בידוד דוגמניות Proteinopathy שמרי שימוש potentiated Hsp104 גרסאות

Summary

Yeast proteinopathy models are valuable tools to assess the toxicity and aggregation of proteins implicated in disease. Here, we present methods for screening Hsp104 variant libraries for toxicity suppressors. This protocol could be adapted to screen any protein library for toxicity suppressors of any protein that is toxic in yeast.

Abstract

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic lateral sclerosis, and α-synuclein, implicated in Parkinson’s disease, are toxic and form cytoplasmic aggregates in yeast. These features recapitulate protein pathologies observed in patients with these disorders. Thus, yeast are an ideal platform for isolating toxicity suppressors from libraries of protein variants. We are interested in applying protein disaggregases to eliminate misfolded toxic protein conformers. Specifically, we are engineering Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast that is uniquely capable of solubilizing both disordered aggregates and amyloid and returning the proteins to their native conformations. While Hsp104 is highly conserved in eukaryotes and eubacteria, it has no known metazoan homologue. Hsp104 has only limited ability to eliminate disordered aggregates and amyloid fibers implicated in human disease. Thus, we aim to engineer Hsp104 variants to reverse the protein misfolding implicated in neurodegenerative disorders. We have developed methods to screen large libraries of Hsp104 variants for suppression of proteotoxicity in yeast. As yeast are prone to spontaneous nonspecific suppression of toxicity, a two-step screening process has been developed to eliminate false positives. Using these methods, we have identified a series of potentiated Hsp104 variants that potently suppress the toxicity and aggregation of TDP-43, FUS, and α-synuclein. Here, we describe this optimized protocol, which could be adapted to screen libraries constructed using any protein backbone for suppression of toxicity of any protein that is toxic in yeast.

Introduction

המודלים proteinopathy השמרים פותחו לטיפול בהפרעות misfolding חלבון כוללים מחלת ניוון (ALS) ופרקינסון (PD) ^1-3. ביטוי של החלבונים TDP-43 וFUS, שmisfold בחולי ALS, הם רעיל וmislocalize כדי ליצור אגרגטים cytoplasmic בשמרים ^1,2. בדומה לכך, הביטוי של α-סינוקלאין (α-SYN), אשר היה מעורב בPD, הוא רעיל וmislocalizes כדי ליצור אגרגטים cytoplasmic בשמרים ^3. תכונות אלה לשחזר פנוטיפים בחולים עם הפרעות אלה ^4,5. כך, שמרי מודלים לספק פלטפורמה שימושית עבור בדיקות סקר לאיתור חלבונים או מולקולות קטנות המונעים או הפוך פנוטיפים אלה ^2,6-13. אנו מעוניינים בפיתוח של חלבונים המסוגלים היפוך צבירה ורעילות בשל TDP-43, FUS, וα-syn. אנו מתמקדים בHsp104, AAA + חלבון משמרים כי הוא מסוגל ריסוק חלבונים ייחודי הן frאגרגטים אום אמורפי ועמילואיד בשמרים, אך אין לה homologue אדם ^14,15. Hsp104 רגיש ועדין לdisaggregate פריונים שמרי אנדוגני ויש לו רק יכולת מוגבלת disaggregate מצעים המעורבים במחלות ניווניות אנושיות, שזה אף פעם לא נתקל בדרך ^16,17. כך, אנו שואפים להנדס גרסאות משופרות של Hsp104 כי הם מסוגלים disaggregate efficaciously מצעים האנושיים אלה. לשם כך, אנו בונים ספריות גדולות של Hsp104 גרסאות באמצעות PCR ומועד לשגיאות; יכולות להיות מוקרנת ספריות אלה באמצעות המודלים השמרים proteinopathy ^17. אנחנו אימצנו גישה ממוקדת-תחום לבניית וסינון ספריות, כHsp104 הוא גדול מאוד ^17. אנחנו בתחילה התמקדנו בתחום ביניים (MD) של Hsp104 ^17, אם כי יכולים להיות מועסקות גישות דומות לדומיינים אחרים. מודלים אלה מאפשרים בדיקות סקר לאיתור פעילות Disaggregase ישירות, בניגוד לטכניקות חלופיות כגון תצוגה לפני שטח, ושארricted להשתמש לניטור מחייב ^18.

הפרוטוקול שלנו מבוסס על שני שלבי סינון (איור 1). ראשית, גרסאות Hsp104 המדכאות את הרעילות של מצע המחלה בשמרים נבחרות. לשם כך, Hsp104 גרסאות ו- קשור מחלה מצעם cotransformed לשמרי Hsp104 Δ. אנו מעסיקים שמרי Hsp104 Δ ללחקור את חלל רצף Hsp104 בהעדר wild-type (WT) Hsp104 ^17. חשוב לציין, מחיקה של Hsp104 אינה משפיעה על α-syn, FUS, או TDP-43 רעילות בשמרים, וביטוי של Hsp104 ^WT מספק הצלה מינימאלית ^1,13,17. השמרים אז מצופים על גרימת תקשורת כדי לגרום לביטוי של שני החלבונים. שמרים מחסה גרסאות Hsp104 המדכאות רעילות של הצמיחה מקנה המצע הקשורים למחלות של המושבה. גרסאות אלו נבחרו לניתוח נוסף, בעוד שמושבות שמירת גרסאות שאינו לדכא למות רעילות. עם זאת,תוצאות חיוביות שגויות הן בעיה משמעותית במסך זה. הביטוי של TDP-43, FUS, וα-syn הוא רעיל ביותר, אשר יוצר לחץ סלקטיבי חזק להופעתו של מדכאי גנטיים ספונטניים של רעילות שאינה קשורה לגרסת Hsp104 לידי ביטוי. כך, יש לנו להשתמש במסך משני שהוא גם גבוהה יחסית תפוקה לחסל מדכאי רעילות ספציפיים אלה ^17. במסך המשני זו, מטופלים שמרים נבחרים עם 5-Fluorootic חומצה (5-פואה) כדי להתמודד בחר לפלסמיד Hsp104 ^19. אז הזנים נבחנים לגבי מצע רעילות (TDP-43, FUS, או α-SYN) באמצעות איתור assay כדי להבטיח שהרעילות של המצע משוחזרת לאחר אובדן פלסמיד Hsp104. כך, שמרים שברעילות משוחזרת במסך משני זה כנראה שבעבר הוצגו דיכוי רעילות בשל נוכחותם של גרסת Hsp104. השמרים הללו מיועדים 'להיטים' ופלסמיד Hsp104 צריך להיות אזהתאושש ורצף לזהות מוטציות בגן Hsp104 ¹⁷ (איור 1). כל להיטים אז צריכים להיות אושר על ידי בניית המוטציה באופן עצמאי באמצעות מוטגנזה מכוונת ולאחר מכן בדיקה חוזרת לדיכוי רעילות. היישומים האפשריים עבור פרוטוקול זה הם רחבים. שימוש בשיטות אלה, ספריות מכל סוג של חלבון יכולות להיות מוקרנת לגרסות המדכאות רעילות של כל חלבון מצע כי הוא רעיל בשמרים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. ספריית דור

1. לבנות ספריות של Hsp104 באמצעות PCR מועדת לטעויות תחום ספציפי, להגביר ראשון תחום עניינים עם DNA פולימרז לשגיאות ^20.
2. לטהר את מוצר ה- PCR על ידי שאיבת קריש.
3. לבצע צעד הארכת megaprimer באמצעות פרוטוקול מוטגנזה מכוון סטנדרטי: לשלב פלסמיד 50 ng תבנית, 250 megaprimer ng, 200 מיקרומטר dNTPs, וDNA פולימרז באיכות גבוהה במאגר PCR, ולדלל את נפח כולל של 50 μl עם מים הכיתה PCR ²⁰ . להפעיל תכנית PCR סטנדרטית.
   הערה: פריימרים ספציפיים בשימוש ישתנה בהתאם לאזור המסוים של הגן שהוא להיות מוגברים.
   1. בעקבות PCR, לעכל תבנית ה- DNA של הורים עם μl 1 אנזים הגבלת DPN אני לשעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס.
4. להפוך את הספרייה באמצעות electroporation או אחר בultracompetent E. coli ולטהר אותו על ידי miniprep.
   הערה: דור ספרייהמשתנה מבוסס במידה מהותית על המטרות של ניסוי נתון. Hsp104 הוא חלבון גדול מאוד, כך שזה לא מעשי באקראי כל הגן, וזו הסיבה שאנו מנצלים PCR לשגיאות תחום ספציפי. בנוסף, המבנה של Hsp104 נשאר הבין היטב, והעיצוב של ספריות בבימוי מאתגרות ^21. ניתן לבנות ספריות תוך שימוש בגישות מכוונות או אקראיות לmutagenesis, עם ההגבלה היחידה הוא שעמוד שדרת פלסמיד התבנית צריכה להכיל את גן URA3 כדי לאפשר 5-פואה בחירת דלפק בתקשורת דקסטרוז.

2. שינוי של ספריית Hsp104

1. לשלב את המצע הקשורים למחלות לשמרי Hsp104 W303aΔ באמצעות ליתיום אצטט סטנדרטי / פרוטוקול שינוי PEG ^22. בחר מושבות אחת ולסנן אותן לרעילות לבודד את מתח עם רעילות גבוהה של המחלה קשורה מצע ^23.
   הערה: השתמש במתח וIsola משולביםTE מושבה אחת כדי להבטיח ביטוי שווה בכל התאים. לשכפל את מצע המחלה לפלסמיד המאפשר שילוב של הגן תחת כל סמן אחר מאשר אורציל (אנו משתמשים היסטידין) וספריית Hsp104 לפלסמיד pAG416GAL (סמן אורציל) ^24. כדי לאפשר ל5-פואה counterselection, להבטיח שהספרייה באה לידי ביטוי מפלסמיד עם סמן אורציל. יכולים גם להיות מועסקים זני שמרים אחרים. רשמתי לפנינו את הפנוטיפ דיכוי רעילות דומה באמצעות W303a וBY4741 זני שמרים בשני רקעי Hsp104 WT וΔ (Mej וJS, תצפיות לא פורסמו).
2. להפוך את ספריית Hsp104 לזן זה תוך שימוש באותו ליתיום אצטט / פרוטוקול שינוי PEG ^22. בהיקף של עד השינוי כראוי כדי לשמור על מרחב הרצף של הספרייה ולשמור על גודל הספרייה חזה.
3. פלייט תערובת הטרנספורמציה על noninducing, צלחות סלקטיבית (למשל SD--אורה) באמצעות מספיק צלחות ללהבטיח צמיחה של מספר רב של מושבות. השתמש בצלחות פטרי גדולות (150 מ"מ) כדי למזער את מספר הצלחות הנחוצות. שחזור transformants באמצעות צלחות מאפשר יעילות שינוי להיות מוערכת.
4. להפוך Hsp104 ^WT ובקרות שליליות וקטור במקביל.

3. הקרנה לדיכוי Proteotoxicity

1. שטוף את המושבות מהצלחות באמצעות תקשורת נשירת raffinose תוספת (למשל SRaff--אורה). השתמש פיפטה סרולוגית והחלה מעץ סטרילי כדי לשחרר את המושבות מהצלחות. העבר את שטיפות נוזל לצינור חרוטי 50 מיליליטר ומערבולת ביסודיות כדי להפריד כל גושים של תאים. לדלל את תרבות מעונן במקצת, OD ₆₀₀ ~ 0.025.
   הערה: כאן raffinose משמשת כדי להקל על התאים של דיכוי בתיווך גלוקוז של אינדוקציה, וכך תחול התאים לזירוז בתיווך גלקטוז.
2. לגדול התרבות בדילול הלילה בתקשורת נשירת raffinose עם רועד ב30 ºC. לגדול ^WT Hsp104 ובקרות וקטור במקביל.
3. למחרת בבוקר, צלחת טווח ריכוזים על גלקטוז הבודד צלחות (למשל SGal--האורה) (1 μl 2 מיליליטר מרוכז תרבות ב400 μl נפח כולל). ציפוי במגוון רחב של ריכוזים יבטיח כי צלחת תהיה מושבות אחת. הריכוז בפועל נדרש תלוי ברעילות של מצע המחלה של עניין.
4. לנרמל את הווקטור ותרבויות Hsp104 ^WT לOD ₆₀₀ של הספרייה וצלחת כמויות שווה להשוות צמיחה של הספרייה ביחס לקבוצת הביקורת.
5. כדי להעריך החמרת בחירה, צלחת הספרייה ברמת סוכר (הדחקה) תקשורת. דגירה צלחות במשך 2-3 ימים ב 30 ºC, עד מושבות להופיע (איור 2). להעריך את המושבות וכתוצאה מכך ולהשוות לקבוצת הביקורת.
   הערה: לעתים קרובות שני מושבות גדולות וקטנות מתקבלות, אבל אין קשר בין גודל מושבה ומעשהivity הוא ציין. מסך להיטים הפוטנציאליים אלה תוך שימוש בטכניקת 5-פואה בחירת דלפק (שלב 4) כדי למזער את התוצאות החיוביות שגויות נשאו מעל לריצוף.

4. 5-פואה Counterselection והאיתור לחסל חיובי שגוי

1. פס החוצה מושבות אחת בשני עותקים על גבי מדיה זוגית אחת נשירה (למשל SD--האורה וSD-צלחות) ולגדול לילה בשעה 30 ºC. חזור עם פקדי וקטור וHsp104 ^WT. ציפוי על SD-לפני 5-פואה מגבירה את היעילות של שלב 5-פואה על ידי הגדלת הסבירות שתאים איבדו את הפלסמיד Hsp104 כאשר הם מצופים על 5-פואה.
2. כדי למנוע צלחות מהתייבשות, לעטוף את SD--אורה צלחות בparafilm ולאחסן ב 4 ºC בעת ביצוע מסך 5-פואה. צלחות אלה סופו של דבר לשמש לריצוף.
3. פס המושבות מSD-צלחות למושבות אחת על צלחות 5-פואה (YPD תקשורת + 1G / L 5-פואה) ו דגירה של 1-2 ימים ב 30 ו186 #; C עד מושבות אחת מופיע. כאן, 5-פואה הופכת למוצר רעיל (5-fluorodeoxyuridine) בתאים המכילים את גן URA3. כך, כל תאים מקננים עדיין פלסמיד Hsp104 ימותו.
4. פס מושבות אחת מצלחות 5-פואה בשני עותקים על גבי SD-אורה וSD-צלחות. מבחן 3 מושבות לכל נפגעו כדי להגביר את הסבירות שמושבה אחת לפחות עבור כל פגע תאבד את הפלסמיד Hsp104. דגירה של 1-2 ימים ב 30 מעלות צלזיוס. מושבות שאיבדו את הפלסמיד Hsp104 לא יגדל על SD-צלחות, אך לא צלחות SD-אורה.
5. לגדול הזנים שאיבדו פלסמידים Hsp104 לאיתור מבחני. לגדול הזנים לרוויה בתקשורת נשירת raffinose (למשל SRaff-שלו) ב -96 DeepWell 2 צלחות מיליליטר לילה בשעה 30 ºC עם רעד. הקפד לכלול זני שליטת 5-פואה טופלו.
6. להכין צלחות לאיתור assay. בעזרת פיפטה רבה, 200 תקשורת נשירת raffinose μl aliquot (למשל SRaff-) לעמודות גם צלחת גם 96, בהזמנת 1 ו -7 לתרבויות המסודרות. Aliquot 250 μl של כל אחד 16 התרבויות רוויות בטורי 1 ו -7 של הצלחת.
7. סדרתי לדלל את התרבויות 5 לקפל לתוך כל עמודה של הצלחת, ערבוב ביסודיות עם פיפטה רבה. הסר 50 μl של התרבות בדילול מלא מעמודים 6 ו -12 כדי להבטיח את הנפח הסופי של כל אחד גם הוא 200 μl. זה חיוני כדי להבטיח גם תצפית.
8. שימוש בכלי 96-בורג משכפל (Frogger), לזהות את התרבויות בשני עותקים על גבי SD-SGal-צלחות ו. דגירה הצלחות על 30 ºC במשך 2-3 ימים.
9. בחר עבור סידור זנים כי תערוכת רעילות על SGal-צלחות דומות לזה של קבוצת הביקורת. בטל זנים חיוביים שקריים שאינם רעילים כמו הפקדים. 5-פואה היא גם לעתים קרובות רעילה בפני עצמו, כל כך להשליך זנים כי תערוכת פגם צמיחה בSD-צלחות או שהם מציגים רעילות משמעותית יותר מאשר מצע המחלה לבד ( איור 3).

5. סידור גרסאות Hsp104 על ידי המושבה PCR

1. שמרים לגרד ~ 10 μl מצלחות SD--האורה ב 3 μl 20 מ"מ NaOH בצינורות רצועת PCR וlyse התאים על ידי ההפשרה הקפאה. מניחים את צינורות הרצועה במקפיא -80 ºC למשך 10 דקות או בחנקן נוזלי, ואז לדגור על 99 ºC בthermocycler למשך 10 דקות. לדלל את הזנים למי כיתה PCR 100 μl.
2. הכן PCR תגובות: תבנית PCR 5 μl, 0.5 μl 100 מיקרומטר כל צבע יסוד, 10mm dNTPs 0.5 μl, 0.25 DNA פולימרז μl במאגר PCR, ולעשות עד נפח כולל של 25 μl עם מים כיתה PCR. פריימרים עיצוב כדי להגביר את האזור באופן אקראי בתוספת כ -100 נ"ב בכל קצה. מזער את הגודל של האזור המוגבר כדי להגדיל את הסיכוי של הגברה מוצלחת. להפעיל תכנית PCR סטנדרטית.
3. ניתוח דגימות על ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose כדי לאשר הגברה של מוצר ה- PCR של siz המתאיםדואר. חזור PCR אם אין מוצר קיים.
   הערה: הכשל בPCR הוא בדרך כלל עקב יותר מדי שמרים בשימוש בשלב 5.1.
4. הכן דגימות לרצפי DNA. הסר פריימרים PCR או על ידי טיהור PCR או באמצעות מגיב ניקוי מוצר ה- PCR כמו exonuclease אני ושרימפס אלקליין phosphatase אנזים (ExoSAP-IT) לבזות DNA חד גדילים. מגיב זה אנזימי מדרדרת פריימרים וdNTPs מאוגדים, המאפשר תפוקה גבוהה יותר.
5. רצף מוצרי ה- PCR. הקפד לנתח ביסודיות chromatograms רצף למוטציות. מוטציות אפשר לראות כתערובת של שני נוקלאוטידים באתר נתון (איור 4), כמרים לעתים קרובות נמל פלסמידים מרובים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

בנינו ספרייה של גרסאות Hsp104 אקראיות בתחום האמצע והקרנו אותו לדיכוי TDP-43 רעילות. הספרייה הפכה ומצופית על גלוקוז וגלקטוז צלחות (איור 2) על מנת להעריך את החומרה של המסך. מושבות אחת נבחרו והזנים נבחרו דלפק באמצעות 5-פואה לחסל את הפלסמיד Hsp104. זנים אלה ולאחר מכן נבדקו ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

כאן אנו מציגים את הגישה שלנו לבידוד גרסאות Hsp104 potentiated המדכאות את הרעילות של מצעים הקשורים למחלות באמצעות מודלים השמרים proteinopathy. שימוש בגישה זו, ספריות גדולות של גרסאות יכולות להיות מוקרנת בתפוקה גבוהה, עם המגבלה היחידה להיות מספר הגרסאות שעוברות מסך המשני 5-פואה. על י?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit	Agilent	200552
150 mm Petri dishes	Falcon	351058
5-Fluorootic Acid	Research Products International	f10501-5.0
96-DeepWell 2 ml Plates	Eppendorf	0030 502.302
96 bold replicator tool	V&P Scientific	vp-404
ExoSAP-IT	Affymetrix	78200