רכישת באיכות גבוהה וידאו דיגיטלי של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; Behaviors הזחל ומבוגרים מנקודת מבט רוחבי

Summary

כאן אנו מתארים טכניקה מיקרוסקופית פשוטה ונגישה לציבור רחב לרכוש וידאו דיגיטלי באיכות גבוהה של מבוגרים תסיסנית ופנוטיפים מוטציה זחל מנקודת מבט לרוחב.

Abstract

תסיסנית היא מערכת מודל ניסיוני רבת עוצמה ללימוד הפונקציה של מערכת העצבים. מוטציות גנטיות הגורמות לתפקוד לקוי של מערכת העצבים לעתים קרובות לייצר זחלים ומבוגרים שיש להם פנוטיפים פגומים תנועה שקשה לתאר במידה מספקת עם טקסט או מייצג לחלוטין עם דימוי הצילומי יחיד קיימא. מצבים הנוכחיים של הוצאה לאור מדעי, לעומת זאת, תומכים בהגשה של מדיה וידאו דיגיטלית כחומר משלים ללוות כתב יד. כאן אנו מתארים טכניקה מיקרוסקופית פשוטה ונגישה לציבור רחב לרכישת וידאו דיגיטלי באיכות גבוהה של שני פנוטיפים זחל והמבוגרים דרוזופילה מנקודת מבט לרוחב. וידאו של תנועת זחל ומבוגר מצדו להציג הוא יתרון משום שהוא מאפשר התבוננות וניתוח של הבחנות ושינויים קלים בהתנהגות קטר חריגה. אנחנו השתמשנו בהצלחה בטכניקה זו כדי לחזות ולכמת aberrant זחילה התנהגויות בזחלי instar שלישיים, בנוסף לפנוטיפים מבוגרים מוטציה והתנהגויות הכוללים טיפוח.

Introduction

הפירות הנפוצים לטוס melanogaster דרוזופילה הוא מערכת מודל ניסיוני רבת עוצמה ללימוד הפונקציה של מערכת העצבים ^1-3. שימור האבולוציוני של מבנה ותפקוד של מערכת עצבים עם בני אדם, כמו גם קלות מניפולציה גנטית ומגוון רחב של כלים גנטיים גורמים דרוזופילה האורגניזם בכורה לדגמן מחלות ניווניות אנושיות ^4. מוטציות גנטיות הגורמות לתפקוד לקוי של מערכת העצבים לעתים קרובות לגרום לזחלי מוטציה קיימא ומבוגרי תסיסנית עם תנועה לקויה. פנוטיפים שנצפו במוטציות פגומות מערכת עצבים כוללים ירידה בשיעור של תנועה, תיאום חריג, ותנועות עוויתיות במבוגרים, וכן את גירעונות בהתכווצות נפיחה של קיר שרירי הגוף, ושיתוק חלקי של זחלים. פנוטיפים אלה נוצלו בפיתוח של מסכי גנטיים תפוקה גבוהה ומבחני תנועה של זחלי מוטציה ⁵, 6 והמבוגר ^7-10 דרוזופילה שנועד לכמת את ירידת ערך התנועה וזיהוי גנים חיוניות לתפקוד של מערכת העצבים. בעוד גישות אלה הן מאוד שימושיות לכימות התנהגויות קטר זחל ומבוגרים, הם לא מצליחים להעביר מידע איכותי על כל התנהגות חריגה ספציפית. לדוגמא, בזמן שזחלי instar שלישי מוטציה, עשויים להציג פרמטרים תנועה שינו בassay התנהגות, זה עלול להיות לא ברור אם זו היא התוצאה של שינויים בהתכווצויות peristaltic קצביות במהלך מחזור הזחילה, מחסור כללי בתיאום, או שיתוק חלקי של הגוף האחורי קיר שרירים. כאן אנו מתארים טכניקה מיקרוסקופית פשוטה ונגישה לציבור רחב לרכישת וידאו דיגיטלי באיכות גבוהה של מבוגרים תסיסנית ופנוטיפים קטר זחל מנקודת מבט לרוחב. וידאו דיגיטלי שנרכש מנקודת מבט רוחבית מאפשר תצפית הישירה וניתוח של הבחנות דקות בlocomotivהתנהגויות דואר מנטייה צד להציג יותר אינפורמטיבי.

Protocol

.1 מערכת מיקרוסקופ סטריאו

הערה: למרות שפרוטוקול זה הוא בקלות להתאמה לכמעט כל מערכת מיקרוסקופ סטריאו מצמידים את מצלמה דיגיטלית עם היכולת של רכישת וידאו, פרטים מסופקים על המערכת המשמשת במעבדה שלנו (טבלה של חומרים / ציוד).

1. לרכוש וידאו דיגיטלי באמצעות מיקרוסקופ סטריאו trinocular מצמידים את מצלמה דיגיטלית מסחרית.
2. על מנת זוג המצלמה הדיגיטלית המסחרית לנמל trinocular של מיקרוסקופ סטריאו, להסיר את ½x C-mount של נמל phototube של מיקרוסקופ סטריאו ולהחליף אותו עם 1X C-mount.
3. הר מצמד מצלמה דיגיטלי (43 חוט מ"מ) ל1X C-mount.
4. שתי טבעות הר צעד למטה, 58 מ"מ ל48 מ"מ, ו48 מ"מ ל43 מ"מ, למצמד המצלמה כדי לגשר על החיבור ממצמד המצלמה הדיגיטלי לערכת מתאם עדשה למצלמה הדיגיטלית.
5. לעלות את המצלמה הדיגיטלית לערכת מתאם עדשה.
6. לרכוש וידאו עם הגדלת מיקרוסקופ וזום אופטי של המצלמה הדיגיטלית מוגדרת להגדלת שילוב של כ 12X (30 מסגרות לשנייה, 640 480 פיקסלים). הערה: ההגדלה של מיקרוסקופ סטריאו חייבת להיות מתוגמלת בהתאם ל1X C-mount מחדש החדש של נמל trinocular.

.2 הדמיה דרוזופילה שלישית instar זחלים

1. סרט בטוש בלתי מחיק לצלחת השלב השחורה של מיקרוסקופ סטריאו מצמידים את מצלמה דיגיטלית כך שהצד של כובע הסמן תופס כ ⅓ ל¼ של השדה האנכי של התצוגה נצפתה בצג LCD המצלמה. השתמש בצמרות סמן כשלב לבצע הדמיה זחל, כי הם באים במגוון רחב של צבעים שיכולים לשמש לקוד צבע ולהבדיל גנוטיפים של זחלים שצלם.
2. מסמן את שדה הראייה שנצפתה בצג LCD המצלמה הדיגיטלי על פני השטח של למעלה הסמן עם נקודת קנססמן.
3. בחר זחל instar שלישי לתמונה. הקריטריונים לבחירת זחלי instar שלישיים היה אורך גוף, יציאה ממקור המזון בשלב הזחל של מחזור החיים, את נוכחותו של spiracles הקדמי והאחורי, ואת המבנה של הקרסים בלסת התחתונים, של הפה המנגנון ^11. להבטיח את הזחל הוא נקי על ידי שטיפתו ביסודיות במים.
4. להאיר את השלב העליון סמן הקבוע מלמעלה עם אור ממערכת תאורת סיבים אופטי. התאם את הזווית של אור האירוע לספק תאורה אופטימלית.
5. פוקוס מיקרוסקופ על קצה עליון בטוש בלתי מחיקה. בגין רכישת וידאו דיגיטלי.
6. מניחים את הזחל בצד של כובע הסמן כ 75 ° הרחק מהציר האנכי, ממש מחוץ לשדה הראייה, עם הקדמי של הזחל פונה לכיוון שדה הראייה (איור 1). הערה: מיקום של הזחל בצד של כובע הסמן מאפשר למצלמה שיא תנועה של הזחל דואר מנקודת מבט לרוחב. זה עוזר לשמור את הזחל לח עם מים כך שהם לא נופלים מהצד של כובע הסמן. טיפול חייב להיות מופעל, עם זאת, שלא להשתמש יותר מדי מים ככמויות עודפות תדבק הזחל כפי שהוא זוחל על פני השדה.
7. בעדינות לבדוק ולדקור את הזחל עם מכחול קטן לכפות אותו לזחול על פני שדה הראייה. היה סבלני כמו הזחלים לעתים רחוקות לשתף פעולה, ולעתים קרובות יש להחזיר לנקודת ההתחלה הרבה פעמים לפני שהם זוחלים ישר על פני השדה.
8. רשומה כ 10-15 דקות של מד רציף וידאו דיגיטלי ויבול ולהסיר את כל פוסט רכישת המד מיותר עם תוכנת עריכת וידאו דיגיטלית.

.3 ההדמיה דרוזופילה מבוגרים

1. הנח מבוגר יחיד דרוזופילה בקובט קלקר ספקטרוסקופיות 1.5 מ"ל חד פעמי.
   הערה: CO ₂ הרדמה של המבוגרים תסיסנית מייד לפני behavפרוטוקול ניתוח ioral יכול להתפשר תוצאות ^12. מומלץ שהמבוגרים תסיסנית תינתן תקופת 24 שעות להתאושש מCO ₂ הרדמה לפני הביצוע במבחן התנהגות ^13.
2. חבר את הקצה של קובט עם כדור צמר גפן קטן. ודא כדור צמר גפן הוא ארוז חזק מספיק כדי לכבוש את חלל כובע הגדול ומגביל את הזבוב לתא הנפח המופחת של קובט.
3. מניחים את קובט על צלחת השלב הלבנה של מיקרוסקופ סטריאו וליישר את תא הנפח המופחת של קובט עם שדה הראייה שנצפתה בצג LCD המצלמה הדיגיטלי כראוי.
4. להאיר את קובט מלמעלה עם אור ממערכת תאורת סיבים אופטי. התאם את הזווית של אור האירוע לספק תאורה אופטימלית.
5. פוקוס מיקרוסקופ ולהתחיל לרכוש וידאו דיגיטלי.
6. רשומות כ 30-45 דקות של מד רציף וידאו דיגיטלי ויבול ולהסיר את כל מיותרלאחר רכישת מדה עם תוכנת עריכת וידאו דיגיטלית.

תוצאות

אנחנו השתמשנו בהצלחה בטכניקה זו כדי לרכוש ולכמת את הפנוטיפ ההתנהגותי הזחל הקשורים לאובדן התפקוד של גן stathmin (איור 2) ^14. גן stathmin מקודד חלבון רגולטורי microtubule שמחיצות הדימרים טובולין מבריכות של טובולין המסיס, ונקשר microtubules ומקדם פירוקם ^15,16. פ?...

Discussion

כוח דרוזופילה של melanogaster כמערכת מודל לחקר תפקוד מערכת עצבים נובע במידה רבה מהשילוב של כלים גנטיים רבי עוצמה זמינה והמגוון הרחב של מבחני התנהגות חזקים פיתח. כאן אנו מציגים טכניקה מיקרוסקופית פשוטה ונגישה לציבור רחב לרכישת וידאו דיגיטלי באיכות גבוהה של מבוגר...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trinocular Stereozoom Microscope	Olympus Corporation	SZ6145TR	½ C-mount was removed and replaced with 1X C-mount
1X C-mount	Leeds Precision Instruments	LSZ-1XCMT2
Digital Camera Coupler (43 mm thread)	Qioptiq Imaging Solutions	25-70-10-02
58 mm to 48 mm Step Down Ring	B&H Video	GBSDR5848
48 mm to 43 mm Step Down Ring	B&H Video	GBSDR4843
Lensmate Adapter Kit for Canon G10	LensMateOnline.com
Canon PowerShot G10 Digital Camera	Canon U.S.A., Inc.
1.5 ml Spectroscopic Polysterene Cuvette	Denville Scientific	U8650-4