מלקחיים מקוררים מראש ולהשתמש האחרים כדי למקם את המחזיק בבקבוקון FS. להבריג את המכסה של בקבוקון FS על גב. אל מלכודת כל חנקן נוזלי בבקבוקון.
   הערה: בעת העברת דגימות לcryovials לQFS, להבטיח כי לא חנקן נוזלי הוא לכוד בתוך הבקבוקונים. חנקן נוזלי מרחיב 700 פי במהלך התחממות וכל Trappeחנקן נוזלי ד יכול לגרום לפיצוצים בתקופה זו.
7. חזור על שלבים 3.1-3.7 עד שכל הדגימות הרצויות קפואות. דיסקי עלה מרובים המכילים את אותו הסוג של מדגם יכולים להיות ממוקמים באותו הבקבוקון. שים לב שבעל הדגימה צריך להיות מיובש והביא לטמפרטורת חדר בין ריצות הקפאה. כדי לעשות זאת במהירות, לחמם אותו במכת מייבש, ולפקח על הטמפרטורה שלו על ידי מגע.

.4 הכנה לחילוף הקפאה

1. לגמרי לטבול את בלוק דוד האלומיניום בחנקן נוזלי ל10 דקות או עד שמפסיק רתיחת nucleate. אמנם זה קורה, מקום שכבה של קרח יבש (1-2 סנטימטר) בחלק התחתון של המכל משמש כחדר FS (איור 3). מיכל קלקר או דלי קרח יכול לשמש לFS, יחד עם קרח יבש כתוש או כדורים.
2. במהירות להכניס את cryovials המכיל דגימות יחד עם הבדיקה הטמפרטורה לשורות אמצע רחוב דוד. הקפד שהמכסים עלבקבוקונים דפוקים בחוזקה, כך שהתקשורת FS לא תדלוף החוצה במהלך FS. תתחיל להקליט את הטמפרטורה.
   1. הפוך הבדיקה הטמפרטורה על ידי הצבת תרמי דרך החלק העליון של cryovial כך שהוא מגיע לחלק התחתון של הצינור. לאטום את המכסה של הצינור עם שרף כך שאין דליפות נוזל החוצה. מלא את הצינור עם 1.5 מ"ל אצטון בתחילת כל סיבוב QFS.
3. , באמצעות cryogloves מבודד או מלקחיים גדולים לשפוך את כל החנקן הנוזלי מבלוק דוד. יש להיזהר שלא לשפוך את cryovials.
   הערה: השתמש PPE כולל cryogloves ומשקפי מגן בעת ​​טיפול בחנקן נוזלי.
4. מניחים את הגוש המכיל בקבוקונים על גבי השכבה של קרח יבש בתא QFS. ודא הבלוק ממוקם כך שהצינורות שוכבים במאוזן אבל עם הטיה קלה כלפי מעלה. לא צריך להיות שום דליפה אם cryovials הנכון משמש.
5. לארוז קאמרי QFS עם קרח יבש, כך שצינורות FS מכוסים, אם כי זה לא הכרחי ללכסות את החלק העליון של הבלוק. מניחים את המכסה על החדר.

.5 המהיר FS

הערה: בצע את ריצת QFS במנדף במקרה שכל דליפה של ₄ Oso בטעות מתרחשת למרות אמצעי זהירות אחרות.

1. הנח קאמרי QFS על שייקר סיבובי פלטפורמה במנדף ולסובב ב125 סל"ד 120 דקות. במהלך תקופה זו הטמפרטורה של הבלוק צריכה להגדיל בהדרגה עד כ -80 מעלות צלזיוס. התסיסה מבטיחה ערבוב של הרכיבים עבור FS טוב יותר.
   הערה: המיקום של שייקר במנדף ואת המיקום של דלת מנדף צריכה להיות זהה לאורך כל הליך QFS ועבור כל QFS לרוץ כדי להבטיח התחממות של דגימות עולה בקנה אחד.
2. הסר את הקרח היבש מהאולם ולהמשיך רעד במשך שעה נוספת.
   הערה: הטמפרטורה צריכה להגדיל לכ -15 ° C ל-20 מעלות צלזיוס.
3. הסר את הדגימות ובדיקת טמפרטורה מתא QFS ומניח עלשייקר בטמפרטורת חדר למשך עוד דקות 10-15, עד שהם מגיעים לטמפרטורת חדר. לעצור את הקלטת הטמפרטורה.
4. במהלך FS, לכבות את המכונה HPF.
   1. סגור את הברז של מיכל החנקן הנוזלי ואילו המכונה HPF הוא ממלא בחנקן.
   2. לחץ על לחצן "חנקן".
   3. חכה עד אדום מכבה אור "בוכנה DOWN".
   4. לחץ על "ON / OFF" כפתור.
   5. לחץ על הכפתור "SYSTEM מתייבש".
   6. ניתק את אספקת אוויר דחוס למכונה.
   7. לאחר מינימום של שעה 12 (כדי להבטיח ייבוש של כל לחות), לכבות את המכונה על ידי סיבוב המתג הראשי מ" 1 "ל" 0 ".

.6 הודעה FS עיבוד

1. מוציא בזהירות את תקשורת FS עם טפטפות העברת פלסטיק ומניחים במכל המתאים לפסולת רעילה.
   הערה: ₄ Oso ויצטט uranyl הם כימיקלים מסוכניםויש לטפל במנדף בעת לבישת ציוד מגן אישי מתאים (PPE) כוללים נעליים סגורות אצבעות, חלוק מעבדה וכפפות.
2. לשטוף דגימות ארבע פעמים עם אצטון 100%. לאסוף את שתי שטיפות הראשונות ולמקם במכל הפסולת הרעיל.
3. בעזרת מלקחיים בסדר, להסיר את דגימות רקמה מבעלי. שמור דגימות רטובות עם אצטון כזה נעשה, ולעבוד מאוד בעדינות כדי למנוע דגימות שבירה.
   הערה: אין זה יוצא דופן וזה יכול להיות ממש שימושי יש השמרים להדביק נופלים מהדגימות בשלב זה. השמרים להדביק הוא בדרך כלל בצבע חום כהה מאוד ואילו רקמת העלה היא עדיין ירוקה.
4. לאסוף את הדגימות בcryovials המכיל אצטון. להמשיך בהכנת מדגם (חדירה והטבעה) לTEM על פי פרוטוקולים המקובלים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

תוצאות המוצגות להלן התקבלו באמצעות Wohlwend קומפקטי 02 לHPF (איור 1 א). אחד יתרונות עיקריים של מכשיר זה הוא הקלות של שימוש בנישאי הדגימה והמחזיקים בו. בעת שימוש במכשירים אחרים, מקדונלד 'ס ממליץ ששני משתמשים צריכים לבצע את הכנת המדגם וHPF, אחד הכנת הדגימות ואילו השני ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ההצלחה של הפרוטוקול המובא כאן תלויה במידה רבה על המשתמש. ראשית, נדרשת הכנה מתקדמת, כדי להבטיח כי כל חומרים הדרושים הם זמינים ובכמות מספיקה להשלמת כל ריצת HPF-QFS. שנית, המשתמש חייב לעבוד במהירות, נע מצעד לצעד בצורה יעילה הממזערת טיפול מדגם, ובכך ממזערים את השינויים במדינה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine	Technotrade International, Inc	HPF02	With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display  of freezing parameters
Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers	Technotrade International, Inc	290
Specimen carriers, P=1,000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A	Technotrade International, Inc	241-200
Specimen carriers, P=1,000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B	Technotrade International, Inc	242-200
Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20	Chart
Baker's yeast			The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production
Tooth picks
Thermocouple data logger EL-USB-TC	OMEGA Engineering Inc.	OM-EL-USB-TC	Replacement battery purchased separately
Temperature probe	Electron Microscopy Sciences	34505
Heater block 12/13 mm
Rotary shaker	Fisher Scientific	11-402-10
Leaf punch - Harris Uni-core 2.00	Ted-Pella Inc.	15076
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences	72660
Cryogenic vials 2 ml	Electron Microscopy Sciences	61802-02
Methanol
Blow dryer
Dry ice
Liquid nitrogen
Acetone
Forceps			Several pairs