JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.

Abstract

השימוש הנרחב בדור הבא של הרצף נפתח אפיקים חדשים לחקר סרטן ואבחון. NGS יביא כמויות עצומות של נתונים חדשים על הסרטן, ובמיוחד סרטן גנטיקה. ידע נוכחי ותגליות עתידיות יעשו את זה צריך ללמוד מספר עצום של גנים שיכולים להיות מעורב בנטייה גנטית לסרטן. בהקשר זה, פיתחנו עיצוב Nextera ללמוד 11 גנים שלמים מעורבים בתיקון נזק לדנ"א. פרוטוקול זה פותח כדי ללמוד בבטחה 11 גנים (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, וTP53) מאמרגן ל3'-UTR ב24 מטופלים בו זמנית. פרוטוקול זה, המבוסס על טכנולוגיית transposase והעשרת gDNA, נותן יתרון גדול במונחים של זמן להודות אבחון הגנטי כדי לדגום ריבוב. פרוטוקול זה ניתן להשתמש בבטחה עם gDNA דם.

Introduction

בשנת 2010, כמעט 1.5 מיליון בני אדם (בעצם נשים) פיתחו סרטן השד ברחבי העולם. ההערכה היא כי 5 עד 10% מהמקרים הללו היו תורשתיים. לפני כמעט 20 שנים, BRCA1 ו BRCA2 זוהו כמעורב בשד תורשתי וסרטן השחלות 1. מאז לפני כ -15 שנים, אזורי קידוד BRCA1 ו BRCA2 היו רצף כדי לקבוע את הנטייה הגנטית לסרטן שד וסרטן השחלה. שינויים בBRCA1 ו BRCA2 מתגלים ב10 עד 20% ממשפחות שנבחרו 2 מצביעים על כך שהניתוח של אזורים אלה אינו מספיק להקרנה יעילה. לאחרונה, ניתוח רצפי קידוד שאינו (אמרגן, אינטרונים, 3-'UTR) של BRCA1 ו BRCA2 הדגיש כי מוטציות חדשות / וריאציות יכולות להיות קשורות לסיכון גבוה יותר לסרטן השד 3-6.

חלבוני BRCA1 ו BRCA2 מעורבים בתיקון הומולוגי רקומבינציה (HHR), אשר הושלם על ידי מספר רב של שותפים 7. בעוד שינויים בBRCA1 או BRCA2 לגרום פגמים בתיקון DNA, שותפים האחרים עשויים גם להשפיע על הסיכון לסרטן השד. השערה זו נראית אומתו מאז BRIP1 8 ויש לי PALB2 9 השפעה מוכחת על סרטן צוואר רחם וסרטן שד, בהתאמה. בנוסף, שני גנים אחרים "מתון בסיכון" לסרטן שד רגישות, כספומט וCHEK2, יכולים להיות גם למדו באופן שגרתי 10.

בהמשך למחקרים הללו, החלטנו לפתח פרוטוקול לנתח 11 גנים (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAP80, וTP53) ב24 מטופלים בו זמנית באמצעות מאוד קל ויחסית פרוטוקול מהיר המבוסס על טכנולוגיית transposase, עם העשרה ורצף על מכשיר תפוקה בינוני. תודהלטכניקה זו, אנו רצף גנים שלמים כבר מההתחלה של האמרגן לסוף 3'-UTR, פרט לRAP80, שאזור intronic של 2,500 נ"ב לא היה מכוסה (Chr5: 176,381,588-176,390,180). זה מייצג כולל של כ 1000300 נ"ב למד עם 2,734 בדיקות. בדרך כלל, רצפי exonic BRCA1 ו BRCA2 מנותחות סנגר רצף, אשר צריך 1.5 חודשים פחות מ 20 חולים. עם הפרוטוקול הנוכחי (איור 1), באותו הזמן, 11 גנים שלמים יותר מ75 חולים יכולים להיות מנותחים.

Protocol

.1 הערכת gDNA תשואה (הדנ"א הגנומי)

  1. לכמת חילוץ טרי gDNA לפני ההכנה של הספרייה. השתמש בשיטת הערכת תשואת fluorometric לכמת gDNA שלם (להימנע משימוש בספקטרופוטומטר להערכת תשואת gDNA). מדוד את היחס (260/280 ננומטר) ולוודא שהוא בין 1.8 ו -2 הערה: 50 ng של gDNA נדרש לצורך הניסוי.

.2 GDNA העשרה: יום 1, בוקר

  1. לפני שמתחיל
    1. מערכת העשרת DNA (ראה טבלה של חומרים / ציוד), הפשרת חיץ DNA (TD) ופתרונות אנזים DNA (TDE1) על קרח. לפחות 30 דקות לפני השימוש, להביא חרוזים מגנטיים טיהור ולהפסיק היעד (ST) חיץ לטמפרטורת חדר (RT). הוסף 20 μl של מדגם gDNA ב2-2.5 ng / μl ישירות לתוך צלחת 96 היטב, 1 גם לדגימה. חשוב: השתמש בבקרה חיובית כדי לאמת את הפרוטוקול (לדוגמא עם וריאציה רצף ידועה).
  2. Tagmentation
    1. Mix כל ריאגנטים ביסודיות על ידי היפוך 5x, ובקצרה ספין למטה. ב RT, להוסיף 25 μl של חיץ TD היטב כל אחד מכיל 50 ng (20 μl) של gDNA, ולאחר מכן 5 μl של חיץ TDE1. הגדר פיפטה 50 μl, פיפטה בעדינות מעלה ומטה 10x כל הנפח.
    2. מכסה את הצלחת עם סרט דבק ו צנטריפוגות 1 דקות ב280 XG ב 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, מניח את צלחת thermocycler (הכיסוי מחומם ב100 ° C) ולהפעיל את התכנית הבאה: 55 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ו10 מעלות צלזיוס למשך זמן בלתי מוגבל.
    3. במהלך דגירה זה, להכין את הגיליון לדוגמא עם תוכנת מנהל הניסוי להגדיר מדדים שישמשו.
  3. Tagmentation טיהור
    הערה: שלב זה הוא קריטי. להיות זהיר מאוד.
    1. בדוק על היעדריו של משקע בחרוזים מגנטיים טיהור וחיץ ST. אם משקעים נמצאים, לחמם את הפתרונות בידיים. חיץ הפשרת resuspension (RSB) על קרח.
    2. ב RT, פתרון ST מערבולת ולהוסיף15 μl לכל דגימה המכילה גם. הגדר פיפטה ל65 μl, פיפטה בעדינות מעלה ומטה 10x כל הנפח. דגירה של 5 דקות ב RT. מכסה את הצלחת ו צנטריפוגות 1 דקות ב280 XG ב 20 מעלות צלזיוס.
    3. הוספת 52 μl של חרוזים מגנטיים טיהור מעורבות בעבר בכל טוב. הגדר פיפטה ל117 μl, פיפטה בעדינות מעלה ומטה 10x כל הנפח. דגירה של 10 דקות ב RT. מכסה את הצלחת ו צנטריפוגות 1 דקות ב280 XG ב 20 מעלות צלזיוס.
    4. הסר את הסרט הדביק. מניחים את צלחת 96 היטב על מעמד מגנטי עבור 2 דקות ב RT. ודא שsupernatant מופיע ברור לחלוטין.
    5. הכן פתרון אתנול 80% טרי (ל24 דגימות, להוסיף 2 מ"ל של מים מזוקקים עד 8 מ"ל אתנול). להסיר ולסלק מטפל supernatant לא להפריע חרוזים.
    6. תוך שמירה על הצלחת על הדוכן המגנטי, להוסיף 200 μl של מוכן טרי אתנול 80% לכל אחד גם מבלי להפריע חרוזים ודגירה את הצלחת לפחות 30 שניותבטמפרטורת חדר. בטל supernatant וחזור לשטוף זו פעם שנייה. ודא אתנול הוסר. בואו יבש בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות או עד אידוי של אתנול מלא.
    7. הסר את הצלחת מהדוכן המגנטי ולהוסיף 22.5 μl של חיץ RSB. הגדר את פיפטה ל22.5 μl, פיפטה בעדינות מעלה ומטה 10x כל הנפח. מניחים את צלחת 96 היטב על הדוכן המגנטי ודגירה של 2 דקות. ודא שsupernatant מופיע ברור לחלוטין. בעדינות להעביר 20 μl של supernatant ב96 גם צלחת חדשה.
      הערה: לחלופין, לקבוע את הגודל של דגימות tagmented באמצעות מנתח בר. במקום הצעדים שהוזכרו לעיל, להשתמש בג'ל אלקטרופורזה acrylamide ברזולוציה גבוהה. שברים צריכים להיות בין 150 נ"ב ו -1,000 נ"ב.
  4. 1 st PCR הגברה
    1. תערובת אב ההפשרה PCR המכילה פולימראז (LP-PMM), פריימר אינדקס 1, ופתרונות פריימר 2 מפתח על קרח. התאם את o שילובמדדי f עם סדין מדגם מנהל ניסוי. לריבוב, להכין i7 שונה ממדד 1 (i7, N7xx) עבור כל דגימה.
    2. בכל טוב, להוסיף 20 μl של LP-PMM, 5 μl מדד 1, ו -5 μl מדד .2 הגדר את פיפטה ל50 μl, פיפטה בעדינות מעלה ומטה 10x כל הנפח. מכסה את הצלחת עם סרט microseal דבק. צנטריפוגה 1 דקות ב280 XG ב 20 מעלות צלזיוס.
    3. מניחים את הצלחת בthermocycler (הכיסוי המחומם ב100 ° C) ולהפעיל תכנית 1 (טבלה 1).
      הערה: ההליך ניתן יהיה לעצור בנקודה זו והתגובות מאוחסנות לילה בthermocycler או 2 ימים בין C 2 ו -8 מעלות.

.3 GDNA העשרה: יום 1, אחה"צ

  1. לפני שמתחיל
    1. oligos הפשרה (CSO), חיץ לכידת יעד 1 (NCT1), ופתרונות RSB על קרח. לפחות 30 דקות לפני השימוש, להביא חרוזים מגנטיים טיהור לRT.
  2. טיהור PCR
    1. צנטריפוגה את הצלחת מהצעד 2.4, 1 דקות ב280 XG ב 20 מעלות צלזיוס.
    2. ב RT, להוסיף 45 μl של חרוזים מגנטיים מעורבת טיהור בכל טוב. הגדר את פיפטה ל95 μl, פיפטה בעדינות מעלה ומטה 10x כל הנפח. דגירה של 10 דקות ב RT. מניחים את צלחת 96 היטב על מעמד מגנטי למשך 2 דקות ב RT.
    3. ודא שsupernatant מופיע ברור לחלוטין. הכן פתרון אתנול 80% טרי (ל24 דגימות, להוסיף 2 מ"ל של מים מזוקקים עד 8 מ"ל אתנול). מחק את טיפול לקיחת supernatant לא להפריע גלולה.
    4. תוך שמירה על הצלחת על הדוכן המגנטי, להוסיף 200 μl של מוכן טרי אתנול 80% לכל אחד גם מבלי להפריע חרוזים ודגירה את הצלחת ל30 שניות בטמפרטורת חדר. בטל supernatant וחזור לשטוף זו פעם שנייה. ודא אתנול הוסר. בואו יבש בטמפרטורת חדר במשך 15 דקות.
    5. הסר את הצלחת מהדוכן המגנטי ולהוסיף 40 μl של חיץ RSB. הגדר את הצינורטטי ל40 μl, בעדינות פיפטה כל הנפח למעלה ולמטה 10x.
    6. מניחים את צלחת 96 היטב על הדוכן המגנטי ודגירה של 2 דקות. Supernatant אמור להופיע ברור לחלוטין. בעדינות להעביר 38 μl של supernatant לתוך צלחת 96 היטב חדשה.
    7. לקבוע את התשואה של כל דגימה על ידי שיטת fluorimetric. זה חלק הראשון של הפרוטוקול יהיה תוקף אם התשואות העריכו הן בין 30 50 ng / μl.
  3. 1 st הכלאה
    1. בריכה עד 12 דגימות לברכה בשלב זה על ידי ערבוב 500 ng של כל דגימה בצלחת 96 היטב חדשה. ודא שהנפח הסופי של כל בריכה לא יעלה על 40 μl.
      הערה: במידת צורך, להחליש את עוצמת הקול של בריכות באמצעות מכשיר concentrator הוואקום ב RT (זהירות: הריכוז של DNA לא ניתן לשנות על ידי חימום, אפילו ב30 מעלות צלזיוס כפי שהחימום גורם להשפלת DNA). התאם את הנפח הסופי 40 μl על ידי פתרון הוספת RSB.
    2. לערבב ביסודיותפתרון NCT1. ל40 כל μl היטב המכיל דגימות דנ"א ונקוו, להוסיף 50 μl של NCT1, ו10 μl של CSO. הגדר את פיפטה ל100 μl, פיפטה בעדינות מעלה ומטה 10x כל הנפח. חותם את הצלחת ו צנטריפוגות 1 דקות ב280 XG ב 20 מעלות צלזיוס.
    3. מניחים את הצלחת בthermocycler (הכיסוי המחומם ב100 ° C) ולהפעיל תכנית 2 (טבלה 1).

.4 GDNA העשרה: יום 2, בוקר

  1. לפני שמתחיל
    1. מערכת העשרת DNA (ראה טבלה של חומרים / ציוד) הפשרה 2 N NaOH (HP3), חיץ elution יעד 1 (ET1), לכוון חיץ elution 1 ET2, חרוזים מגנטיים streptavidin (SMB), פתרון לשטוף 1 (WS1), לשטוף פתרון 2 (WS2), לשטוף פתרון 3 (WS3), פתרונות CSO, וNCT1 ב RT.
  2. 1 st הכלאה לשטוף
    1. הסר את צלחת 96 היטב מthermocycler ו1 דקות צנטריפוגות ב280 XG ב 20 מעלות צלזיוס. הסר את כיסוי הדבק מאוד carefully.
    2. העבר את תערובת תגובת 100 μl מהצלחת לצלחת 96 היטב MIDI חדש ולהוסיף 250 μl של פתרון SMB גם vortexed. הגדר את פיפטה ל350 μl, פיפטה בעדינות מעלה ומטה 10x כל הנפח. חותם את הצלחת ולדגור על RT למשך 30 דקות.
    3. צנטריפוגה 1 דקות ב280 XG ב 20 ° C, להסיר את החותם דבק ומניח את הצלחת על הדוכן המגנטי למשך 2 דקות. ודא שsupernatant מופיע ברור לחלוטין. בטל supernatant ולהסיר את הצלחת מהדוכן המגנטי.
    4. הוסף 200 μl של פתרון WS1 מעורב היטב בחרוזים המכילים גם. הגדר את פיפטה ל200 μl ובעדינות פיפטה כל הנפח למעלה ולמטה 15x למנוע את ההיווצרות של בועות / קצף.
    5. מניחים את הצלחת על הדוכן המגנטי למשך 2 דקות. ודא שsupernatant מופיע ברור לחלוטין. בטל supernatant ולהסיר את הצלחת מהדוכן המגנטי.
    6. הוסף 200 μl של פתרון WS2 מעורב היטב לתוך conta בארותחרוזים ining. הגדר את פיפטה ל200 μl ובעדינות פיפטה כל הנפח למעלה ולמטה 15x הימנעות היווצרותן של בועות / קצף.
    7. מניחים את הצלחת על הדוכן המגנטי למשך 2 דקות. ודא שsupernatant מופיע ברור לחלוטין. בטל supernatant ולהסיר את הצלחת מהדוכן המגנטי.
    8. הוסף 200 μl של פתרון WS2 מעורב היטב לתוך בארות המכילות חרוזים. הגדר את פיפטה ל200 μl ופיפטה בעדינות מעלה ומטה 15x כל הנפח.
    9. העבר את כל הנפח ב96 גם צלחת חדשה. חותם את הצלחת ומניח את הצלחת בthermocycler (כיסוי מחומם ב100 ° C). הפעל את thermocycler ב42 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
    10. , מייד מניח את הצלחת על הדוכן המגנטי למשך 2 דקות. ודא שsupernatant מופיע ברור לחלוטין. הסר את החותם ולמחוק את כל supernatant מייד. לאחר מכן, הסר את הצלחת מהדוכן המגנטי.
    11. הוסף 200 μl של WS2 לבארות המכילות חרוזים. הגדר את פיפטה ל200μl ובעדינות פיפטה כל הנפח למעלה ולמטה 15x הימנעות היווצרותן של בועות / קצף. חותם את הצלחת ומניח את הצלחת בthermocycler (כיסוי מחומם ב100 ° C). הפעל את thermocycler ב42 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
    12. מייד מניח את הצלחת על הדוכן המגנטי למשך 2 דקות. ודא שsupernatant מופיע ברור לחלוטין. הסר את החותם ולמחוק את כל supernatant מייד. לאחר מכן, הסר את הצלחת מהדוכן המגנטי.
    13. הוסף 200 μl של פתרון WS3 מעורב היטב לתוך בארות המכילות חרוזים. הגדר את פיפטה ל200 μl ופיפטה בעדינות מעלה ומטה 15x כל הנפח.
    14. מניחים את הצלחת על הדוכן המגנטי למשך 2 דקות. ודא שsupernatant מופיע ברור לחלוטין. מחק את כל supernatant ולהסיר את הצלחת מהדוכן המגנטי.
    15. חזור על WS3 לשטוף בפעם שנייה.
    16. לאחר הסרת supernatant, לאטום את צנטריפוגות הצלחת ובקצרה לניתץ supernatant השיורי. מניחים את הצלחת עלהמעמד המגנטי עבור 2 דקות. בטל supernatant השיורי.
    17. בצינור 0.2 מ"ל, לערבב 28.5 μl של ET1 ו1.5 μl של פתרונות HP3. התמהיל הזה הוא בשביל בריכה 1, אם יותר בריכות מוכנות, להכפיל כרכים אלה במספר הבריכות שהוכנו.
    18. הסר את הצלחת מהדוכן המגנטי. הוספת 23 μl של הבלבול מוכן לעיל. הגדר את פיפטה ל23 μl ופיפטה בעדינות מעלה ומטה 15x כל הנפח. חותם את הצלחת ולהשאיר למשך 5 דקות ב RT. צנטריפוגה 1 דקות ב280 XG ב 20 מעלות צלזיוס.
    19. מניחים את הצלחת על הדוכן המגנטי למשך 2 דקות. ודא שsupernatant מופיע ברור לחלוטין. הסר את סרט ההדבקה ולהעביר 21 μl של supernatant ל96 גם צלחת חדשה.
    20. הוסף 4 μl של פתרון ET2 היטב כל אחד. הגדר את פיפטה ל25 μl ובעדינות פיפטה כל הנפח למעלה ולמטה 10x ולאטום את הצלחת.
      הערה: ההליך ניתן יהיה לעצור בנקודה זו והתגובות לאחסן עד 7 ימים ב-15 ° C. אם הצלחת קפוא, להפשיר לחלוטין לפני שמתחיל הכלאת 2 nd.
  3. הכלאה 2 nd
    1. צנטריפוגה הצלחת 1 דקות ב280 XG ב 20 מעלות צלזיוס. הסר את סרט ההדבקה ולהוסיף 50 μl של NCT1, 10 μl של CSO, ו15 μl מים כיתה PCR ל25 μl של ספרייה. הגדר את פיפטה ל100 μl ופיפטה בעדינות מעלה ומטה 10x כל הנפח.
    2. חותם את הצלחת ו צנטריפוגות 1 דקות ב280 XG ב 20 מעלות צלזיוס.
    3. מניחים את הצלחת בthermocycler (הכיסוי המחומם ב100 ° C) ולהפעיל תכנית 2 (טבלה 1).

.5 GDNA העשרה: יום 2, אחה"צ

  1. לפני שמתחיל
    1. הפשירי ET1, ET2, SMB, WS1, WS2, WS3 ופתרונות HP3 ב RT לשטיפת הכלאה. מערכת העשרת DNA, להפשיר פולימראז PCR תערובת האב מכיל (TC-PMM), קוקטייל PCR פריימר (PPC), ופתרונות RSB על קרח להגברת PCR.
  2. 2 nd הכלאה לשטוף
    1. בצע את אותו הפרוטוקול בדיוק כפי של4.2-1 לשטוף הכלאת st.
  3. PCR הגברה
    1. ב96 גם צלחת חדשה, לערבב 20 μl של elution מצעד 5.2, 25 μl של TC-PMM, ו5 μl של PPC. הגדר את פיפטה ל50 μl ופיפטה בעדינות מעלה ומטה 10x כל הנפח. חותם את הצלחת ו צנטריפוגות 1 דקות ב280 XG ב 20 מעלות צלזיוס.
    2. מניחים את הצלחת בthermocycler (הכיסוי המחומם ב100 ° C) ולהפעיל תכנית 3 (טבלה 1).

.6 GDNA העשרה: יום 3

  1. לפני שמתחיל
    1. פתרון הפשרת RSB על קרח. לפחות 30 דקות לפני השימוש, להביא חרוזים מגנטיים טיהור לRT.
  2. טיהור PCR
    1. צנטריפוגה את הצלחת מצעד 5.3 1 דקות ב280 XG ב 20 מעלות צלזיוס, ולהסיר את כיסוי הדבק.
    2. ב RT, להוסיף 90 μl של previously מעורב חרוזים מגנטיים טיהור בכל טוב. הגדר את פיפטה ל140 μl, פיפטה בעדינות מעלה ומטה 10x כל הנפח. דגירה של 15 דקות ב RT. מניחים את צלחת 96 היטב על מעמד מגנטי עבור 5 דקות ב RT. ודא שsupernatant מופיע ברור לחלוטין.
    3. הכן פתרון אתנול 80% טרי (ל2 דוגמאות, להוסיף 200 μl של מים מזוקקים ל800 אתנול μl). מחק את טיפול לקיחת supernatant לא להפריע גלולה.
    4. תוך שמירה על הצלחת על הדוכן המגנטי, להוסיף 200 μl של מוכן טרי אתנול 80% לכל אחד גם מבלי להפריע חרוזים ודגירה את הצלחת ל30 שניות ב RT. בטל supernatant וחזור לשטוף זה עוד פעם אחת. ודא אתנול הוסר. בוא יבש ב RT במשך 15 דקות או עד אידוי של אתנול מלא תוך הצלחת היא על הדוכן המגנטי.
    5. הסר את הצלחת מהדוכן המגנטי ולהוסיף 30 μl של חיץ RSB. הגדר את פיפטה ל30 μl, ובעדינות פיפטה tהוא כל נפח למעלה ולמטה 10x. דגירה את הצלחת למשך 2 דקות ב RT.
    6. מניחים את צלחת 96 היטב על הדוכן המגנטי ודגירה של 5 דקות או עד supernatant מופיע ברור לחלוטין. בעדינות להעביר 28 μl של supernatant ל96, גם צלחת (סוג צלחת: TCY) חדש.
      הערה: ההליך ניתן יהיה לעצור בשלב זה והתגובות המאוחסנות ב-15 מעלות צלזיוס למשך עד 7 ימים.
  3. ספריית אימות וכימות
    1. לקבוע את האיכות של הספרייה על ידי שימוש במנתח בר. ג'ל אלקטרופורזה acrylamide רזולוציה גבוהה עשויה לשמש כדי להחליף את השלבים שהוזכרו לעיל, אך לא מומלצת. שברים צריכים להיות בין 150 נ"ב ו -1,000 נ"ב.
      הערה: מומלץ: לכמת את הספרייה על ידי qPCR כדי לקבל את המספר הטוב ביותר של אשכולות במהלך רצף.
    2. כנקודת התייחסות, להשתמש בספריית תוקף (2 ננומטר). אם הספרייה הראשונה היא להיות מוכנה, השתמש בהפאג PhiX DNA (10 ננומטר) הניתן לכיול של sequencing מכשיר.
    3. הכן דילולים סידוריים של בקרה חיובית כדי להשיג 7 נקודות ב20, 16, 8, 6, 4, 2, וראש הממשלה 1 בEBT (חיץ Tween 0.1% elution EB 20). לדלל את הספרייה של ריבית ב1 / 1,000 ו 1 / 2,000. כל נקודה יש ​​לנתח בשלושה עותקים.
    4. מכין את התערובת הבאה (הכרכים להכפיל במספר הבארות בשימוש): ל1 גם, להוסיף 10 μl של SYBR ירוק המכיל תערובת אב qPCR (2x), 0.2 μl של פריימר קדימה (10 מיקרומטר, AATGATACGGCGACCACCGAGAT), 0.2 μl של פריימר ההפוכה (10 מיקרומטר, CAAGCAGAAGACGGCATACGA), ו7.6 מים כיתה PCR μl.
    5. לאחר הערבוב, להדיח בצלחת 96 היטב, 18 μl של תערובת לתוך כל μl היטב ו2 של דילולים שליטה וספרייה חיוביים. חותם את הצלחת ו צנטריפוגות 1 דקות ב280 XG ב 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, מניח את הצלחת PCR כמו תכנית thermocycler וריצת 4 (טבלה 1).
    6. לנתח את התוצאות ככימות מוחלט קונבנציונלי כדי להשיג את התשואה של כל ליטרibrary. היתרון של qPCR הוא שזה רק מכמת DNA שיהיה אינטראקציה עם תא הזרימה.
      הערה: אין להשתמש בכימות fluorimetric של DNA בשל נוכחותם של מולקולות DNA כוזבות באחד מהחומרים הכימיים. שיטת כימות זה יהיה להעריך את תשואת הספרייה וכתוצאה מכך להמעיט בערכו ציון קיבוץ באשכולות.
  4. השקת רצף
    1. לדלל כל ספרייה ב4 ננומטר בנפח סופי של μl 30 של חיץ elution (EB), וברכה כל הספריות ומערבבים היטב.
    2. הכן פתרון N NaOH טרי 0.2 במאגר EB ולערבב 10 μl של פתרון NaOH זה עם 10 μl של ספריות ותקווינה. מערבבים היטב דגירה בדיוק 5 דקות ב RT.
    3. לאחר 5 דקות, להוסיף באופן מיידי 980 μl של חיץ הכלאה (ממחסנית רצף) ומערבבים היטב. לאחר מכן, לערבב 400 μl של תערובת זו עם 600 μl של חיץ הכלאה. מערבבים היטב ולהעביר 600 μl לתוך מחסנית 300 מחזור (2 x 150) להזרקה של 8PM. רצף הפעלה.

ניתוח .7 הנתונים

  1. ברגע שהמכשיר עבד את הנתונים, להעביר את קבצי .vcf .bam ולמחשב חדש.
    הערה: פיצול Transposase משלב עקבות. כתוצאה מכך, התוכנה באופן אוטומטי trims נתונים אלה.
  2. לאסוף וריאציות גנטיות שהושגו עם ניתוח המכשיר.
  3. ניתוח קבצים מיוצאים (.bam, .vcf) עם תוכנה אחרת (Alamut) על ידי ביצוע הוראות היצרן. לאחר מכן, השווה את הווריאציות הגנטיות שהושגו עם שני הניתוחים. רק וריאציות זוהו פעמיים נחשבות נוכחי.

.1 תנאי PCR שולחן

תכנית טמפרטורה זמן Num. חזרות
1 72 מעלות צלזיוס 3 דקות 1
98 ° C 30 שניות 1
98 ° C 10 שניות 10
60 ° C 30 שניות
72 מעלות צלזיוס 30 שניות
72 מעלות צלזיוס 5 דקות 1
10 ° C ללא הגבלה
2 95 מעלות צלזיוס 10 דקות 1
93 ° C 1 דקות 1
91 ° C 1 דקות 1
89 ° C 1 דקות 1
87 ° C 1 דקות 1
85 ° C 1 דקות 1
83 ° C 1 דקות 1
81 ° C 1 דקות 1
79 ° C 1 דקות 1
77 ° C 1 דקות 1
75 ° C 1 דקות 1
71 ° C 1 דקות 1
69 ° C 1 דקות 1
67 ° C 1 דקות 1
65 מעלות צלזיוס 1 דקות 1
63 ° C 1 דקות 1
61 ° C 1 דקות 1
59 ° C 1 דקות 1
58 ° C 1 דקות 16-18 לשעה
3 98 ° C 30 שניות 1
98 ° C 10 שניות 10
60 ° C 30 שניות
72 מעלות צלזיוס 30 שניות
72 מעלות צלזיוס 5 דקות 1
10 ° C ללא הגבלה
4 95 מעלות צלזיוס 10 דקות 1
95 מעלות צלזיוס 15 שניות 40
60 ° C 1 דקות

תוצאות

תוצאות QC המדגם

היכולת של שיטה זו כדי לקבוע רצפים של גני המטרה מבוססת על איכות gDNA (איור 2 א) והאיכות של צעד tagmentation. אם tagmentation אינו מספיק (איור 2, פנל עליון), הרצף לא יהיה משביע רצון. כפי שצוין לעיל, לאחר טיהור tagmentation, gDNA ?...

Discussion

השימוש הנרחב במכשירי NGS וטכנולוגיות סיפקו הזדמנויות חדשות בחקר הסרטן והפרעות גנטיות. בנוסף לרצף הגנום כולו או רצף RNA, הניתוח של כמות גדולה של רצפי gDNA נבחרו בחולים רבים בו זמנית מציע סיכויים רבים באבחנה. כאן, פיתחנו עיצוב ספציפי (זמין על פי דרישה) באמצעות טכנולוגיית Nexter...

Disclosures

The authors have no conflicts of interest to declare.

Acknowledgements

We thank the Ligue contre le Cancer de Côte d’Or and the Centre Georges-François Leclerc for their financial support. We thank Philip Bastable for the editing of the manuscript.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
MiSeqIlluminaSY-410-1001Sequencing/medium throughput device
Nextera Enrichment kitIlluminaFC-123-1208Transposase based technology
300 cycle cartridgeIllumina15033624
AMPure beadsBeckman CoulterA63881Magnetic purification beads
Magnetic standAlpaquaA32782
96-well PlatesLife Technologies4306737
MIDI 96-well platesBioradAB0859
Microseal ABioradMSA-5001This seal is necessary only for PCR amplification. Other standard seals can be used throughout the experiment
MiSeqIlluminaProvided with the sequencing device
Experiment Manager software
Internet adress: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new
Manufacturer website tool

References

  1. Cornelisse, C. J., Cornelis, R. S., Devilee, P. Genes responsible for familial breast cancer. Pathol. Res. Pract. 192 (7), 684-693 (1996).
  2. Culver, J., Lowstuter, K., Bowling, L. Assessing breast cancer risk and BRCA1/2 carrier probability. Breast Dis. 27, 5-20 (2007).
  3. Cox, D. G., et al. Common variants of the BRCA1 wild-type allele modify the risk of breast cancer in BRCA1 mutation carriers. Hum. Mol. Genet. 20 (23), 4732-4747 (2011).
  4. Maia, A. T., et al. Effects of BRCA2 cis-regulation in normal breast and cancer risk amongst BRCA2 mutation carriers. Breast Cancer Res. 14 (2), 63 (2012).
  5. Anczuków, O., et al. BRCA2 deep intronic mutation causing activation of a cryptic exon: opening toward a new preventive therapeutic strategy. Clin. Cancer Res. 18 (18), 4903-4909 (2012).
  6. Brewster, B. L., et al. Identification of fifteen novel germline variants in the BRCA1 3'UTR reveals a variant in a breast cancer case that introduces a functional miR-103 target site. Hum. Mutat. 33 (12), 1665-1675 (2012).
  7. Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nat Rev Cancer. 12 (1), 68-78 (2012).
  8. Ma, X. D., et al. First evidence for the contribution of the genetic variations of BRCA1-interacting protein 1 (BRIP1) to the genetic susceptibility of cervical cancer. Gene. 524 (2), 208-213 (2013).
  9. Haanpää, M., Pylkäs, K., Moilanen, J. S., Winqvist, R. Evaluation of the need for routine clinical testing of PALB2 c.1592delT mutation in BRCA negative Northern Finnish breast cancer families. BMC Med. Genet. 14, 82 (2013).
  10. Southey, M. C., Teo, Z. L., Winship, I. PALB2 and breast cancer: ready for clinical translation. Appl. Clin. Genet. 6, 43-52 (2013).
  11. Ulahannan, D., Kovac, M. B., Mulholland, P. J., Cazier, J. B., Tomlinson, I. Technical and implementation issues in using next-generation sequencing of cancers in clinical practice. Br. J. Cancer. 109, 827-835 (2013).
  12. Hernan, I., Borràs, E., de Sousa Dias, M., Gamundi, M. J., Mañé, B., Llort, G., Agúndez, J. A., Blanca, M., Carballo, M. Detection of genomic variations in BRCA1 and BRCA2 genes by long-range PCR and next-generation sequencing. J. Mol. Diagn. 14, 286-293 (2012).
  13. Knierim, E., Lucke, B., Schwarz, J. M., Schuelke, M., Seelow, D. Systematic comparison of three methods for fragmentation of long-range PCR products for next generation sequencing. Plos One. 6, e28240 (2011).
  14. de Sousa Dias, M., Hernan, I., Pascual, B., Borràs, E., Mañé, B., Gamundi, M. J., Carballo, M. Detection of novel mutations that cause autosomal dominant retinitis pigmentosa in candidate genes by long-range PCR amplification and next-generation sequencing. Mol. Vis. 19, 654-664 (2013).
  15. . The Breast Cancer Linkage Consortium. Cancer Risks in BRCA2 Mutation Carriers. J. Natl. Cancer Inst. 91, 1310-1316 (1999).
  16. Levy-Lahad, E., Friedman, E. Cancer risks among BRCA1 and BRCA2 mutation carriers. Br. J. Cancer. 96 (1), 11-15 (2007).
  17. Risch, H. A., et al. Population BRCA1 and BRCA2 mutation frequencies and cancer penetrances: a kin-cohort study in Ontario, Canada. J. Natl. Cancer Inst. 98 (23), 1694-1706 (2006).
  18. Slater, E. P., et al. PALB2 mutations in European familial pancreatic cancer families. Clin. Genet. 78, 490-494 (2010).
  19. Brennan, G. T., Relias, V., Saif, M. W. BRCA and pancreatic cancer. J.O.P. 14 (4), 325-328 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

92gDNANexteraNGSBRCA1BRCA2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved