JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Intracellular transport of cargoes, such as vesicles or organelles, is carried out by molecular motor proteins that track on polarized microtubules. This protocol describes the correlation of the directionality of transport of individual cargo particles moving inside neurons, to the relative amount and type of associated motor proteins.

Abstract

הבנת המנגנונים שבאמצעותם מנועים מולקולריים לתאם את פעילותם להובלת מטענים בּוּעִי בתוך הנוירונים דורשת ניתוח כמותי של עמותות מנוע / מטען ברמת השלפוחית ​​אחת. מטרת פרוטוקול זה היא להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כמותי כדי לתאם ("המפה") העמדה והכיווניות של תנועת מטענים בשידור חי לסכומי ההרכב ויחסיים של מנועים הקשורים לאותו מטען. "מיפוי מטענים" מורכב מהדמית חיה של מטענים שכותרתו fluorescently נעו באקסונים בתרבית על מכשירי microfluidic, ואחריו קיבעון כימי בזמן ההקלטה של ​​תנועה חיות, ומכתים immunofluorescence שלאחר מכן (IF) של אותו האזורים axonal המדויקים עם נוגדנים כנגד מנועים. Colocalization בין מטענים ומנועים הקשורים בם נבחנים על ידי הקצאת עמדה תת פיקסלים קואורדינטות ערוצי מנוע ומטען, על ידי פונקציות גאוס הולמים לעקיפה-ליפונקציות נקודת התפשטות mited מייצגות מקורות נקודות ניאון פרט. תמונות מטען ומנוע קבועים לאחר מכן הן על גבי לחלקות של תנועת מטענים, ל" המפה "אותם למסלולים במעקב שלהם. כוחו של פרוטוקול זה הוא השילוב של חיה ואם הנתונים לרשום גם את הובלת מטענים בּוּעִי בתאים חיים ולקבוע את מנועים הקשורים למדויקת אותו שלפוחית ​​אלה. טכניקה זו מתגברת על אתגרים קודמים שמשתמשים בשיטות ביוכימיות כדי לקבוע את הרכב המנוע הממוצע של אוכלוסיות שלפוחית ​​תפזורת מטוהרות הטרוגנית, שיטות אלה לא חושפות יצירות על מטענים מרגשים אחד. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לניתוח של מסלולי תחבורה ו / או סחר אחרים בסוגי תאים אחרים, כדי לקשר בין התנועה של מבנים תאיים בודדים עם הרכב החלבון שלהם. מגבלות של פרוטוקול זה הן התפוקה נמוכה יחסית בשל יעילות transfection הנמוכה של תרביתנוירונים עיקרי ושדה מוגבל של תצוגה זמינה עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה. יישומים עתידיים יכולים לכלול את שיטות כדי להגדיל את מספר תאי העצב להביע מטענים שכותרתו fluorescently.

Introduction

תחבורה תאית היא קריטית בכל סוגי התאים לאספקת חלבונים, ממברנות, האברונים, ומולקולות איתות לתחומים תאיים שונים 1. נוירונים הם מאוד מיוחדים תאים עם תחזיות ארוכות, מקוטבות שהאנושות תלויה בתחבורה תאית של מטענים חיוניים למסירה למרחקים ארוכים שלהם לmicrodomains axonal השונים. תחבורה זה מתווכת על ידי kinesins וdyneins - שתי משפחות גדולות של חלבוני מנוע מולקולריים - לאגד את זה למטענים ולעקוב אחר לאורך microtubules המקוטב בכיוונים אנטרוגרדית ומדרדר, בהתאמה. בעוד שתנועת מדרדר בעיקר בתיווכו של dynein, תנועה בכיוון אנטרוגרדית היא הקלה על ידי משפחה גדולה, פונקציונלי מגוונת של מנועים kinesin. כתוצאה מכך, תחבורת האנטרוגרד מטעני axonal יכולה להיות מתווכת על ידי בני משפחה שונים של kinesin superfamily 1-5. למרות שכמה מטענים לנוע בעקביות בכל כיוון, מ 'מטעני OST להעביר bidirectionally ולהפוך לעתים קרובות בדרכם ליעדים הסופיים שלהם 1,5-13. יתר על כן, הוכח שמנועים של מתנגד לקשר יווניות בו-זמנית למטענים, להעלות את השאלה, כיצד תנועה מוסדרת מטענים מתואמת על ידי מנועים הפוכה-קוטביות 5-7. יחד, הובלת מטעני axonal הוא תהליך מרוכז שמוסדר על ידי הרכב המנועים ופעילותם הספציפית ביוכימי, אשר בתורו תלויה במתאמים שונים ושותפים המחייבים רגולציה 14.

נאמנות לתאר את המנגנון של תחבורת axonal למטען ספציפי ולחשוף את תקנה הבסיסית של תחבורה ש, זה הוא בעל חשיבות עליונה כדי לקבוע את ההרכב של חלבוני מנוע והשותפים המחייבים הרגולציה שלהם הקשורים למטענים בודדים במהלך הובלת החיות שלהם. שיטות אחרות, לגישות ביוכימיות דוגמא, מספקות הערכות של mot הממוצעאו יצירות על אוכלוסיות הטרוגניות שלפוחית ​​מטוהרת, אבל הערכות אלה אינן חושפות את הסוג או סכומים של מנועים הקשורים לשלפוחית ​​נעה אחת. כמו כן, הכינון מחדש של תחבורת שלפוחית ​​לאורך microtubules מוצר המורכב מראש במבחנה אפשר מדידת הכמות של סוג אחד של מנוע ברמה שלפוחית ​​אחת 15. עם זאת, ניסויים אלה לא ישירות לתאם הסכום של מנועים עם מאפייני התחבורה של שלפוחית ​​אלה, ונמדדו תחבורה בהיעדר גורמים רגולטוריים סלולריים.

פרוטוקול מוצג כאן, הקובע את הרכב המנוע (סוג וכמות היחסית של מנועים) של שלפוחית ​​נעה בודדת מimmunofluorescence נתונים (IF) מדידה באופן אנדוגני הביעו חלבוני מנוע, וקושר פרמטרים אלה לתחבורה החי של בדיוק את אותו שלפוחית ​​בנוירונים 16. שיטה זו כרוכה במיפוי מדויק של נתוני תנועת מטעני IF-כדי-לחיות. המטרה זו מושגת על ידי צומחנוירונים בהיפוקמפוס עכבר g במכשירי microfluidic הבאים הוקמו פרוטוקולי 17-19. מכשירים אלה מאפשרים לזיהוי ולמתאם ("מיפוי") של אקסונים ומטענים מרגשים יחידים באופני מיקרוסקופ אור קבועים וחיים (איור 1). נוירונים בתרבית הם transfected עם חלבוני מטען שכותרתו fluorescently התחבורה שהוא צילם ברזולוציה מרחב ובזמן גבוהה כדי לקבל מידע מפורט תנועה שהוא להתוות kymographs. במהלך ההדמיה, הנוירונים קבועים עם paraformaldehyde, ולאחר מכן מוכתם עם נוגדנים כנגד חלבוני מנוע אנדוגני. תמונות מטען ומנוע קבועים על גבי זו kymographs תנועה החי ל" מפה "(colocalize) למטען החי תנועת מסלולי 16. לתאם את התנועה החי של מטענים עם העמותה של חלבוני מנוע, colocalization מנותח באמצעות חבילת תוכנת MATLAB מותאמת אישית שנעשה בשם "מוטור colocalization "16,20. מטענים ומנועים שכותרתו fluorescently ליצור תכונות punctate עקיפה מוגבל שיכולים באופן חלקי חפיפה. כדי לפתור את המצב של חפיפת puncta, התוכנה ראשונה באופן אוטומטי מתאימה פונקציות גאוס לכל פונקצית נקודת התפשטות, המייצג puncta ניאון פרט, כדי לקבוע העמדה תת פיקסלים XY המדויקת שלהם מתאם ועוצמת אמפליטודות 21-23. העמדות של מנועים ומטענים הן בהשוואה לאחר מכן לאחד את השני כדי לקבוע colocalization 16,20. לכן, שיטה זו מדויקת יותר מקצה colocalization בין puncta הניאון בהשוואה לשיטות אחרות 24.

כוחה של שיטה זו הוא היכולת להעריך את colocalization של מנועים עם מטען אישי בתאים קבועים, שלמסלולי תנועה חיים (למשל, לכיוון שבו הם נעים בזמן של קיבעון) היו recorded. בשיטה זו, kinesins וdyneins נמצאו לקשר בו-זמנית לשלפוחית ​​שנושא את חלבון הפריון הנורמלי (-cellular C PRP), מטען מועשר neuronally שזז bidirectionally או נשאר נייח באקסונים 16. ניתוח זה אפשר גיבוש מודל עבודה להסדרת תנועת שלפוחית ​​PRP C שבי אנטרוגרדית (kinesin) ומנועים מדרדר (dynein) לתאם את פעילותם על מנת להעביר את שלפוחית ​​בכל כיוון או להישאר קבוע כאשר הקשורים למטען . כוח נוסף של שיטה זו הוא התחולה הרחבה הפוטנציאל שלה לאפיון colocalization / עמותת מטענים רבים שכותרתו fluorescently שנעים כמעט בכל סוג תא, עם כל חלבון אחר (ים) של עניין. כך, מתאם חי / קבוע עלול לאפשר זיהוי של אינטראקציות חלבון-מטען חולפים, fluorescently הבודד רב שכותרתו נע חלקיקים יכול להיות מנותח על p רצויeriod זמן. בהתחשב בתחולה הרחבה ואת סוג השאלות ששיטה זו יכולה לטפל, פרוטוקול זה יהיה עניין לקהל רחב של ביולוגים של תא כוללים אלה סחר הלימוד ותחבורה בתאי עצב או בסוגי תאים אחרים.

Protocol

כל הניסויים שנערכו בעקבות פרוטוקולים שאושרו ובהתאם להנחיות מוסדיות לטיפול האנושי בבעלי חיים במחקר. עכברי ילוד היו מורדמים על ידי עריפת ראש.

1. הכנה של המכשירים microfluidic תרבות תאים

  1. הכן siloxane polydimethyl (PDMS) מכשירי microfluidic לגדילה של נוירונים בהיפוקמפוס כפי שתואר על ידי האריס ועמיתי 17-19. להלן כמה שינויים שהותאמו לפרוטוקול מיפוי מטען.
    הערה: המכשירים microfluidic גם זמינים מסחרי (חומרי רשימה), ובכך גישה למתקן ייצור אינה הכרחית.
  2. הכן מס '½ 1 כוסות כיסוי (24 x 40 מ"מ) על ידי שטיפה אותם שלוש פעמים עם אצטון, ואחריו שלוש שוטף עם 100% אתנול ושלושה שוטף של מים. coverslips חנות במים ב 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. טיפולים אלה מסייעים להבטיח שcoverslips נקי מפסולת שיכול להפריע לציפוי של cells, זיהום, והישרדות.
    הערה: אצטון ואתנול דליקים ומסוכנים במקרה של מגע בעור (גירוי), קשר עין (גירוי), של בליעה, של שאיפה. השלך על פי תקנות רשמיות.
  3. כאשר מוכן לשימוש, למקם את מכסה זכוכית אחד בצלחת תרבית תאי 60 מ"מ למכשיר microfluidic, ולתת לו להתייבש באוויר נחשף במשך 45 דקות בתוך ארון בטיחות ביולוגי, כדי למנוע זיהום.
  4. לאחר ההתקנים לגזור מן המאסטרים ואגרופים כבר לחתוך כדי ליצור את מאגרי המים (איור 1 א, ב '), למקם אותם בערוצי microfluidic הצד למעלה בתוך ארון בטיחות ביולוגי מצוידים במנורת UV למשך 45 דקות לעיקור.
    הערה: השארת מכשירים תחת טיפול UV למשך זמן ארוך יותר מ- 2 hr עלולה להשפיע על שלמות PDMS.
  5. להרכיב את המכשירים על ידי הצבת מכשיר אחד על כל מכסה זכוכית בתוך צלחת תרבית תאי פלסטיק 60 מ"מ, כך שערוצי microfluidic עם הפנים כלפי מטה. להפעיל לחץ עדין o העליונהו המכשיר (להימנע מלגעת microchannels) כדי לספק חותם לא קבוע של המכשיר לכיסוי הזכוכית. כיסוי כל צלחת תרבית תאי 60 מ"מ עם מכסה.
  6. שימוש micropipette, מימה המכשירים על ידי הוספת מים כיתה תרבית תאים לשני מאגרים העליונים microfluidic (1 ו -2 באיור 1 א), המאפשרת למים לזרום דרך. הסר מים עם micropipette ולהוסיף 1 מ"ג / מיליליטר poly-L- ליזין למאגר microfluidic 1 (200 μl) ו -2 (100 μl). ההפרש הנפח יאפשר לpoly-L- ליזין לזרום דרך microchannels (איור 1 א, ב ').
  7. כדי להבטיח שהמכשירים בתוך תרבות מנות תא 60 מ"מ לא ליפול בתוך 37 ° C חממה, מקום שלוש מנות תרבות תא 60 מ"מ המכילות מכשירים לצלחת תרבית תאי פלסטיק 150 מ"מ ולכסות את הצלחת עם מכסה. דגירה O / N בחממה 37 ° C עם 5% CO 2. בדרך כלל יותר מ -90% מהערוצים הם שמישים לכל מכשיר ולעשותלא מכיל בועות אוויר או חסימה פיזית.
  8. ביום המחרת, להחליף poly-L- ליזין במים ולהשאיר את המכשיר באינקובטור במשך שעה לפחות 1. חזור על זה כביסה שלוש פעמים. הסר מים ומוסיף Neurobasal-מדיום גידול (המכיל 2% B-27 תוסף ו500 מיקרומטר Glutamax) לכל התקן. השאר O / N בחממה 37 ° C עם 5% CO 2.
  9. ביום המחרת, תאי צלחת בהיפוקמפוס, כמתואר להלן.

2. ציפוי של עכבר בהיפוקמפוס ראשי נוירונים במכשירים microfluidic

הערה: ההכנה של תאי עצב בהיפוקמפוס בתרבית מחולדות ילוד כבר פורסמה בעבר ביופיטר 25. להלן כמה שינויים שהותאמו לתאי עצב בהיפוקמפוס עכבר צלחת במכשירי microfluidic, וכי היו אופטימליים עבור transfections.

  1. לפני נתיחת מוח עכבר, 10% סרום הנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM) טרום חם המכיל שור עוברי(FBS; ללא אנטיביוטיקה), תערובת (DL-ציסטאין 125 מ"ג, 125 מ"ג אלבומין בסרום שור (BSA) ו3.125 גרם של D-גלוקוז ב500 מיליליטר של תמיסת מלח שנאגרו פוספט (PBS); סנן לעקר דרך מסנן 0.22 מיקרומטר) , וdeoxyribonuclease פתרון (אני DNase: 50 מ"ג של DNase אני ו0.5 מיליליטר של תמיסת 1.2 M MgSO 4 ב 100 מיליליטר מאוזן תמיסת מלח של האנק מסנן (HBSS) לעקר דרך מסנן 0.22 מיקרומטר) באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
    1. Neurobasal-מדיום גידול טרום חם בתוך 37 ° C חממה עם 5% CO 2 לאזן את רמת החומציות.
  2. לנתח hippocampi מעכברי ילוד ישנים 1-3 יום על פי פרוטוקולים הוקמו 26. שמור hippocampi בצינור חרוטי 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר חיץ דיסקציה (HBSS המכיל 10 HEPES מ"מ pH 7.4, 50 גלוקוז מ"מ, 100 U / פניצילין מיליליטר ו 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין), על קרח. לשים עד 4 hippocampi לכל צינור חרוטי 15 מיליליטר.
  3. בצע את הפרוטוקול שנותר הוא בתנאים סטרילייםשל בתוך ארון בטיחות ביולוגי.
  4. לדלל 45 יחידות של פפאין ב 5 מיליליטר של תערובת, מערבולת, ודגירה במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עד לאבקת פפאין נמס. הוסף 1 מיליליטר של DNase אני פתרון. סנן את התערובת דרך יחידת מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר.
  5. זהירות לשאוב HBSS 'מhippocampi צינור המכיל חרוטי 15 מיליליטר. להוסיף 10 מיליליטר קר (4 ° C) HBSS לhippocampi ולתת להם להתיישב לתחתית של התחתית. לשאוב HBSS בזהירות מצינור חרוטי 15 מיליליטר.
  6. להוסיף פפאין 1 מיליליטר / DNase אני מערבב לעד 4 hippocampi דגירה במשך 20-30 דקות על 37 מעלות צלזיוס. הטה צינור חרוטי כל 5 דקות להתרחץ hippocampi בתערובת. לחלופין להציב hippocampi שייקרה אמבט מים 37 מעלות צלזיוס עם (~ 100 סל"ד) הטלטול העדין.
  7. פפאין לשאוב / DNase אני מערבב ולשטוף hippocampi פעמיים עם DMEM המחומם מראש (37 ° C) המכיל 10% FBS.
  8. לאחר לשטוף את השני, להוסיף 2 מיליליטר של DMEM מראש חימם מכיל 10% FBS לhippocampi וhippocampi triturate ידני על ידי pipettingלמעלה ולמטה ~ 10-12 פעמים באמצעות קצה פיפטה 1 מיליליטר לניתק נוירונים.
  9. בואו triturate להסתפק ~ 1 דקות כמו זה יאפשר נוירונים ניתקו לא להתיישב לתחתית צינור חרוטי. העברת supernatant המכיל נוירונים ניתקו צינור חרוטי 15 מיליליטר חדש הימנעות העברת רקמות גדולות יותר כי יש התיישבו בחלק התחתון של הצינור.
  10. ספין תאי XG ב 1000 למשך 2 דקות ולהסיר supernatant בזהירות מבלי להפריע גלולה התא. Resuspend תאים ב -80 μl Neurobasal-מדיום גידול על ידי pipetting בעדינות.
  11. הסר בינוני ממאגר microfluidic 1 ו '1. החל 20 μl של תאים (~ 275,000) למאגר microfluidic 1, ולאפשר להם לזרום. תניח את המכשיר ב -37 חממת ° C עם 5% CO 2 למשך 20 דקות.
  12. חפש תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח שתאים יש דבק הזכוכית המכסה. להוסיף Neurobasal-מדיום גידול לראש הדף את כל המאגרים. חזור מכשיר עם תאים לחממת 37 ° C עם 5% CO 2.
  13. בדקו מכשירים כל אידוי ~ 2-3 ימים ומאגרים העליונים את עם Neurobasal-2% תוסף המכיל B-27 (ללא Glutamax), כדי למנוע. נוירונים להתחיל להאריך האקסונים שלהם דרך ערוצי microfluidic ~ 2-3 ימים לאחר ציפוי. הנוירונים בכפוף לtransfection בדרך כלל 7-10 ימים לאחר ציפוי.

3. Transfection של נוירונים בהיפוקמפוס גדל במכשיר microfluidic

  1. לכל מכשיר, להכין תערובת של Lipofectamine 1.2 μl 2000 ב-30 μl Neurobasal-, ותערובת של 0.5 מיקרוגרם פלסמיד היתוך מטען ניאון ב -30 μl Neurobasal-דגירה 5 דקות ב RT. להוסיף תערובת Lipofectamine לתערובת DNA ודגירה במשך 20 דקות ב RT. הוסף 60 μl של Neurobasal-המכיל 4% תוספת B-27 ל- DNA / Lipofectamine לערבב ולערבב על ידי מצליף את הצינור.
  2. הסר את כל המדיה ממאגר microfluidic 2 ו 2 'ובזהירות למלא את בארות עם Neurobasal-המכילות 2% תוספת B-27 מבלי לשפוך מעל int הבינוניo התאים האחרים.
  3. הסר את המדיה ממאגר microfluidic 1 ו '1. להוסיף 120 μl של ה- DNA / Lipofectamine לערבב למאגר microfluidic 1 ולתת לו לזרום. חזור מכשיר 37 חממת ° C עם 5% CO 2 ל3-4 שעות.
  4. הסר את כל המדיה ממאגר microfluidic 1 ו 1 'ולהחליף עם Neurobasal-2% תוסף המכיל B-27 למשך 24 שעות (או עד שמוכן תמונה). בדרך כלל, 5-7 האקסונים הצומחים במשך microchannels הם transfected בתנאים אלה, המייצגים כ 1-3% יעילות transfection בקנה אחד עם יעילות פורסמה לתאים בתרבית בהיפוקמפוס 26.

4. ניתוח "מטען מיפוי"

  1. הדמיה חיה של תנועת מטענים
    1. לבצע הדמיה על מיקרוסקופ epifluorescence אור הפוך מצוידים ב37 ° C חממה וחדר בקרה CO 2.
    2. הר coverslip עם נוירונים בהיפוקמפוס גדלו בMICRמכשיר ofluidic לבמה מיקרוסקופ. כדי להימנע ממוות עצבי, לעבוד בזריזות כדי לשמור על הדגימות במיקרוסקופ במשך שעה לא יותר מ 1.
    3. באמצעות מטרה ברזולוציה גבוהה (100X), למצוא האקסונים של תאי transfected שמרחיבים בערוצים של תאי microfluidic ולרשום את המספר של הערוצים שבי האקסון transfected נמצא. לספור את מספר הערוצים בדלפק יד מספר הנקודות.
      1. להקלטה אופטימלית של תנועה חיות וניתוח colocalization שלאחר מכן, לבחור האקסונים הגדלים שטוחות יחסית בערוצים כך הדמיה זו של רוב שלפוחית ​​יכולה להתבצע בפוקוס.
    4. להסיר את רוב הבינוני ממאגרים 2 ו 2 'עם טפטפת העברת פלסטיק 1 מיליליטר. כדי להקל על היישור הבא של תמונות קבועות עם מסלולי תנועה בkymographs, ליישר את הקצה הימני של microchannels עם שדה הראייה במהלך ההדמיה (איור 1 ב, ג).
    5. כדי להקל על fixinגרם של הדגימות במהלך הדמיה, לבצע הדמיה חיה עם שני אנשים. לחלופין, אם הדמיה חיה מבוצעת על ידי אדם אחד, להשתמש במערכת מיקרוסקופ מצוידת בתיקון להיסחף.
    6. התחל תנועת מטענים בשידור חי הדמיה עם מפרט הזמן לשגות ספציפי לדינמיקה הובלת המטענים המנותחות (מפרטי מיקרוסקופ והגדרות הדמיה YFP-PRP C מפורטים באגדה של איור 2 וחומרי רשימה).
    7. לאחר שנתוני תנועה חיים מספיק כבר נאספו, יש לי אדם אחד למלא את המאגרים 2 ו 2 'עם paraformaldehyde 4% מראש חימם PBS המכיל 0.04 גרם / מיליליטר סוכרוז לתקן את התאים. הימנע מלגעת במכשיר microfluidic, כמו זה יהיה לשבש את המיקוד של ההדמיה החיה. יש האדם האחר לשנות את הפוקוס בזמן שמקבע הוא הוסיף. קיבעון הוא מוצלח כאשר הפסקה מיידית של תנועה הוא ציין. להוסיף מקבע למאגר '1 ולאחר מכן 1.
      הערה: photoblea הזמניצ'ינג של הקרינה המטען עשוי להיות גם ציין, אך הקרינה נמשכת לאחר צביעה אם לחלבוני מנוע הושלמה (השלב ​​הבא).
      הערה: Paraformaldehyde מזיק על ידי שאיפה, במגע עם עור, ואם בלע. מעצבן לעיניים, מערכת נשימה ועור. השלך על פי תקנות רשמיות.
  2. אם מכתים של חלבוני מנוע לניתוח colocalization
    הערה: כדי לכמת את רמות יחסי של חלבוני מנוע (כפי שנקבע על ידי צביעת נוגדן), הקשורים למטענים מרגשים בודדים, לאמת ולכייל נוגדנים כדי לוודא שהנוגדן אנטיגן מחייב רווי. הדבר נעשה על ידי קביעת הספציפיות של הנוגדן באמצעות תאי עצב שבחלבון של עניין כבר דפק החוצה או או דפק למטה, ועל ידי ביצוע אם ניתוח עם עלייה בריכוזי נוגדנים. לבקרות שליליות, תאי עצב מגואלות נוגדנים משני בהעדר נוגדנים ראשוניים. מפורט יותרניתן למצוא תיאור של אימות הנוגדן בEncalada et al. 16, וSzpankowski et al. 20.
    1. הסר את coverslip עם נוירונים בהיפוקמפוס גדלו במכשיר microfluidic מבמת מיקרוסקופ. לא לנתק את מכשיר microfluidic מcoverslip, כmicrochannels צריכה להישאר שלם כדי להרכיב את התמונות בשידור חיות וקבועים. בצע את השלבים הבאים בתא לחות.
    2. כדי להבטיח את הזרימה של פתרונות לmicrochannels, לשמור על ההפרש חיץ נפח בין מאגרי 1, 1 ', ו -2, 2' של לפחות 30 μl. בכל הצעדים הבאים. לדוגמא, להוסיף 100 מדיה μl נפח מאגר microfluidic 2, 2 ', ו -70 μl תקשורת נפח מאגר microfluidic 1, 1'.
    3. הסר מקבע מלשכתו של מכשיר microfluidic ולשטוף תאים שלוש פעמים עם PBS מחכה 10 דקות בין שוטף.
    4. Permeabilize תאים על ידי הוספת 0.1% Triton X-100 diluטד בPBS למשך 5 דקות לכל המאגרים.
    5. הסר פתרון מכל המאגרים ולשטוף עם PBS. חזור על שטיפה שלוש פעמים מחכות 10 דקות בין שוטף.
    6. הסר פתרון מכל המאגרים ולהחיל חסימת מאגר המכיל חמור סרום 10% רגיל ו -3% פרוטאז G חופשי ואימונוגלובולינים (IgG) BSA -חינם ב PBS ו דגירה של לפחות 30 דקות ב RT.
    7. ספין פתרון מניות נוגדן ראשוני ב -20,000 XG במשך 5 דקות כדי להסיר את משקעים. לדלל נוגדן לריכוז מתאים בחסימת מאגר. החלף את חיץ חסימה ממכשיר microfluidic עם פתרון נוגדן. דגירה דגימות לשעה 2 ב RT או O / N ב 4 מעלות צלזיוס.
    8. הסר פתרון מכל המאגרים ולשטוף שלוש פעמים עם PBS, מחכה 10 דקות בין שוטף.
    9. ספין פתרון מניות נוגדנים משני ב20,000 XG במשך 5 דקות כדי להסיר את משקעים. לדלל נוגדן לריכוז מתאים בחסימת מאגר. להחליף PBS עם פתרון נוגדנים משני. דגירהדגימות עבור שעה 1 ב RT.
    10. הסר פתרון מכל המאגרים ולשטוף שלוש פעמים עם PBS, מחכה 10 דקות בין שוטף.
    11. להחליף PBS עם ~ הרכבה בינונית 10-20 μl ישירות על ידי pipetting בינוני הרכבה לפתיחת ערוצי חיבור המאגרים. בואו הרכבה יבשה תקשורת ל~ 20 דק '- שעה 1 בRT.
    12. מכשירי חנות ב 4 ° C המוגנים מפני אור, כדי למנוע photobleaching, ואקסונים תמונה בתוך שני ימים (שבוע לכל היותר) של מכתים.
    13. לאחר הצביעה הושלמה, הר coverslip עם נוירונים בהיפוקמפוס גדלו במכשיר microfluidic לבמה מיקרוסקופ. אתר את האזור של האקסון transfected צילם בשלב 4.1.1-4.1.7.
    14. לרכוש תמונות Z-מחסנית (300 מדרגות ננומטר) לכל אחת משלושת הערוצים: המטען, מנוע 1, מנוע 2, באמצעות מטרה ברזולוציה גבוהה (לדוגמא, מטרת נפט צמצם או מים מספרית גבוהה).
      הערה: רכישת Z- ערימות חשובה כמו האקסונים לעתים קרובות לא גדלים שטוחים לחלוטיןבmicrochannels ולכן לא כל puncta הניאון נמצאים באותו מישור המוקד.
  3. מיפוי מטענים
    1. צור רשם גלים של תנועת מטענים באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. תוסף ImageJ פותח על ידי Rietdorf וזייץ (EMBL) מומלץ ליצירת kymographs (להורדה לראות רשימת חומרים).
      הערה: ImageJ היא ברשות הציבור, תוכנת עיבוד תמונה המבוססת על ג'אווה שפותחה במכון הלאומי לבריאות 27,28 (להורדה ראה חומרי רשימה).
    2. יישר את התמונה קבועה של מטעני הניאון (שנוצרו בשלב 4.2.14) באופן ידני על ידי superimposing אותם על העמדה של המסלולים ברשם הגלים בנקודת הקיבעון (איור 2 א, ב '), באמצעות תוכנת גרפים זמינה מסחרי (חומרים רשימה). ידני ליישר ידי superimposing ראשון תמונת מטענים המקובעים לרשם הגלים ובחירת puncta המטען שמתאימה למסלול מסוים באופן ידנירשם גלים. לקבלת התוצאות הטובות ביותר יישור, להשתמש בפרוסת Z שהיא בפוקוס הטוב ביותר עבור המטען הממופה. ניתן להשתמש בפרוסות Z כמה.
    3. לכל תמונה בZ-המחסנית (מטען, מנוע 1 ומנוע 2; שנוצרה בשלב 4.2.14) לקבוע את קואורדינטות XY ואמפליטודות עוצמה עבור כל puncta ניאון באמצעות אלגוריתם שהוקם כדי להתאים Gaussians 2D ל פונקצית התפשטות הנקודה שמייצגת כל מקור נקודה בכל אחד משלושת הערוצים 16,20,21 (איור 2 ד).
      הערה: לקבלת קואורדינטות XY, חבילה מותאמת אישית שנבנתה MATLAB תוכנה בשם "המוטור colocalization" פותחה 16,20, אשר משלבת אלגוריתם מתאים גאוס פותח על ידי Jaqaman, Danuser ועמיתי 21-23. ניתן להשיג את חבילת התוכנה והוראות מפורטות לשימושו על פי דרישה.
    4. לכל אחד מpuncta המטען בנפרד שמופו על המסלולים הניידים או נייחים ברשם הגלים, בחר tהוא קואורדינטות XY ואמפליטודות בעוצמתם מהתוצאות של התכנית "מוטור colocalization" (מטענים אלה שכותרתו בנפרד באיור 2). השתמש בכמה תמונות Z- מחסנית שנרכשו בשלב 4.2.14) כדי למפות יותר מטענים הנמצאים על מטוסי מוקד שונים.
    5. השווה את XY הבודד קואורדינטות עבור המטען הממופה לאלה שהושגו עבור כל אחד מהערוצים המוטוריים בפרוסת Z המתאים (איור 2 ד). להחליט ולבחור את קואורדינטות מנוע XY שנמצאות ברדיוס של 300 ננומטר של המטען. למטענים ומנועים שיש אות באותו המישור המוקד, להשתמש "מוטור colocalization" חבילת התוכנה כדי לקבוע את puncta הנמצאות ברדיוס של 300 ננומטר.

תוצאות

איור 1 מציג סקירה כללית של מכשיר microfluidic משמשת לגידול תאי עצב בהיפוקמפוס (איור 1 א, ב '). נוירונים הם מצופים במאגר 1. הגודל של microchannels מונע דיפוזיה של גופי תא (סומה) לתוך תא axonal ואילו האורך של הערוצים מונע תחזיות דנדריטים לחצות את כל הדרך לתא axonal. לאחר ~ 2-3...

Discussion

הפרוטוקול המובא כאן מאפשר המתאם של כיווניות של תנועה של חלקיקי מטען נע פרט ניאון מבוסס microtubule עם הסוג היחסי וכמות חלבוני מנוע הקשורים בתאי עצב חיים. בעבר, הרכב המנוע הכולל של מטעני לפוחי axonal היה assayed על אוכלוסיות הטרוגניות של שלפוחית ​​ואברונים 9,15 מטו...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Ge Yang, Gaudenz Danuser, Khuloud Jaqaman, and Daniel Whisler for assistance with the adaptation and development of the software to quantitate cargo mapping analyses, and Emily Niederst for help in making the microfluidic devices. This work was supported in part by NIH-NIA grant AG032180 to L.S.B.G., and the Howard Hughes Medical Institute. L.S. was supported in part by a NIH Bioinformatics Training Grant T32 GM008806, S.E.E. was supported by a Damon Runyon Cancer Research Foundation Fellowship, NIH Neuroplasticity Training Grant AG000216, and by a grant from The Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award, G.E.C was supported by an NIH/NCATS 1 TL1 award TR001114 and by the Achievement Rewards for College Scientists foundation.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
poly-L-lysineSigmaP5899-20mg
D-MEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) High Glucose, w/ L-Glutamine, w/o Sodium Pyruvate (1x)Life Technologies11965092
FBS (Fetal Bovine Serum)Life Technologies10082147
Neurobasal-A Medium (1x)Life Technologies10888022
B-27 Serum Free SupplementLife Technologies10888022
GlutaMAX I Supplement (100x)Life Technologies35050061
HBSS (1x) (Hank’s Balanced Salt Solution)Life Technologies24020117
DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, no Magnesium, no Calcium (1x)Life Technologies14190250
Penicillin/Streptomycin (100x)Life Technologies15140122
Corning cellgro Water for Cell Culture Fisher ScientificMT46000CM
PapainUSB Corporation19925
DL-cysteine HClSigma-AldrichC9768
BSA (bovine serum albumin)Sigma-AldrichA7906
D-glucoseSigma-AldrichG6152
DNAse I grade IIRoche Applied Sciences10104159001
Lipofectamine 2000Life Technologies 11668027
Formaldehyde Solution 16% EM GradeFisher Scientific50980487Caution: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to eyes, respiratory system and skin. Dispose according to official regulations.
SucroseFisher ScientificS5-500
HEPESSigmaH-3375
Normal Donkey SerumJackson Immuno Research017-000-0121
BSA fatty acid and IgG freeJackson Immuno Research001-000-162
AcetoneFisher ScientificBP2403-4
EthanolFisher ScientificBP2818-100
ProLong Gold antifade reagentLife TechnologiesP36934
Cover Glass 1 1/2. 24 x 40 mmCorning2980-244
Axis microfluidic device, 450 µmMilliporeAX450
Adobe PhotoshopAdobe
Nikon Eclipse TE2000-U Nikon
Coolsnap HQ camera Roper Scientific
60 mm cell culture dishFisher Scientific12-565-95
150 mm cell culture dishFisher Scientific12-565-100
Antibodies Used:
Anti-Kinesin light chain, V-17Santa Cruz sc-13362specificity verified using KLC1-/- neurons (Ref. 16), recommended dilution 1:100.
Anti Dynein Heavy Chain 1, R-325Santa Cruz sc-9115specificity verified using shRNA against DYN1HC1 (Ref. 16), recommended dilution 1:100
Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG AntibodyLife TechnologiesA10042 recommended dilution 1:200.
Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) AntibodyLife TechnologiesA31573 recommended dilution 1:200.
Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody IgG AntibodyLife TechnologiesA11057 recommended dilution 1:200.
Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) AntibodyLife TechnologiesA21447 recommended dilution 1:200.
Plugins and Macros
ImageJ http://imagej.nih.gov/ij/index.html. 
ImageJ Kymograph Pluginhttp://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html.

References

  1. Goldstein, A. Y. N., Wang, X., Schwarz, T. L. Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components. Curr. Opin. Neurobiol. 18, 495-503 (2008).
  2. Hirokawa, N. Kinesin and dynein superfamily proteins and the mechanism of organelle transport. Science. 279, 519-526 (1998).
  3. Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68, 610-638 (2010).
  4. Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 682-696 (2009).
  5. Welte, M. A. Bidirectional transport along microtubules. Curr. Biol. 14, 525-537 (2004).
  6. Bryantseva, S. A., Zhapparova, O. N. Bidirectional transport of organelles: unity and struggle of opposing motors. Cell. Biol. Int. 36, 1-6 (2011).
  7. Gross, S. P. Hither and yon: a review of bi-directional microtubule-based transport. Phys. Biol. 1, 1-11 (2004).
  8. Gross, S. P., et al. Interactions and regulation of molecular motors in Xenopus melanophores. J. Cell. Biol. 156, 855-865 (2002).
  9. Gross, S. P., Welte, M. A., Block, S. M., Wieschaus, E. F. Coordination of opposite-polarity microtubule motors. J. Cell. Biol. 156, 715-724 (2002).
  10. Kural, C., et al. Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement. Science. 308, 1469-1472 (2005).
  11. Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
  12. Shubeita, G. T., et al. Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets. Cell. 135, 1098-1107 (2008).
  13. Soppina, V., Rai, A. K., Ramaiya, A. J., Barak, P., Mallik, R. Tug-of-war between dissimilar teams of microtubule motors regulates transport and fission of endosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 19381-19386 (2009).
  14. Verhey, K. J., Hammond, J. W. Traffic control: regulation of kinesin motors. Nat Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 765-777 (2009).
  15. Hendricks, A. G., et al. Motor Coordination via a Tug-of-War Mechanism Drives Bidirectional Vesicle Transport. Current Biol. 20, 697-702 (2010).
  16. Encalada, S. E., Szpankowski, L., Xia, C. -. h., Goldstein, L. S. B. Stable kinesin and dynein assemblies drive the axonal transport of mammalian prion protein vesicles. Cell. 144, 551-565 (2011).
  17. Harris, J., et al. Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. 9 (410), (2007).
  18. Harris, J., et al. Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons. J Vis. Exp. 7 (261), (2007).
  19. Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat. Methods. 2, 599-605 (2005).
  20. Szpankowski, L., Encalada, S. E., Goldstein, L. S. B. Subpixel colocalization reveals amyloid precursor protein-dependent kinesin-1 and dynein association with axonal vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 8582-8587 (2012).
  21. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat. Methods. 5, 695-702 (2008).
  22. Thomann, D., Dorn, J., Sorger, P. K., Danuser, G. Automatic fluorescent tag localization II: Improvement in super-resolution by relative tracking. J. Microsc. 211, 230-248 (2003).
  23. Thomann, D., Rines, D. R., Sorger, P. K., Danuser, G. Automatic fluorescent tag detection in 3D with super-resolution: application to the analysis of chromosome movement. J. Microsc. 208, 49-64 (2002).
  24. Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224, 213-232 (2006).
  25. Nunez, J. Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats. J. Vis. Exp. 29 (19), (2008).
  26. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  27. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
  28. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
  29. Moore, D. S., McCabe, G. P. . Introduction to the Practice of Statistics. , (2005).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Neuroscience92kinesindyneinaxonalmicrofluidic

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved