דגימת קרקע ובידוד של Entomopathogenic נמטודות (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Summary

נמטודות Entomopathogenic הן תולעים עגולות המאכלסת-אדמה שparasitize מגוון רחב של חרקים. אנו מדגימים שיטות דגימה המשמשות לבידוד של נמטודות אלו מהאדמה באמצעות שתי טכניקות: מתגרה חרקים והמלכודת לבנה שונה, להחלמתם של נמטודות מדגימות קרקע וגופות חרקים נגועות, בהתאמה.

Abstract

נמטודות Entomopathogenic (aka EPN) מייצגות קבוצה של נמטודות מאכלסת-האדמה שparasitize מגוון רחב של חרקים. נמטודות אלה שייכות לשתי משפחות: Steinernematidae וHeterorhabditidae. עד כה, יותר מ -70 מינים תוארו בSteinernematidae ויש כ 20 מינים בHeterorhabditidae. יש לי נמטודות שותפות mutualistic עם חיידקי Enterobacteriaceae ויחד הם פועלים כמתחם קוטלי חרקים רב עוצמה שהורג מגוון רחב של מיני חרקים.

במסמך זה, אנו מתמקדים בטכניקות הנפוצות ביותר נחשבות לאיסוף EPN מהקרקע. החלק השני של מצגת זו מתמקד בטכניקה מתגרה חרקים, גישה בשימוש נרחבת עבור הבידוד של EPN מדגימות קרקע, ואת טכניקת מלכודת לבנה שונה המשמשת להתאוששות של נמטודות אלו מחרקים נגועים. שיטות וטכניקות אלה הן שלבים עיקריים להקמה המוצלחת של כת EPNures במעבדה וגם יוצר את הבסיס למבדקים אחרים, כי רואים נמטודות אלה כאורגניזמים מודל למחקר בתחומים ביולוגיים אחרים. הטכניקות שמוצגים במצגת זו מתאימות לאלו שבוצעו ו / או שעוצבו על ידי חברי המעבדה בורסת SP, כמו גם אלה שתוארו על ידי מחברים שונים.

Introduction

נמטודות רבות הקשורים לחרקים, ואינטראקציות המארח שלהם נעות בין מועיל למזיק. במסמך זה, אנו מתמקדים בקבוצה של נמטודות, כי הם פתוגנים של חרקים, הידוע גם בנמטודות entomopathogenic (או EPN). שתי משפחות נמטודות שייכות לקבוצה זו של נמטודות: Steinernematidae וHeterorhabditidae ^11,13. ההשפעה פתוגניים שלהם היא בעובדה שמעניקה את האינטראקציה שלהם עם חיידקים אנאירוביים פקולטטיביים enteric (חיידקי Xenorhabdus לקשר עם steinernematids וחיידקים Photorhabdus לקשר עם heterorhabditids) ^2. החיידקים וקטורים ממארח ​​חרק אחד למשנהו על ידי את הבמה רק נמטודות חיים החופשית, לנוער בשלב השלישי התולעת (הידוע גם בנוער dauer, לנוער התולעת או IJ), שחיה בקרקע. ברגע שנכנס החרקים, נמטודות לשחרר את החיידקים לתוך hemolymph של החרקים, שהורג את מארח החרק על ידי הרעלת דם מסיבית. החיידקים גםבזות רקמות של החרקים ולהיות מקור המזון 'נמטודות, ומאפשר להם להגיע לבגרות ולהתרבות. בדרך כלל, דור אחד או שניים של נמטודות המבוגר מיוצר בתוך פגר החרקים. הצאצאים של reassociates הדור המבוגר שעבר עם כמה תאי חיידקיים במתמחים יותר בצורה מאשר היחסים התזונתיים הקודמים שלהם, ולטפח את התאים האלה במעיים שלהם, כאשר הם עוברים מ פגר החרקים לתוך האדמה שם הם ממתינים לחרקים אחר לparasitize ^6,11,14 (איור 1).

מאז הגילוי שלהם ב1927, EPN היה נחשב חלופות בעלות ערך לחומרי הדברה כימית כפי שהם יכולים parasitize מגוון רחב של חרקים, כי הם מזיקים חקלאיים ^3,4,5. עם זאת, בשני העשורים האחרונים, נמטודות אלה וחיידקים סימביוטיים הוכרו כמערכת מודל נזיל לחקר היבטים ביולוגיים, אקולוגיים והאבולוציוני של interactio מארח-חיידק¹⁴ NS.

המטרה של מצגת זו היא להראות את השיטות וטכניקות הנפוצות ביותר לדגימת אדמה ובידוד של EPN. מגוון רחב של כלים זמין ויכול לשמש לאיסוף דגימות קרקע ובם: מקלפות אדמה, כפות סיידים, חופרי הודעה חור, מקדחים, צינורות דגימה, אתים שני, בין השאר (איור 2).

בהתאם לצורך של המחקר, יכולות להיחשב שתי אסטרטגיות דגימה:) מרובדת, ב) דגימה אקראית (איור 3). הדגימה מרובדת משמשת בדרך כלל כחלק מלימוד אינטנסיבי באזור מסוים או demarked על פני תקופה נתונה של זמן. באופן כללי, חתך הוא demarked ודגימות קרקע נלקחות במרווחי זמן קבועים בחתך על פני תקופה של זמן (איור 3 א) ^15. הדגימה האקראית היא בדרך כלל מועסק כאשר מתמקדים באזור נרחב. אסטרטגיית דגימה זו הייתה בשימוש ללימוד המגוון של EPN וrom שטח גדול גיאוגרפי או באזור (איור 3 ב) ^12. מספר גורמים יכולים להיחשב בהתאם למיקוד של המחקר הכולל מגוון רחב של גבהים, מרקמי קרקע ובתי גידול (לדוגמא., שדות מעובדים, יערות, שטחי מרעה, פארקים, חופי ים, אזורי riparian, וכו ').

אנחנו מראים את הטכניקה מתגרה חרקים, שתוארה במקור על ידי מצעים ^ו1 Akhurst ומהווה חלופה פשוטה וסלקטיבית לשחזור EPN מדגימות קרקע. זהו הליך סלקטיבית המבוסס על ההנחה כי נמטודות (שלב IJ) יימשך למארח חרקים וparasitize זה. טכניקה זו יכולה להיחשב גם לבידוד של פתוגנים אחרים חרקים כגון פטריות, חיידקים ^ו8,10.

אנחנו גם מדגימים את טכניקת מלכודת לבנה שונה המשמשת לאחזור צאצאי נמטודות ממארחי חרקים נגועים ^7,14. זה מאמץ נפגשהוד שמציע את היתרון של אחזור נמטודות צאצאים "נקיים" ללא פסולת מגוויות חרקים משפילות.

לבסוף, הטכניקות המתוארות ומוצגות במאמר זה מתאימות לאלה שהגו ו / או שבוצעו במעבדה שלנו, כמו גם אלה שתוארו על ידי עמיתים ומשתפי פעולה שונים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. אוסף דוגמאות קרקע

1. שקול המשתרע על שטח מינימאלי של 2 - 4 מ ^'2 עבור כל אתר דגימה.
2. לאסוף דגימות קרקע בעומק של לפחות 15 סנטימטר (איור 4).
3. קח לפחות 5 דגימות אקראיות בתוך תחום זה.
4. קח 3 subsamples לדגימה. בהתאם למטרת המחקר, או לשלב את subsamples או לשמור אותם בנפרד.
5. מניחים כל דגימה בשקית ניילון. שקול כפול לצוד, כדי למנוע דליפה של דגימות (איור 4).
6. דוגמאות לייבל עם סמן עמיד למים. כלול את המידע הבא מכל אתר דגימה: מידע באתר (כולל יישוב / אזור / שם אתר ולתאם מידע GPS), תאריך, בית גידול, צמחייה קשורה, טמפרטורה, גובה, וכו '
   הערה: במידת צורך, לאסוף ו / או להקליט את נוכחותם של חרקים או חסרי חוליות אחרות שנאספו במדגם לזיהוי שלאחר מכן. הם עשויים לייצג נאטור פוטנציאלמארחים אל EPN.
7. כלי איסוף נקיים בין דגימות על ידי שטיפה ביסודיות עם מים ו / או חיטוים עם 70% אתנול או 0.5% פתרון אקונומיקה.
8. שמור דגימות בצידנית (8-15 מעלות צלזיוס) במהלך הובלה למעבדה.
9. קח את חלק של דגימת הקרקע לניתוח כדי להשיג מידע על הרכב קרקע, מרקם, לחות, מוליכות חשמליות או פרמטרים אדמה רצויים אחרים.

. 2 בידוד נמטודות מדגימות קרקע: טכניקת חרקים מתגרה

1. הסר את כל פסולת (כלומר., סלעים, חתיכות עץ או קליפה, עלים, וכו '.) שנאסף בדגימות שלך כדי למנוע זיהום עם מיקרואורגניזמים saprobic.
2. מוסיף מים כדי ללחלח את הקרקע ולהקל על התנועה של נמטודות.
   הערה: השתמש בבקבוק ספריי כדי להגדיל את רמת הלחות של הקרקע באיטיות.
3. הנח כ 200-250 מיליליטר של אדמה לחה במכל פלסטיק נקי עם מכסה.
4. להוסיף פיתיונות חרקים. שקול 5-10 חרקים על פני הקרקע של כל דגימה (איור 5).
5. כסה את המכל עם מכסה ולהפוך את מכולות.
6. לשמור על מכולות בחושך ועל RT (בדרך כלל 22-25 מעלות צלזיוס).
7. בדוק מכולות כל 2 - 3 ימים ולהסיר חרקים מתים.
   הערה: להוסיף חרקים בריאים נוספים לכל מכולה למתגרה נוסף של דגימת הקרקע.
8. הסר את החרקים מתים מהמכולות. הערה: גוויות עם חום או צבע אוקר בדרך כלל parasitized ידי steinernematids, בעוד הלבנים האדומים לגופות סגולות כהות parasitized ידי heterorhabditids.
9. יש לשטוף גופות במים סטריליים.
10. מניחים גופות במלכודת לבנה הותאם להתאוששות של צאצאי נמטודות (ראה הליך בהמשך).

מלכודת לבנה השתנה:. 3 נמטודות שחזור מגוויות נגועות

1. הנח את החלק העליון של קוטר 50 (או 60) מ"מ. צלחת פטרי בתוך צלחת גדולה יותר (100 מ"מ).
2. הגדרת חטא אחדנייר GLE מעגלי מסנן (# Whatman 1) בתוך הצלחת קטנה יותר.
3. גופות מניחים על נייר הסינון של המנה קטנה יותר מה שהופך את גופות בטוחים לא נוגעות זה בזה, כדי למנוע כל זיהום.
4. מלא את צלחת פטרי החיצונית (גדולה יותר) עם CA. 20 מיליליטר של מים מזוקקים סטריליים. אל תוסיפו מים בצלחת שמחזיקה את הגופות.
5. מכסה את צלחת פטרי הגדולה ואת התוכן שלה עם המכסה (איור 6).
6. תווית מנות בהתאם. הוסף את הפרטים הבאים: שם נמטודות (מינים / לבודד), תאריך זיהום (זיהום נקבע מועד) ותאריך מלכודת (זה תאריך המלכודת מוגדרת).
7. שמור מלכודת ב RT עד הופעתה של התולעת שלבים לנוער (IJS) מתרחשת. תהליך זה יכול לקחת בין 10-25 ימים בהתאם למין נמטודות ו / או המאמץ הנחשב.
8. מים קציר עם IJS על ידי הסרת הצלחת הגדולה יותר של המלכודת ולשפוך מים עם נמטודות לתוך מבחנה.
9. לאפשר לנמטודות למזוג לתחתית בתייקר. תהליך זה עשוי לקחת כמה דקות.
10. יוצקים מים בזהירות, מה שהופך נמטודות בטוחה תישאר בתחתית הכוס.
11. יש לשטוף נמטודות על ידי הוספה יותר מים ומאפשרים לנמטודות למזוג. צעד זה יכול להיות חוזר ונשנה 2 - 3 פעמים עד שהמים נקיים.
12. הנח השעיה נמטודות בבקבוק תרבית רקמה (250 מיליליטר). שמור על ריכוז של ההשעיה ל1,000 - 3,000 מיליליטר / נמטודות.
13. בקבוק חנות עם תליוני נמטודות בחדר קר או בחממה בין 10-20 ° C.
    הערה: לבדוק צלוחיות מאוחסנות מעת לעת כפי שחיי מדף של EPN הוא משתנה. בדרך כלל ניתן לאחסן steinernematids ל6-12 חודשים ללא הצורך בsubculturing, ואילו heterorhabditids עשוי לדרוש בדיקות תקופתיות יותר.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

אוסף דוגמאות קרקע

קטינים התולעת שלישי בשלב של EPN השלבים רק בחינם החיים במעגל החיים 'נמטודות אלה אשר מתגוררים באדמה (איור 1). לכן, איסוף דגימות קרקע היא שיטה יעילה מאוד להתאושש מנמטודות אלו. איור 4 מראה פרופיל קרק...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הפגנה זו היא הראשונה מבין שתי מצגות המתארות את מספר הטכניקות המשמשות בדרך כלל ללימוד EPN והחיידקים סימביוטיים שלהם. טכניקות אלו מייצגות שלבים עיקריים להקמה המוצלחת של תרבויות EPN במעבדה וגם יוצרות את הבסיס למבדקים אחרים שמעסיקים EPN כמו אורגניזמים מודל למחקר.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Galleria mellonella	Timberline	http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG	For insect baiting technique
Filter paper, 55 mm Grade 1 Cellulose	Whatman/VWR	28450-048	Infection chamber and White trap assembly
60 x 15 mm Petri dishes	VWR	25384-092	Infection chamber and White trap assembly
100 x 15 mm Petri dishes	VWR	25384-088	Infection chamber and White trap assembly
ZIPloc plastic bags	Ace Hardware or local hardware store		Soil sampling
Mechanical pipettor P1000, P200 ml	VWR	89130-562; 89130-566	Infection chamber and White trap assembly
Pippetor tips 1000ml, 200 ml	VWR	16466-004 ; 53510	Infection chamber and White trap assembly
Bleach	Ace Hardware or local hardware store		Soil sampling , disinfecting
Sodium hypochlorite	Ace Hardware or local hardware store		Soil sampling , disinfecting
70% Ethyl alochol	AAPER	17212945	Soil sampling , disinfecting
Shovels	Ace Hardware or local hardware store	N/A	Soil sampling
Tubular soil sampler	Accuproducts		Soil sampling
Soil probe, long handle	Nupla	PRB4T 69401 Classic	Soil sampling
Measuring tape	Ace Hardware or local hardware store		Soil sampling
Flagging tape, various colors	Ace Hardware or local hardware store		Soil sampling
Tissue culture flasks	VWR	Falcon, 29185-304	White trap, collection of EPN
Wash bottles, polyethylene, wide mouth	VWR	16650-107	White trap, collection of EPN