שימוש סינרגטי של תאים עצביים מבשר ופפטידים עצמי הרכבה בפגיעה בחוט השדרה הניסויית צוואר הרחם

Summary

Treating cervical spinal cord injury with both self-assembling peptides (SAP) and neural precursor cells (NPC), together with growth factors, is a promising approach to promote regeneration and recovery. A contusion/compression aneurysm clip rat model of cervical SCI and combined treatment involving SAP injection and NPC transplantation is established.

Abstract

פגיעות בחוט השדרה (SCI) לגרום לירידת ערך רצינית נוירולוגיות והשלכות פסיכולוגיות, כלכליות, וחברתיות לחולים ובני משפחותיהם. מבחינה קלינית, יותר מ -50% מSCI להשפיע על עמוד השדרה הצווארי ^1. כתוצאה מהפגיעה הראשונית, מפל של מנגנונים משניים כוללים דלקת, אפופטוזיס, וdemyelination להתרחש לבסוף מוביל להצטלקות רקמה ופיתוח של חללי intramedullary ^2,3. שניהם מייצגים מחסומים פיזיים וכימיים להשתלת תאים, אינטגרציה, והתחדשות. לכן, עיצוב הסביבה המעכבת וגישור חללים כדי ליצור סביבה תומכת להשתלת תאים והתחדשות הוא יעד טיפולי מבטיח ^4. כאן, מודל חבלה / דחיסה של צוואר רחם SCI באמצעות קליפ פרצה מתואר. מודל זה הוא יותר מבחינה קלינית רלוונטי מאשר דגמים ניסיוניים אחרים, מאז חיתוך רוחב או קרעים של החוט מלא הם נדירים. גם בcomparison למודל הירידה במשקל, שבניזק מסוים עמודות dorsum, דחיסה היקפית של חוט השדרה מופיעה יתרון. כוח סגירת קליפ ומשך יכולים להיות מותאם כדי להשיג חומרת פציעה שונה. אביב טבעת מאפשר כיול והתמדה של כוח קליפ מדויקים. בתנאים פיסיולוגיים, פפטידים הרכבה עצמית סינטטיים (SAP) עצמי להרכיב לnanofibers וכך, פונים ליישום בSCI ^5. הם יכולים להיות מוזרקים ישירות לתוך נגע מזעור נזק לכבל. SAPs הם מבנים ביולוגית הקמת פיגומים לגשר חללי intramedullary וכך, לצייד את הכבל הפגום לטיפולי משובי. K2 (QL) 6K2 (QL6) הוא SAP רומן הוצג על ידי דונג et l. ⁶ בהשוואה לפפטידים אחרים, QL6 עצמי מרכיב לתוך β גליונות ב- pH הניטרלי ⁶ .14 ימים לאחר SCI, לאחר השלב, הפרשות חריפות הם שהוחדרו לתוך המרכז של הנגע ותאים עצביים מבשר (NPC) הוא Injected לעמודות גב סמוכות. על מנת לתמוך בהישרדות תא, השתלה משולבת עם ממשל subdural מתמשך של גורמי גדילה על ידי משאבות מיקרו האוסמוטי למשך 7 ימים.

Introduction

יותר מ -50% מפגיעות בעמוד השדרה קשורים לעמוד השדרה הצווארי. בהגדרה הקלינית שני מנגנוני pathophysiological עיקריים כאמורים מפורטים: החבלה הראשונית של חוט השדרה, ולאחר מכן, הדחיסה המתמשכת שגורמת לשברים בעצמות, שטפי דם או נפיחות רקמות.

מחקה חבלה / דגם דחיסת קליפ הפרצה שני מנגנוני pathophysiological: מצלם את הקליפ מייצר חבלה ואת משך הזמן של גזיר עיתון מייצג את מרכיב הדחיסה, הודה כי הדחיסה במסגרות קליניות הנגרמות על ידי שברים בעצמות, שטפי דם או רקמות נפיחות יותר משמעותי אחרון. קליפ מפרצת המשמש הוא שונה על ידי אביב טבעת הבטחת כוח גזיר מדויק ושחזור. במיוחד בהשוואה לחמים-חיתוך רוחב או מודל החבלה, הגדרות זה קליפ מפרצת מחקה מודל הטוב ביותר הקליניות. בעוד חולים עם פגיעות בחזה סובלים מparaplegia, רוב החולים עם inj צוואר הרחםuries הוא tetraplegic ותלוי לחלוטין. המבנה האנטומי של חוט צוואר הרחם, לעומת זאת, מראה הבדלים משמעותיים בהשוואה לעמוד השדרה החזי או מותני, ובכך, מופנה במיוחד בפרוטוקול זה.

הפיתוח של חללי intramedullary וצלקות רקמת מכשולים להחלמה והתחדשות. כדי להתגבר על מחסומים אלה את השימוש בחומר פיגום הוא גישה מבטיחה. ניתן להזריק פפטידים עצמי הרכבה ישירות למוקד של הנגע. שם הם יותכו פיגומי ננו-סיבי גישור החלל ולשפר את איכות הסביבה המעכבת על ידי הפחתת דלקת ומפחידה רקמה. בעוד חומרים קשיחים לגרום נזק רב של חוט השדרה במהלך השתלה, ניתן להזריק את הפפטידים נוזל בבטחה וללא נזק נוסף חמור.

שיפור הסביבה המעכבת עם פפטידים הרכבה עצמית לפני השתלת תאי גזע, ומכאן, תומך בתא integration, בידול וסופו של דבר, התאוששות תפקודית, לאחר פגיעה בחוט השדרה הצווארי.

Protocol

הערה: פרוטוקול הניסוי הבא אושר על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים של רשת הבריאות באוניברסיטה (טורונטו, קנדה) והנו בהתאם למדיניות שנקבעה במדריך לטיפול ושימוש בבעלי החיים ניסיוניים שהוכנו על ידי המועצה הקנדית של טיפול בבעלי החיים .

דגם / דחיסה 1. חבלת קליפ מפרצת צוואר הרחם

1. לפני מכשירי החיטוי ניתוח ולשמור על תנאים סטריליים במהלך ההליך כולו על ידי הצבת surgcial המכשירים באמבט אלכוהול 70%.
2. לטשטש חולדות Wistar (250-270 גר ') עם שילוב של חמצן (O _2), תחמוצת חנקן (N ₂ O) (1: 1), ו1.8-2.2% Isoflurane ולתמוך בנשימה ספונטנית באמצעות מסכת הרדמה גז. לאינדוקציה של הרדמה להתחיל עם 5% Isoflurane דקה 1 ולהפחית לאחר מכן. לפני שמתחיל ניתוח, עומק שליטה של הרדמה על ידי מתן גירוי מכאיב (לדוגמא. בכפות). החל משחות שומניותבעיניים כדי למנוע יובש ולמנוע זיהומים שלאחר מכן.
3. שים את החולדות על כרית חימום (37 ° C) ולתקן את הראש לתוך מסגרת stereotactic.
4. לגלח את האזור כירורגית מסביב לעמוד השדרה הצווארי ולחטא עם יוד povidone ואלכוהול 70%.
5. לעשות חתך קו האמצע מעל עמוד השדרה מהחוליה בצוואר הרחם (C2) והגיעה לprocessus הבולט של בית החזה בחוליות גוף 2 (T2).
6. לחתוך את השכבה החיצונית של השרירים בעמוד השדרה ישירות על קו האמצע (כדי למנוע דימום) בכיוון קרניו-הזנב ועוד לנתח את שכבות שרירים העמוקות יותר בבוטות עד שתגיעו לspinosus processus והרבדים. הכנס מפשקים.
7. להתמצא spinosus processus הבולט של T2 גוף חוליה כדי לבחון את הרמות הממוקדות עבור laminectomy. לאחר זיהוי ומיקרו-כירורגית הכנת הרבדים נבחרו, לחתוך דרך flavae ligamenti כדי לשחרר את הרבדים וspinosus processus. לבסוף, גut דרך הרבדים עם רוחב גוזז עצם בעמוד השדרה ולהסיר אותם בעדינות, להימנע מכל דחיסה של חוט השדרה עצמו.
   הערה: רמות הנפוצות ביותר הן C5 / 6, C6 / 7, או C7 / T1. שיעור התמותה סביב הניתוח מגדיל את יותר מקורי הרמה של פציעה. דימום מסינוס הוורידים ליד חוליות עמוד השדרה הוא נפוץ וניתן לטפל על ידי דחיסה זהירה עם ספוג.
8. לפני הכנסת קליפ לטראומת הכבל, לזהות מתפתח שורשי עצבים כדי למנוע מהם מהגזיר (במיוחד ברמת C5 / 6).
9. על מנת להבטיח אינדוקציה קליפ חלקה, שחרר את הדורה הגחון מהצד הגב של גופי חוליות עם וו ולהכין מסדרון לקליפ.
10. לבסוף, להוסיף את הסרטון הפתוח ולתת לו הצמד (סגירה מהירה) סגרה כדי להשיג פגיעת חבלה. כוח סגירת קליפ ומשך סגירת קליפ לקבוע את עוצמת הטראומה וההיקף של דחיסה. נפוץ הם כוחות קליפ של בין 15-35 g וclippiמשך ng של דקות למשל 1. (איור 1).
11. לאחר הסרת הסרטון, להתאים את השרירים ב 2 שכבות ולסגור את הפצע.
12. להפסיק הרדמה ולתת את שרות החיה תחת ההשגחה רציפה שלך עד שהוא חוזר להכרה מספקת לכיבה sternal. לבסוף, הכניס את העכבר בכלוב אחד ולעקוב אחר הנחיות טיפול שלאחר ניתוח.
13. מאז בעלי חיים במאבק עם החומרה של סוג זה של פציעה, עליך להקדיש תשומת לב מיוחדת לטיפולים שלאחר ניתוח:
    1. לנהל משככי כאבים (עצירות וMeloxicam במשך 3 ימים ו -5 ימים, בהתאמה, ובהתאם לתסמינים הקליניים).
    2. תן תת עורי תמיסת מלח נוסף במשך 3 ימים (2 פעמים ביום, 5-10 מיליליטר (מיליליטר)).
    3. לספק אנטיביוטיקה במי השתייה 2 ימים לפני ועד לאחר ניתוח 7 ימים (למשל Moxifloxacine)
    4. לסחוט את שלפוחית ​​השתן 2-3 פעמים ביום עד להחלמה של תפקוד שלפוחית ​​השתן היא קבועהly נראית לעין.
    5. שים לב גירעונות נוירולוגיות ומצב פיסיולוגי של בעלי החיים המופעלים לפחות פעם ביום.

2. הזרקת SAPs וNPCs (14 ימים לאחר פציעה)

1. לגרום הרדמה כפי שתואר בסעיף 1.1. 1.3, לתקן את הראש של החולדה במסגרת stereotactic, להסיר את התפרים או קליפים פצע, ולחטא את הפצע ואת אזור הניתוח עם יוד povidone ואלכוהול 70%.
2. בזהירות לנתח את השרירים ליד חוליות עמוד השדרה, להכניס כלי כתיבה, הסרת רקמת צלקת מיקרוסקופית מהדורה, ולחשוף מחדש את אתר הנגע.
3. הכן SAPs בריכוז של 1% (w / v) לבצע ג'ל מטריקס. יש לי SAPs QL6 pH פיזיולוגי תואם ולא צריך להיות שנאגרו לפני הזריקה. להדמיה של SAPs בחוט השדרה, להשתמש נגזרים ניאון של QL6 (QL6-FITC).
4. הזרק SAPs (microliter 5 (μl) למרכז של הנגע, שהופץ ב2 חלקים, כל אחד2.5 דו-צדדי μl של קו האמצע. השתמש במזרק המילטון מחובר למסגרת stereotactic עם (קוטר חיצוני 100 מיקרומטר (מיקרומטר) (OD)) זכוכית נימי מיקרו. פתח את הדורה בזהירות עם קצה מחט חדה, והכנס את נימי זכוכית stereotactically 2 מילימטר (מ"מ) לחוט השדרה הטראומה.
5. לאחר שהזריק 1/3 מהנפח, להוציא את המחט לעומק 1.5 מ"מ, ואחרי 1/3 עד 1 מ"מ נוסף. לאחר ההזרקה של כל הנפח, ולפני הסרת המזרק, לחכות 5 דקות כדי לייצב היווצרות קריש.
6. כדי ליצור NPCs, להשתמש עכברים הבוגרים DsRed (או עכברים חיוביים YFP, ירוקים) ולבודד ולטפח אותם מאזור paraventrical ^4,18,21.
7. להעריך את הכדאיות של NPCs על ידי צביעת Trypan הכחולה מעיד על הנוכחות של תאי חיים ~ 90% בהשעית התא. לדלל את התאים במדיום גידול (50 x 103 תאי חיים / μl) ולאחר מכן להשתמש בם להשתלת תאים.
8. הפוך ארבעה 2 μl (vo הכולל 8 μllume, המכיל 4 x 10 ⁵ NPCs) זריקות intraspinal דו-צדדית ב2 מ"מ מקורי ואת הזנב של אתר פציעה. אחרי הפתיחה של הדורה, הכנס את נימי זכוכית מייקר המילטון 1.5 מ"מ מתחת לפני השטח הגבי של חוט השדרה ולהזריק 2 μl של ההשעיה התא. בחר שיעור הזרקה בכ -0.5 μl / min (דקות).
9. בסופו של כל זריקה ולפני הסרת הנימים מתוך החוט, לחכות לרקמות מאפשרות דקות לפחות 1 מתיחה כדי להתאים את נפח התא החדש. (איור 2)

3. השרשה של subdural משאבות לGrowth Factor Application

1. על מנת להעשיר את הנוזל המוחי השדרה (CSF) עם גורמי גדילת התמיכה הישרדות תא, להשתמש משאבות מיקרו-האוסמוטי דילול גורמי גדילה תת-durally לאורך 7-14 ימים, עם שיעור דילול של 0.5 μl / hr, קוטר צנתר של 0.04 OD סנטימטר, ומאגר בנפח של 100 μl.
2. בחר גורמי גדילה העדיפו(למשל, גורם גדילת מוח נגזר (BDGF), גורם הגדילה באפידרמיס (EGF), גורם גדילה פיברובלסטים (FGF)), למלא את המשאבות 6-10 השתלה לפני שעה, ולאזן משאבות באמבט מים ב 37 ° C.
3. מייד לאחר זריקות NPC, להכין פגרה תת-עורי למקום המשאבה. מקומות מועדפים הם חביות רוחביות של thoraco- אזור בטן הימנעות אי נוחות מקומית גדולה שנגרמה על ידי המשאבה עצמו.
4. כדי לקבל את הריכוז הגבוה ביותר של גורמי גדילה, להבטיח כי את הקצה הפתוח של קטטר מסתיים בסמוך לאתר הנגע. לכן, לבצע דילוג על laminectomy של הרמה העליונה או תחתונה הסמוכה. לדוגמא, אם SCI הוא בC7 / T1, לבצע laminectomy קטן של C5.
5. שים את המשאבה לפגרה תת-עורי, לקצר את הצנתר לאורך הנחוץ, ולאבטח אותו עם כמה תפרים (6.0) על שרירי ליד חוליות עמוד השדרה להימנע מכל נקע הקשורים תנועה.
6. לאחר פתיחת הדורה (לדוגמא, בC5) עם הקצה החדשל מחט, להציג קטטר לתוך חלל subdural ולתת לו להחליק בכיוון הזנב ללא כל התנגדות ובלי לפצוע את הכבל. Lamina דילוג על של למשל C6 משמש נקודת הקיבוע והייצוב של הצנתר נוסף.
7. ודא שהצנתר פועל בצורה חלקה ולא להתקפל.
8. שרירים לסגור על ידי שכבה, ועור, עם תפרים או קליפים. (איור 3)
9. להפסיק הרדמה ולתת את שרות החיה תחת ההשגחה רציפה שלך עד שהוא חוזר להכרה מספקת לכיבה sternal. לבסוף, החזרת אותם בכלוב אחד ולעקוב אחר הנחיות טיפול שלאחר ניתוח.
10. לספק טיפול לאחר ניתוח מיוחד, למרות ש, חיות אולי התאוששו חלקית בנקודת זמן זו:
    1. לנהל משככי כאבים (Buprenorthine וMeloxicam במשך 3 ימים ו -5 ימים, בהתאמה, ובהתאם לתסמינים הקליניים).
    2. לספק אנטיביוטיקה בבקבוקי מים 2 ימים לפני עד7 ימים שלאחר ניתוח (למשל Moxifloxacine).
    3. תמשיך לסחוט את שלפוחית ​​השתן, אם עדיין יש צורך.
    4. תן נוזלים תת עורית נוספים, אם החולדות מופיעות מיובשת.
    5. שמור התבוננות תפקוד הנוירולוגים ומצב פיסיולוגי של בעלי החיים המופעלים לפחות פעם ביום.
    6. לתת טיפול דיכוי חיסוני 2 ימי הזרקת NPC קודם ועד 7 ימים לאחר transplanation (minocycline) ועד הקרבה (sandimmune), בהתאמה.

הערכת 4. רקמות

1. להקריב בעלי חיים בסוף זמן התצפית (למשל. 4 שבועות לאחר SCI) בהרדמה עמוקה (5% Isoflurane במשך 2-3 דקות) ותנקב אותם transcardially עם מי מלח 50 מיליליטר קר (4 ° C) ואחריו 150 מיליליטר קר 4 paraformaldehyde% ב 0.1 M פוספט שנאגרו מלוח (PBS).
2. הסר את חוט השדרה ולשים אותו בparaformaldehyde 4% ב 0.1 M פוספט שנאגרו מלוח (PBS) למשך 24 שעות.
3. שים את חוט השדרה בתמיסת סוכרוז 25% לcryoprotection במשך 48 שעות.
4. לספק cryosections אורך בעובי של <30 מיקרומטר.
5. עבור מכתים immunohistochemical של כל התא-גרעיני מתן DAPI שימוש רקע (1: 1000). NPCs החיובי DsRed מופיע אדום, QL-6 FITC מופיע ירוק, ושניהם צריכים ובכך שלא להיות מוכתמים במיוחד. (איור 4).
6. למיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) לתת דגימות לטבול בglutaraldehyde ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 2, מייבשים אותם לאט לאט בצעדי 10% תוספת של אתנול למשך 5 דקות ומניחה אותם בCO ₂ סיפון נוזל בלחץ עבור שעה 1. פיגומי מעיל עם זהב באמצעות coater גמגום. קח תמונות עם מיקרוסקופ אלקטרונים הסורק Hitachi S-3400N. (איור 5)

תוצאות

בעת ביצוע ההליך מתואר לעיל, תקבל פיגום SAP גישור החלל ומציע שיפור של הסביבה המעכבת, מפחידה פחות רקמה ועלייה בהישרדות NPC. איור 4 מראה חתך אורך של חוט השדרה עכברוש שהושג ב אתר פציעה 6 שבועות לאחר SCI ו -4 שבועות לאחר הזרקת SAP QL6 והשתלת NPC. פפטידים QL6 הוזרקו בהצלחה בכב...

Discussion

פרוטוקול זה פותח כדי לאפשר לקורא לבצע מודל פציעה בצוואר הרחם בחולדות ולהשתמש בגישת טיפול משולבת עם SAPs וNPCs קידום התאוששות טובה יותר לאחר צוואר רחם SCI.

במיוחד בהשוואה לדגמים אחרים בצוואר הרחם טראומה, כגון המודל (חמי) -transection או מודלי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aneurysmal clip	SharpTech
Surgical microscope	Leica
Micro injection system	World Precision Instruments, Inc.
Small animal stereotaxic instrument	David Kopf Instruments
Hamilton syringe	Hamilton company
Subdural pumps	Alzet osmotic micro pump 1007D
Surgical instrument	Fine Science tools
Isoflurane USP	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.
0.9% Sodium Chloride injection USP	Baxter
7.5% Povidone iodine	Purdue Pharma
70% Isopropyl alcohol USP	GreenField Ethanol Inc.
QL6 SAP	Covidien
0.4% Trypan blue	Gibco
Platelet-Derived Growth Factor (PDGF)	Sigma
Epidermal Growth Factor (EGF)	Sigma
Fibroblast Growth Factor (FGF)	Sigma