ניצול של אינטראקציה אגל-פני השטח מופחת למטב תחבורה של Bioanalytes במיקרופלואידיקה הדיגיטלי

Summary

The protocol for fabrication and operation of field dewetting devices (Field-DW) is described, as well as the preliminary studies of the effects of electric fields on droplet contents.

Abstract

Digital microfluidics (DMF), a technique for manipulation of droplets, is a promising alternative for the development of “lab-on-a-chip” platforms. Often, droplet motion relies on the wetting of a surface, directly associated with the application of an electric field; surface interactions, however, make motion dependent on droplet contents, limiting the breadth of applications of the technique.

Some alternatives have been presented to minimize this dependence. However, they rely on the addition of extra chemical species to the droplet or its surroundings, which could potentially interact with droplet moieties. Addressing this challenge, our group recently developed Field-DW devices to allow the transport of cells and proteins in DMF, without extra additives.

Here, the protocol for device fabrication and operation is provided, including the electronic interface for motion control. We also continue the studies with the devices, showing that multicellular, relatively large, model organisms can also be transported, arguably unaffected by the electric fields required for device operation.

Introduction

המזעור של מכשירים שעובדים עם נוזלים הוא בעלת חשיבות עליונה לפיתוח של פלטפורמות "מעבדה-על-שבב". בכיוון זה, בשני העשורים האחרונים היינו עדים להתקדמות משמעותית בתחום מיקרופלואידיקה, עם מגוון רחב של יישומים. ^1-5 בניגוד גמור להובלת נוזלים בערוצים סגורים (מיקרופלואידיקה ערוץ), DMF מתפעל טיפות על מערכים של אלקטרודות. אחת הסגולות הכי האטרקטיביים של טכניקה זו הוא היעדר חלקים נעים להובלת נוזלים, והתנועה היא עצרה באופן מיידי על-ידי כיבוי אותות חשמליים.

עם זאת, תנועת טיפה תלויה בתוכן אגל, בהחלט אופיינית רצויה לפלטפורמה אוניברסלית "מעבדה-על-שבב". טיפות המכילות חלבונים וanalytes אחרות נדבקות למשטחי מכשיר, הופכות אינם ניתן להעברה. ניתן לטעון, זה היה המגבלה העיקרית להרחבת היקף יישומי DMF; ^6-8חלופות כדי למזער את עכירות המשטח רצויה כרוכות בתוספת של מינים כימיים נוספים לטיפה או בסביבותיה, אשר עלול להשפיע על תוכן אגל.

בעבר, הקבוצה שלנו פיתחה מכשיר כדי לאפשר ההובלה של תאים וחלבונים בDMF, ללא תוספים מיותרים (מכשירי שדה-DW). ⁹ זו הושגה על ידי שילוב של פני השטח המבוסס על פיח נר, ¹⁰ עם גיאומטריה מכשיר שתומכת בגלגול אגל ומוביל לכוח כלפי מעלה על אגל, ירידת אינטראקציה אגל-פני השטח נוסף. בגישה זו, תנועת אגל אינה קשורה להרטבת משטח. ¹¹

מטרת השיטה מפורטת המתוארת להלן היא לייצר מכשיר DMF מסוגל להעביר טיפות המכילות חלבונים, תאים, וכל יצורים, ללא תוספים נוספים. מכשירי שדה-DW לסלול את הדרך לפלטפורמות שליטה מלאה עבודה במידה רבה באופן עצמאי של כימאי אגלר"י.

הנה, אנחנו גם סימולציות הנוכחיות מראים כי, למרות המתח הגבוה הנדרש להפעלת מכשיר, ירידת המתח על פני רביב היא חלק קטן מהמתח להחיל, המצביעה על השפעות זניחות על bioanalytes בתוך הטיפה. למעשה, בדיקות ראשוניות עם elegans Caenorhabditis (סי אלגנס), נמטודות המשמשת למגוון רחב של מחקרים בתחום ביולוגיה, מראות כי תולעים לשחות ללא הפרעה כמתח מוחלים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הערה: בהליכים המתוארים להלן, חייבות תמיד להיות אחרי הנחיות בטיחות במעבדה. חשיבות מיוחדת היא הבטיחות בעת התמודדות עם מתח גבוה (> 500 V) וכימיקלים לטיפול.

1. ציפוי של מצע מוליך עם נר פיח

1. Cut מתכת נחושת למלבנים (75 x 43 מ"מ, 0.5 מ"מ עובי). נקה כל מצע נחושת על ידי טבילה בetchant נחושת לכ -30 שניות, לשטוף במים ברז למשך כ -20 שניות, ויבש עם נייר.
   הערה: אם אתם משתמשים בשיטה 1 להלן, לשנות את הממדים 75 x 25 מ"מ כדי שיתאים למכונה.
2. לטאטא נר פרפין מואר תחת המצע נחושת עבור 30-45 שניות, כדי להשיג ציפוי פיח אחיד כ (כ -40 מיקרומטר עבה). שמור את המצע בסנטימטר ~ 1 בתוך הלהבה. אל תיגע במשטח הפיח השביר.

2. הגנה על שכבת הפיח עם ציפוי

הערה: שכבת הפיח היא מאוד שבירה, ויש לצפות להגנה. שתי חלופות פשוטות (שיטות 1 ו -2 להלן) הציעו כאן, אבל פרוטוקולים חזקים יותר נמצאים כעת בפיתוח.

1. שיטת 1
   1. טען את המדגם לתוך מאייד המתכת או מערכת המקרטעת. בעקבות הליכי פעולתה של המערכת, לפנות את החדר, ולהתחיל בתצהיר מבוקר של זהב על גבי שכבת הפיח (150-200 ננומטר). בואו המכשיר להתקרר לטמפרטורת חדר.
   2. טבילת מעיל מצע metalized בפתרון 1-dodecanethiol (1% V / V, ב -95% אתנול, ACS כיתה USP /), במשך 10 דקות בתוך ברדס כימי. ואז, מחזיק את המכשיר בזווית קרובה ל -60 מעלות, לשטוף בעדינות את פני השטח עם כמה טיפות של אתנול בלבד. בואו המכשירים יבשים, לילה.
2. שיטה 2
   1. במנדף כימי, מייד לאחר ציפוי המצע עם פיח ואילו המצע הוא עדיין חם מלהבת הנר, להפקיד כמה טיפות של נוזל פלואור בצד אחד שלמצע, ולהטות את המצע לזווית קרובה ל 90 מעלות. להפקיד יותר טיפות, ולתת להם להתגלגל על ​​פני כל משטח הפיח.
      הערה: כאשר הטיפה נופלת על מקום, פיח יישטף מאזור זה. בואו הטיפות של התפשטות נוזל פלואור ככל האפשר.
   2. אופים את המצע על צלחת חמה (160 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות) בתוך מנדף כימי.
   3. בואו המצע לשבת לילה בטמפרטורת חדר לפני השימוש. אחסן ללא הגבלת זמן.

3. ייצור של למעלה אלקטרודות (מעובד מתוך et al Abdelgawad. ¹²⁾

1. צייר את האלקטרודות באמצעות תוכנת עיצוב גרפית. כל אלקטרודה היא 2 מ"מ, רוחבו 0.3 מ"מ, ואת הפער בין האלקטרודות הוא 0.3 מ"מ. הפער בין אנשי קשר (לייכנס לתוך המחבר, ראה להלן) הוא 2.3 מ"מ (איור 1).
2. חתוך רבד נחושת גמיש (35 מיקרומטר העבה) לפורמט Monarch (3.87 x 7.5 אינץ '). השתמשו בגדלים אחרים iו תואם למדפסת. טענת את רבד במגש ההזנה הידני של מדפסת צבע.
3. הקפד להשתמש ב" שחור עשיר ", או" רישום שחור ", בעת הדפסה על הגיליון נחושת (ראה Abdelgawad et al. ¹² לפרטים נוספים) כדי לאפשר שכבה צפופה של דיו שחור על המצע נחושת, הגנה על הדפוס שנדפס בתחריט . בואו יבש מצע המודפס לגמרי, לילה.
4. בתוך ברדס כימי, להתחמם (40 מעלות צלזיוס) כוס עם 50 מיליליטר של etchant נחושת. טובלים את רבד המודפס בכוס, ובעדינות לנער אותו בפתרון לכ -10 דקות. זמן תחריט תלוי בפתרון etchant הנחושת. בכל כמה דקות, לבדוק קורוזיה ולראות אם התבנית היא ללא פגע.
5. לשטוף בזהירות את רבד במים, ולהסיר את הציפוי עם אצטון ואתנול במנדף כימי. לשטוף שוב, ובעדינות לייבש את רבד עם מגבת נייר.
6. לצרף בזהירות רבד עם אלקטרודות לשטח בנוישקופית ss (75 x 25 מ"מ, ~ 1 מ"מ עובי), באמצעות קלטת דו צדדית. הימנע מכיסי אוויר.
7. צרף סרט של PFA perfluoroalkoxy לאלקטרודות באמצעות קלטת. זה משמש כדי למנוע מגע מקרי של אלקטרודות עם הטיפה, נזקי אלקטרודות העליונים עקב קצר חשמלי ש.

4. אלקטרוני הממשק (המעגל באיור 2)

1. הלחמה הממסרים וC הקבלים למעגל אוניברסלי.
2. להרכיב את שאר 10 נהגי ממסר על קרש חיתוך solderless למעגלים אלקטרוניים.
3. חוט הקלט של כל נהג ממסר לערוץ בשלט.
4. הצמד בזהירות את האלקטרודות העליונה למחבר (איור 3). חוט הפלט של כל נהג ממסר לאלקטרודה עליונה, כפי שמוצג באיור. שים לב שיש קשר מחבר מעוגן בין זוג חוטים מממסרים, כדי למזער את הרעש חשמלי.
   הערה: המחבר יושב על פלטפורמה מתכווננת לשלוט tהוא מרחק (0.1-.5 מ"מ) בין מצע העליון ותחתון (פיח מצופה).
5. השתמש בתכנית לשליטה עיתוי למתח גבוה יישום (HV) (כ -0.8 שניות) 4 אלקטרודות באותו הזמן, הסטת אלקטרודה 1 בכיוון התנועה (כלומר, 0.8 שניות, להניע 1234; אז 2345, 3456, וכו ' ., 0.8 שניות לכל קבוצה, ולאחר מכן לאחור, מהלכים כל כך טיפה בכיוון ההפוך גם כן).

5. ויזואליזציה וטיפול אגל

1. כדי להקליט תנועת אגל, להשתמש במערכת להדמיה, שמורכבת מ24X - ההרכבה הגדלת 96X בשילוב עם מצלמת CCD. חבר את מצלמת וידאו למצלמה באמצעות S-video.
2. פיפטה טיפת 4 μl המכילה ג elegans בתקשורת על החלק התחתון של המצע מצופה הפיח.
3. להביא את האלקטרודות העליונה ל~ 0.3 מ"מ מעל הטיפה. הטיפה צריכה להיות קרובה לאמצע, ממש מתחת לאלקטרודה החמישית, לניתוח קל.
4. הפעל את הממשק האלקטרוני ומתח גבוה (500 V _RMS), ולהתאים את מרחק אלקטרודה העליון לטיפה עד שהוא מתחיל לזוז. אל תתנו לאלקטרודות העליונים לגעת בטיפה.
5. איסוף נתונים על ידי הקלטת מספר העברות אגל מוצלחות במכשיר בתגובה לפולסים חשמליים. ניסוי מוצלח מאופיין בלפחות 700 העברות טיפה, כלומר, העברה אחת לאחר כל פעימה חשמלית.
6. לאסוף נתונים באופן רציף, עד הטיפה לא לזוז יותר בתגובה ל5 עד 10 פעימות.
   הערה: כאשר פני השטח מתחיל להשפיל, תנועה יכולה להיות משוחזרת על ידי הבאת אלקטרודות העליונה קרובה יותר לטיפה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

בעבר, השתמשנו במכשירי שדה-DW כדי לאפשר התנועה של חלבונים בDMF. בפרט, טיפות עם אלבומין בסרום שור (BSA) ניתן היו להעביר בריכוז 2,000 פעמים גבוה יותר מאשר דווח בעבר על ידי מחברים אחרים (ללא תוספים). זה היה בשל האינטראקציה המופחתת בין אגל ופני שטח; איור 4 מראה טיפה מכילה BSA ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

השלב הקריטי ביותר של הפרוטוקול הוא ההגנה על שכבת הפיח, ישירות הקשורות להצלחה בהעברת טיפות. Metallizing שכבת הפיח (שיטת 1 לעיל) מאפשר קרוב להצלחת ייצור 100%. עם זאת, זמן פעולה המרבי היא כ -10 דקות; אולי, שברי טיפה הם מרטיבים את הפיח דרך חורים בשכבת המתכת. ציפוי שכבת הפיח עם נוזל פלו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraffin candle			Any paraffin candle
Sputtering system	Denton Vacuum, Moorestown, NJ		Sputter coater Desk V HP equipped with an Au target.
1-dodecanethiol	Sigma-Aldrich	471364
Teflon	Dupont	AF-1600
Fluorinert FC-40	Sigma-Aldrich	F9755	Fluorinated liquid: Prepare Teflon-AF resin in Fluorinert FC-40, 1:100 (w/w), to create the hydrophobic coating.
Graphic design software -Adobe Illustrator	Adobe Systems		Other softwares might be used as well.
Copper laminate	Dupont	LF9110
Laser Printer	Xerox	Phaser 6360 or similar	Check for the compatibility with "rich black" or "registration black" (see text).
Copper Etchant	Transene	CE-100
Perfluoroalkoxy (PFA) film	McMaster-Carr	84955K22
Breadboard	Allied Electronics	70012450 or similar	Large enough to allow the assemble of 10 drivers.
Universal circuit board	Allied Electronics	70219535 or similar
Connector	Allied Electronics	5145154-8 or similar
Control board and control program (LabView software)	National Instruments	NI-6229 or similar
High-voltage amplifier	Trek	PZD700
Capacitors C and C1, 100 nF, 60 V	Allied	8817183
Transistor T, NPN	Allied	9350289
Diode D, 1N4007	Allied	2660007
Relay	Allied	8862527
Visualization system	Edmund Optics	VZM 200i or similar	System magnification 24X – 96X. It is combined with a Hitachi KP-D20B 1/2 in CCD Color Camera.
Recorder	Sony	GV-D1000 NTSC or similar	It is connected to the camera by an S-video cable.
Simulations	COMSOL Multiphysics	V. 4.4