השימוש ב<em&gt; Ex Vivo</em&gt; מכשירי צ&#39;נדלר Loop להערכת Biocompatibility של צינורות דם פולימרית השתנה

Summary

Blood exposure to polymeric blood conduits initiates the foreign body reaction that has been implicated in clinical complications. Here, the Chandler Loop Apparatus, an experimental tool mimicking blood perfusion through these conduits, is described. Appendage of recombinant CD47 results in decreased evidence of the foreign body reaction on these conduits.

Abstract

תגובת הגוף הזר מתרחשת כאשר משטח סינטטי הוא הציג לגוף. הוא מאופיין על ידי ספיחה של חלבוני דם ואת הקובץ המצורף וההפעלה הבאים של טסיות דם, מונוציטים / הידבקות מקרופאג, ואירועי תא איתות דלקתיים, שמוביל לסיבוכים לאחר פרוצדורליים. מכשירי צ'נדלר Loop הוא מערכת ניסיונית המאפשרת לחוקרים ללמוד את יחסי גומלין המולקולריים ותאיים המתרחשים כאשר כמויות גדולות של דם הן perfused מעל תעלות פולימריים. לשם כך, מנגנון זה שמש כמודל ex vivo המאפשר ההערכה של התכונות אנטי דלקתיות של שינויי משטח פולימרים שונים. המעבדה שלנו הראתה כי תעלות דם, הותאמו קוולנטית באמצעות כימיה photoactivation עם CD47 רקומביננטי, יכולות להעניק biocompatibility למשטחים פולימריים. צירוף CD47 למשטחים פולימריים יכול להיות אמצעי יעיל לקידום היעילות של צינורות דם פולימריים. שלהעין היא מתודולוגיה המפרטת את הכימיה photoactivation נהגה לצרף CD47 רקומביננטי לתעלות רלוונטיות קליני פולימריים דם והשימוש בלולאת צ'נדלר כvivo לשעבר מודל ניסיוני לבחינת אינטראקציות דם עם תעלות CD47 שונה ושליטה.

Introduction

נהלים רבים קליניים, כגון מעקף לב ודיאליזה, מחייבים את השימוש של צינורות דם פולימרים ולעתים קרובות קשורים לסיבוכים לאחר פרוצדורליים ^1. כאשר perfused עם דם, פולימרים אלו לא חוקיים תגובת הגוף הזר (FBR), וכתוצאה מכך הספיחה של חלבוני דם וטסיות דם, הידבקות מונוציטים / מקרופאג, והשחרור של ציטוקינים פרו דלקתיים, כולם תורמים לסיבוכים וכדי שלאחר פרוצדורליים / או ^2,3 כשל בהתקן. לפיכך, אסטרטגיות כדי לטפל בבעיה זו תישאר באזור חשוב ומתמשך של מחקר חומרים ביולוגיים. חוקרים ניסו לטפל בבעיה זו על ידי שינוי משטחי דם פנייה עם מולקולות ביו או bioinert ^4-6. מחקר במעבדה שלנו התמקד בצירוף CD47 רקומביננטי (recCD47) לחומרים ביולוגיים פולימרים כאסטרטגיה לצמצום FBR ולהגדיל את היעילות של חומרים אלה. CD47 הוא transmembr הביע בכל מקוםחלבון ane עם תפקיד ידוע בהתחמקות חיסונית, מעמד של "עצמי" המקנה לי לבטא בתאים ^7-10 ומופעים מבטיח בהענקת התאמה ביולוגית כאשר צורף למשטחים פולימריים ^11-13. אות הרגולציה אלפא חלבון (SIRPα), קולטן מאותו המקור לCD47, וחבר במוטיב המבוסס על טירוזין immunoreceptor המעכב (עתים) המכיל משפחה של חלבונים הטרנסממברני, באה לידי ביטוי בתאים ממוצא מיאלואידית ^14. אנחנו הוכחנו בעבר כי CD47, באמצעות איתות תא בתיווך SIRPα, למטה מסדיר את התגובות חיסוניות לפוליאוריטן (PU) ופולי ויניל כלוריד (PVC) במבחנה, vivo לשעבר, ובמודלי vivo ^11-13.

מרכזי לחקירות שלנו היא כימיה יחסית רומן photoactivation, שתתואר בהמשך, שבו קבוצות תיאול כימי תגובתי הן קוולנטית המצורפות לצינורות פולימריים ידי מגיב צינורות עם פולימר רב תכליתי (PDT-BZPh), מורכב מ2-pyridyldithio (PDT), benzophenone photoreactive (BzPh) וpolyallylamine-הותאם carboxy ^11-13. צמצום קבוצות PDT המצורף קוולנטית עם טריס (2-carboxyethyl) hydrochloride phosphine (TCEP) ¹¹ מניב משטח thiolated שיכול להיות לאחר מכן הגיב בmoieties הטיפולי. המפורטים כאן ובעבר ^12,13, recCD47, הותאם עוד יותר עם ​​התוספת של זנב poly-ליזין C-מסוף ^12,13, הוא הגיב עם Sulfosuccinimidyl-4 [N -maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC) עבור שעה 1 כדי ליצור קבוצות תיאול-reactive, המאפשר קשר monosulfide היווצרות בין צינורות ^ו11 recCD47. היכולת אנטי דלקתית של משטחי CD47 פונקציונליות נבדקה, לשעבר יו o, באמצעות מכשירי צ'נדלר Loop עם דם אנושי כולו, שתואר בשנת 1958 במקור כמודל במבחנה של קרישה טרומבוטיים ^15. המנגנון מסתמך עלמערכת צינור סגורה באופן חלקי עם אוויר ומנוע סיבובי כדי להפיץ את הדם דרך צינורות ^15. מודל ניסיוני זה מספק את ההזדמנות כדי לבחון את ההשפעה של חשיפת דם על משטחים שונה וללא שינוי, כמו גם את ההשפעה של שינויי שטח אלה על הפיסיולוגיה של תאי הדם.

יכול יצורף recCD47 למגוון משטחים פולימריים באמצעות כימיה photoactivation זה, והיכולת אנטי דלקתית שלה ניתן להעריך על ידי ניצול מודל ex vivo רלוונטי קליני מחקה זלוף דם על משטחים פולימריים ^11,12. צינורות דם קליניים כיתה שונה עם recCD47 להראות פחות באופן משמעותי הטסיות ומצורפת תא דלקתי בהשוואה לפולימרים ללא שינוי כאשר הם נחשפים לדם אדם במנגנון. תיאור צעד אחר צעד של תהליך שינוי זה הנו כמפורט להלן.

Protocol

1 משטחים פולימריים שינוי עם recCD47

הערה:. הפרוטוקול מסוכם סכמטי באיור 1 איור 1 א ממחיש דור של משטחים פולימריים תיאול-reactive איור 1 מדגים דור של recCD47 תיאול-reactive..

1. יום 1
   1. הכן פתרון של PDT-BzPh (1 מ"ג / מ"ל) ואשלגן ביקרבונט (KHCO ₃₎ (0.7 מ"ג / מ"ל) במים סטריליים. מערבבים לילה ב 4 ° C (להגן מפני אור).
2. יום 2
   1. חותכים צינורות פולימריים לחתיכות ארוכות 40 סנטימטר (ארוך מספיק כדי להתאים סביב גלגלים מסתובבים).
   2. משרים צינורות בפתרון 0.1% מימיים של hexacylpyridinium ל90 דקות בטמפרטורת חדר על שייקר או במכשירי צ'נדלר Loop. יש לשטוף את הצינורות עם 3x מים סטריליים לאחר דקות 90 לספוג.
   3. להפוך לחומצת הפתרון של PDT-BzPh מיום 1 על ידי הוספת 15% monobasic אשלגן זרחה מימיים (KH ₂ PO _4). הוסף 50 μl KH ₂ PO ₄ לכל מ"ל של PDT-BzPh, ויצר פתרון micellar מעונן.
   4. משרים את הצינורות בפתרון PDT-BzPh acidified ל40 דקות בטמפרטורת חדר על שייקר או במנגנון.
   5. יש לשטוף את הצינורות עם חומצה אצטית מהולה (1: 1,000) פעם אחת.
   6. לחשוף את הצינורות לקרינת UV למשך כולל של 60 דקות. סובב צינורות ¼ להפוך כל 15 דקות כדי להקרין את פני השטח כולו.
   7. משרים את הצינורות בתמיסה של אשלגן ביקרבונט / מ"ל 20 מ"ג (KHCO ₃₎ ל20 דקות בטמפרטורת חדר על שייקר או במנגנון.
   8. יש לשטוף את הצינורות עם 3x מים סטריליים ולאחסן ב 4 ° C במים סטריליים.
3. יום 3
   1. ממיסים 5 מ"ג Sulfo-SMCC ב200 dimethylformamide μl (DMF) (זהירות: בצע במנדף).
   2. הוסף 50 μl של פתרון Sulfo-SMCC הכין בשלב 1 כדי 0.1 מ"ג / מ"ל ​​של תמיסת פולי ליזין recCD47, ומערבבים ל60 דקות ב roטמפרטורת אום.
   3. במהלך 60 מערבבים דק ', דגת סטרילית בופר פוספט של Dulbecco (DPBS) ומניחים בצד.
   4. לטהר Sulfo-SMCC הגיב recCD47 באמצעות טור 7K משקל מולקולרי חתוך ספין desalting לפי הוראות יצרן. אסוף זרימה דרך סופי (recCD47 תיאול-reactive באיכות גבוהה) ולדלל את נפח דרוש למעייל הפנימי של הצינור עם DPBS.
   5. יש לשטוף את הצינורות מיום 2 עם סטרילי, degassed 3x DPBS.
   6. מגיב משטח שונה של הצינורות עם פתרון של 20 מ"ג / מ"ל ​​עם טריס hydrochloride phosphine (2-carboxyethyl) (TCEP) בDPBS degassed פחות מ 2 דקות. יש לשטוף את הצינורות עם 4x DPBS degassed סטרילי.
   7. הוסף את recCD47 הגיב-Sulfo-SMCC לצינורות ודגירת הלילה בשעה 4 ° C על שייקר או במנגנון.

.2 Immunoassay כימות recCD47 על משטחים השתנה

1. יש לשטוף את הצינורות שונה כדי לכמת מיום 3 שנינותDPBS 3x h. צינורות חנות אינו משמשים לכימות בDPBS על 4 מעלות צלזיוס.
2. השתמש בביופסית 4 מ"מ כדי להפוך את דגימות צינור כפולות ומניח את האגרופים ביופסיה בבארות של צלחת 96 היטב.
3. הכן שליטה שלילית בהיקף של מדגם צינור ללא שינוי לא טופל בנוגדן זיהוי. הכן שליטת נוגדן המורכבת ממדגם צינור ללא שינוי טופל בנוגדן זיהוי. הכן את דגימות בדיקת צינורות שונה שטופלו בנוגדן זיהוי.
4. דגימות בלוק עם אלבומין 0.4% בסרום שור (BSA) בDPBS ל60 דקות בטמפרטורת חדר על שייקר.
5. לאחר חסימה, BSA לשאוב ולשטוף עם שנאגרו מלוח טריס בתוספת 1% 3x (TBST) 20-Tween, 10 דקות כל אחד על שייקר.
6. הכן דילול עבודה של נוגדן בBSA 0.4% בהתאם לדילול המומלץ של היצרן לimmunoassays. לדלל CD47 האנושי נוגדן B6H12-FITC 1: 100 בBSA 0.4%.
7. הוסף 200 μl דילול נוגדן לבארות מתאימות. אינקובטוריםבקרות שליליות te עם BSA 0.4% בלבד. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 60 דקות על שייקר (להגן מפני אור).
8. לשטוף עם TBST 3x, 10 דקות כל אחד על שייקר. לשאוב שטיפת TBST האחרונה ולהוסיף 200 DPBS μl לבארות מדגם צינור.
9. לאסוף את הזרימה דרך סופית, שהוא CD47 רקומביננטי תיאול-reactive באיכות גבוהה ולדלל את נפח דרוש למעייל הפנימי של צינורות עם DPBS.
10. קראו עוצמת אות FITC באמצעות קורא microplate עם עירור FITC (485 ננומטר) ופליטה (538 ננומטר) הגדרות.
11. חישוב מחויב recCD47 למשטח פולימרים המבוססים על ערכים סטנדרטיים, והיוו אוטומטי הקרינה ואינה ספציפי מחייב ממדגם שליטת נוגדן.

פרוטוקול מכשירים .3 צ'נדלר Loop

לחפש מוסדי מועצה לביקורת אישור (IRB) של פרוטוקול איסוף דם וניירת הסכמה מדעת לפני תחילת איסוף דגימות דם של בני אדם. השג מידעrmed הסכמת מתורם דם אדם.
הערה: תרשים המתאר את המנגנון מוצג באיור 2.

1. מלא אמבט מים עם מים מזוקקים עד כ 1/2 של הגלגלים בקוטר שקועים. להוסיף מספיק אקונומיקה לאמבטיה המים כדי להפוך את פתרון אקונומיקה 10%. אמבטיה להגדיר מים ל37 מעלות צלזיוס ולאפשר טמפרטורה לאזן.
2. לאסוף מתאמי מתכת (שמוצגים באיור 1 ב '), צינורות ללא שינוי וצינורות שונה, ולהרכיב סביב גלגלי מנגנון, כפי שמוצג באיור 1 ג. ודא צינורות שמתאים מלבב סביב הגלגל עם מתאם המתכת במקום.
3. להשיג 30 מ"ל דגימת דם באמצעות פרוטוקול שאושר IRB, בבקבוקון מלא מראש עם 2 מ"ל של ציטראט או נוגדי קרישה אחרים, ומערבבים על ידי היפוך כדי למנוע קרישת פעם אחת את הדגימה שנאספה.
4. להוסיף כ 10 מ"ל של דם לכל צינור באמצעות שסתום המתכת ומזרק, והשאיר קצת אוויר בצינור. אבטח את כובע השסתום וrסוב ל3 שעות.
5. מסננים את הדם לתוך מבחנה פסולת שטופלה בתמיסת אקונומיקה 10% (או כפי שנדרש על ידי מדיניות מוסדית).
6. בעדינות ולשטוף פנים צינורות עם DPBS כדי להסיר כל העקבות של דם. אסוף זרימה דרך בכוס הפסולת. השלך דם בהתאם למדיניות מוסדית.
7. לחטא את המכשירים וכל דם מחלקת משטחים באמצעות פתרון אקונומיקה 10% או פי מדיניות מוסדית.
8. דגימות תהליך למיקרוסקופ אלקטרונים מיקרוסקופי או סריקת ניאון כפי שתתוארנה להלן.

.4 פלורסנט מיקרוסקופית וספירה תאים

1. הכן פתרון paraformaldehyde 4% (PFA) (זהירות: בצע במנדף).
2. דגירה צינורות ב4% פתרון PFA הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
3. לאחר דגירה הלילה, להסיר את PFA 4% ולשטוף סרטים מאוד בעדינות עם DPBS.
4. חותך את צינורות לחלקים על מנת לחשוף את פני השטח לומן לצביעה.
5. כתםסעיף של הצינור עם כמה טיפות של הרכבה תקשורת עם 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ל30 דקות בטמפרטורת חדר (להגן מפני אור). לאחר צביעה, יש לשטוף את צינורות בעדינות עם DPBS להפחית אות DAPI רקע.
6. תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במסנן DAPI ומצלמה דיגיטלית לספור את מספר התאים ב9 שדות בצורה עיוורת שנבחרו להציג תחת הגדלה 200X.
7. רשומה התא סופר לכל שדה ראיה ולבצע ניתוחים סטטיסטיים מתאימים כדי לקבוע מובהקות סטטיסטיות של תוצאות.

.5 מיקרוסקופית אלקטרונים סורק

1. הכן 2% פתרון glutaraldehyde (זהירות: בצע במנדף).
2. דגירה צינורות בפתרון glutaraldehyde 2% בין לילה ב 4 ° C..
3. לאחר דגירה הלילה, בעדינות לשטוף 3x צינורות עם DPBS.
4. הכן פתרון 1% מtetroxide אוסמיום (זהירות: סכנת משאיפת חמורה! השתמש במנדף).
5. דגירה צינורות בפתרון 1% מtetroxide אוסמיום 15 דקות בטמפרטורת חדר.
6. לשטוף בעדינות את 3x צינורות עם DPBS.
7. הכן סדרה של ריכוזי אתנול (25%, 50%, 75%, 95%, ו100% אתנול).
8. מייבש את צינורות על ידי דגירה בסדרה של ריכוזי אתנול. דגירה ב25%, 50%, 75%, ו95% אתנול ל20 דקות כל אחד. דגירה ב100% אתנול למשך 30 דקות.
9. נקודה קריטית לייבש את צינורות עם CO ₂ דקות 45 כדי להסיר את כל הלחות.
10. חלקי צינור הר על בדל דגימה עם דבק כסף או גרפיט.
11. חלקי צינור מעיל עם 12.5 ננומטר של זהב-פלדיום.
12. בדוק במיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

תוצאות

יצירת משטחים פולימריים תיאול-reactive באמצעות PDT-BzPh וTCEP יחד עם תיאול-reactive פולי ליזין recCD47 באמצעות SMCC מאפשרת החיבור של recCD47 למשטחים פולימריים. תהליך השינוי הוא סיכם באופן סכמטי באיור 1. הנוחות של תהליך השינוי הזה היא שהוא יכול להיות מיושם על חלבונים רבים ושונים ומש...

Discussion

הכימיה photoactivation (המסוכמת באיור 1) מאפשרת לשינוי של כל משטח כמעט פולימר שיש פחמימנים מספיק כדי להקל על התקשרות PDT-BzPh וקרינת UV לאחר צילום להפעיל PDT-BzPh. Functionalizing משטח פולימרים עם קבוצות תיאול תגובתי מאפשר לקובץ המצורף שלאחר מכן של מגוון רחב של מולקולות הניתנות לבד...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Paraformaldehyde (PFA)	Thermo Scientific	58906	Caution! Use in fume hood
25% Glutaraldehyde	VWR	AAA17876-AP	Caution! Use in fume hood
2-pyridyldithio,benzophenone (PDT-BzPH)	Synthesized in lab	N/A
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A3059-100G
Citrate	Sigma	S5770-50ML
Digital Camera	Leica	DC500	Out of production
Dimethylformamide (DMF)	Sigma	270547-100ML	Caution! Use in fume hood
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco/Life Technologies	14190-136
Fluorescent Microscope	Nikon	TE300
Glacial Acetic Acid	Fisher Scientific	A38-212	Caution! Use in fume hood
Human CD47 (B6H12) – FITC Antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-12730
Osmium Tetroxide	Acros Organics	197450050	Caution! Use in fume hood
Potassium Bicarbonate (KHCO3)	Sigma	237205-100G
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)	Sigma	P5655-100G
PVC Tubing (Cardiovascular Procedure Kit)	Terumo Cardiovascular Systems	60050	Most clinical-grade tubing will work
Scanning Electron Microscope	JEOL	JSM-T330A
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher Scientific	BP358-212
Microplate Reader	Molecular Devices	Spectramax Gemini EM
Sulfo-SMCC	Sigma	M6035-10MG	Moisture Sensitive!
tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP-HCl)	Thermo Scientific	20491
Tween-20	Bio-Rad	170-6531
Vectashield with DAPI	Fisher Scientific	H-1200	Light sensitive!
Zeba Spin Desalt Columns – 7 K MWCO	Thermo Scientific	89891