Live-הדמיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; גלמי עין

Summary

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Abstract

תהליכים מובנים של פיתוח גלמי תסיסנית יכולים להזיז ולעוות את האפיתל עין בדרכים שהופכות את התאים בודד התנהגות קשה לעקוב אחר במהלך הדמיה תא חי. תהליכים אלה כוללים: סיבוב ברשתית, צמיחת תאים ותנועת האורגניזם. בנוסף, אי סדרים בטופולוגיה של האפיתל, כולל בליטות ועדינות קפלים לעתים קרובות הוצגו כגולם מוכן להדמיה, לעשות את זה מאתגר לרכוש תמונות בפוקוס של יותר מכמה האומטידיה במישור מוקד אחד. העבודה המתוארת כאן תרופות נושאים אלה, המאפשר ניתוח קל של תהליכים תאיים במהלך התפתחות העין גלמי דרוזופילה. גלמים כראוי מבוימים מסודרים במתקן הדמיה שניתן להרכיב בקלות ברוב המעבדות יוביקוויטין-DE-Cadherin:. GFP וGMR-GAL4 -driven UAS-α-קטנין: GFP משמשים כדי לחזות גבולות תא באפיתל העין ^{1 -3.} לאחר deconvolution הואפנה לתמונות ניאון שנתפסו במטוסי מוקד מרובים, תמונות הקרנה מקסימליים נוצרות עבור כל נקודת זמן ומשופרת באמצעות תוכנת עריכת תמונות. אלגוריתמי יישור משמשים לייצוב תנועה מיותרת במהירות, מה שהופך קלה יותר בודדת התנהגות תא כדי לעקוב אחר.

Introduction

מתחם עין תסיסנית מאופיינת בהסדר הסטריאוטיפי של ~ 750 האומטידיה מופרדת על ידי חלת דבש-סריג של תאי פיגמנט אבזר ^4,5. תאי פיגמנט אלה הם בדוגמת ידי שילוב מתואם של אירועים: תנועות תא מקומיות, צמיחת תאים, שינויים בצורת תא, ואפופטוזיס. הדמיה חיה של אפיתל זה מאפשר לאדם לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס אירועים אלה בהקשר תלת ממדים רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ומוטרד.

בניגוד לפרוטוקולים קודמים ^6,7, הטכניקה המתוארת כאן משלבת שיטה יעילה לייצוב תנועת רקמות זרות שלא יכול להיות מנותק מתהליך ההדמיה. שיטה זו משפרת את המחקרים של התנהגות תא באפיתל פיתוח תסיסנית העין גלמים - רקמה שגדלה, מסתובבת, ומשמרות במהלך ההדמיה. בנוסף de טכניקת תנועה-ההתייצבותscribed כאן יהיה שימושי לחקר תאים בהקשרים אחרים שבם תנועה זרות מתרחשת.

כדי להמחיש את גבולות תא בתחום רשתית דרוזופילה, קווים לטוס מהונדסים נוצרו המבטאים UBI-DE-Cadherin: GFP, כמו גם UAS-α-קטנין: GFP בשליטה של נהג עין ספציפית GMR-GAL4 ^1-3. השימוש בשני סמני קרום מתויג GFP מאפשר ההדמיה של גבולות תא באור בעוצמה נמוך יותר. זה ממזער את הנזק וphotobleaching רקמה בחשיפה חוזרת ונשנית לאורכי גל באנרגיה גבוהה, במסגרת שיעור מוגברת המאפשר ומשך סרט. כדי לשפר את היעילות של transgenes RNAi, UAS-DCR-2 שולב גם לקו זבוב שני ^8.

בעדכון שלישי מפרוטוקולים קודמים, מתקן הדמיה פשוט שמורכב בקלות ברוב המעבדות מתואר. מנגנון זה מבטל את הדרישה ליש לי r הדמיה מיוחדIG שנוצר על ידי 'חנות המכונה "של אוניברסיטה או שירות דומה. אסדת הדמיה זו דומה לזה המשמש לרקמות גלמים אחרות תמונת ^9,10.

מוצג כאן הוא פרוטוקול הדמיה פשוט לחיות תאים שיכולים לשמש כדי להעריך באופן ישיר את אירועי המוךפו"גנטי שתורמים לדפוסי עין מ~ 17-42 שעות לאחר היווצרות הגולם (APF hr). באופן ספציפי, פרוטוקול זה מאפשר לאדם לקבוע את ההשלכות של שינוי ביטוי גנים בזמן התפתחות גלמים.

Protocol

איור 3 מראה סיכום של ההליך ניסיוני.

1. רקמות הכנה

1. כדי לקבוע את ההשלכות של ביטוי שונה של גן של עניין, הקימו את הצלב בכפולות הבא ולשמור על 25 מעלות צלזיוס: UAS-transgene (זכרים) X GMR-GAL4; UAS-α-חתול: GFP, UBI-DE-Cad: GFP; הערה + / SM5-TM6b (נקבות בתולה): לקבלת צלב רקמת השליטה UAS-lacZ זכרים לGMR-GAL4; UAS-α-חתול: GFP, UBI-DE-Cad: נקבות GFP. β-galactosidase לא מייצר פגמים בהתנהגות תא ברשתית.
2. כדי לשפר את היעילות של transgenes RNAi, UAS-RNAi צלב זכרים לGMR-GAL4, UAS-DCR-2; UAS-α-חתול: GFP, UBI-DE-Cad: GFP; נקבות בתולה + / SM5-TM6b.
   הערה: פגמים אקראיים בהתנהגות תא ברשתיות להביע DCR-2 מחוץ לרחם נצפו (מידע לא מוצג). ערנות מומלצת אם שימוש בגישה זו.
3. Sנבחרים טרום גלמים לבנים של גנוטיפים מתאימים ומקום בצינורות 1.5 מיליליטר microcentrifuge. אם הגלמים להביע DCR-2, בחר גלמים או זכר או נקבה: הביטוי של כטב"מ-DCR-2, להוסיף על כרומוזום X, הוא חזק יותר בגברים. יש דחף מיני של גלמים ב0 APF שעות לפני פיגמנטציה של המקרה גלמי - בלוטות המין של גברים נראים כמו גלובוסים שקופים גדולים בצדדים לרוחב של הגולם (כשליש מאחורי).
4. דגירה צינורות microcentrifuge המכילים גלמים, בקצה-קופסא פלסטיק נקייה של 25 מעלות צלזיוס. כדי למנוע התייבשות של מקום גלמים 10 סנטימטר ² פיסת הרקמה, שהושרה במים מזוקקים, לקצה התיבה.
   הערה: אם את לחות בקצה התיבה הופכת גבוהה מדי במקרה גלמי עשוי להיות רטוב וקשה לנתח בשלבים הבאים.
5. דגירה של הזמן מתאים. כדי ללכוד התנהגויות תא הקשורים לדפוסי עין, להכין גלמים עבור הדמיה בכ -17 שעות APF, APF 20 שעות או 24 שעות APפ ראה נציגי תוצאות לדיון נוסף בכאשר התנהגויות תא מסוימות הם נצפו הטובים ביותר.
6. מניחים נייר דבק דו-צדדי טרי על צלחת לנתיחה sylgard השחור. מקם צד גולם, גב למעלה, עם ראש הגולם דבק בקלטת (איור 1 א) דו-צדדי .Try לא לדבוק בית החזה ובטן אזורים של הגולם לקלטת דו צדדית. עם מלקחיים בזהירות להרים ולהסיר את operculum לחשוף את ראש גלמים. לקרוע בצד של המקרה גלמי לחשוף את האזור סביב עין אחת.
7. הוצא בעדינות את הגולם מהנייר דבק. אם הגולם נשאר חסיד, להחיל נפח קטן של מים מזוקקים לצומת בין המקרה וקלטת גלמים להחליש הידבקות.

2. הרכבה

1. לבנות 15 מ"מ ² מסגרת קטנה מנייר סופג ואגרוף חור בmiddlethat הוא 5.5 מ"מ קוטר (איור 1). לטבול במים מזוקקים ומקום במרכז שקופיות מיקרוסקופ. באמצעות מזרק 30 סמ"ק, לסחוט טבעת אחידה של וזלין להקיף את מסגרת נייר הסופג. ודא שטבעת וזלין היא גבוהה במעט מהרוחב של הגולם ושקוטרה של הטבעת הוא שולי פחות מהרוחב של להחליק את המכסה.
2. הוסף חרוז קטן של וזלין ישירות לשקופית, בחור מנוקב לנייר הסופג (איור 1 ג) .Carefully לארגן הגולם, בצד שלה, נתמך על ידי חרוז וזלין (1D איור).
3. מניחים coverslip על גבי טבעת וזלין כדי שאנשי קשר זה אפיתל מעל neuroepithelium העין (1D איור). בעדינות לדחוס ההכנה לאטום את coverslip נגד וזלין וליצור קשר משטח שטוח קטן בין אזור עין גלמים וcoverslip.

3. דימות פלואורסצנטי

1. תמונת הכנת גלמים באמצעותמיקרוסקופ פלואורסצנטי. כל לכידת 7 דקות קטעי סדרתי דרך תחום הפסגה של neuroepithelium העין, באזור של צמתים adherens.
   הערה: א) סעיפים סידוריים מתאימים הם בדרך כלל 4-5 לZ- המחסנית מורכבת מ0.2 מיקרומטר z-שלבים. ב) אי סדרים בטופולוגיה של האפיתל, כולל בליטות וקפלים עדינים, יכול לעשות את זה מאתגר לרכוש תמונות בפוקוס של אזורים הגדולים של רקמה. בעוד הדמיה, ניתן למצוא חלק משטח של עניין להיות בפוקוס, ואזור סמוך ליהיה מחוץ לפוקוס. כולל טיפה קטנה של מים מזוקקים בין העין וcoverslip גלמים יכולים לחסל כמה קפלי רקמה חריפים אך לא אופייני טופולוגיה המעטה אחידה של המוקדמים של המורפוגנזה עין גלמי השלבים. במקרים אלה oversample הרקמה על ידי הרחבת Z- המחסנית עד בפוקוס פרוסות נרכשות עבור כל השדה. ג) לכידת קטעי סדרתי כל דקות 7 צריכה לאפשר חי הדמיה במשך 3 עד 4 שעות ללא redu משמעותיction בעוצמת הקרינה GFP שעלולה לפגוע באיכות תמונה. -מרווחי זמן קצרים יותר עשויים להפחית את הזמן הכולל של הדמיה.
2. המשך הדמיה במשך 3 עד 4 שעות. אין להשתמש בפוקוס אוטומטי ופונקצית זמן שנגיש בהרבה מיקרוסקופי ניאון מאז צמיחה ושאיבה של hemolymph גלמים מעבירה את העמדה של הרשתית וערנית נדרשת כל דקות 14-21 התמקדות מחדש. הערה הדמיה שמעבר 4 שעות עשויים להאט או לעכב המורפוגנזה של העין.
3. השתמש בתוכנת deconvolution מתאימה כדי להפחית את הרקע ולשפר את הניגודיות של תמונות סעיף סדרתי. עבור כל קובץ Z- מחסנית, בצע את הפעולות הבאות בתוכנת LAS AF (ראה טבלה של חומרים): נווט ללוח כלים, בחר 3D Deconvolution ולחץ על החל.
4. צור תמונת היטל מרבי (MP) עבור כל קובץ ערימת deconvoluted: נווט ללוח כלים, בחר הקרנת 3D ולחץ על החל.
   הערה: אלגוריתם ההקרנה המרבי עלול להיכשל כדי ליצור אחידly תמונה בפוקוס לרקמות שכבר oversampled. טכניקה לחידוד אזורים מחוץ למוקד מתוארת בשלב 5.2.

4. פוסט-ההדמיה גלמי הצלה והפנוטיפ אימות

1. כדי לטפל באם החפצים הוכנסו או הגולם נפגע במהלך הדמיה, להסיר בזהירות את הגולם מאסדת ההדמיה: באמצעות מלקחיים להסיר את coverslip ולהעביר את הגולם לבקבוקון נקי של מזון. לאחסן בטמפרטורת חדר או 25 מעלות צלזיוס עד הזבוב הבוגר עולה.
2. לבחון היטב את הפנוטיפ של העין מבוגרת ולהשוות לעיניים של זבובים בוגרים מתעוררים מן הצלב לטוס המקורי.

עיבוד 5. תמונה

1. יישור תמונה אוטומטי:
   הערה: רקמת תסיסנית חי תעבור ולגדול לאורך כל תהליך ההדמיה. כתוצאה מכך, המרכזים של תמונות שנאספו בנקודות זמן רצופות אולי לא מתאים לאותה הנקודה ברקמת דרוזופילה. בנוסףדיסק רשתית כל סבב כ -30 מעלות בין ~ 21 ו -23 APF שעות. כדי להדגיש התנהגויות תא בודדות ולהפחית הסחות דעת שנגרמה על ידי גידול האורגניזם, ליישר כל MP image.While זה יכול להתבצע באופן ידני, תוכנת עריכת תמונות משמשת כאן (ראה טבלה של חומרים) יש אלגוריתמים מובנים שיכול לזרז את התהליך.
   1. בכרטיסייה הקובץ של התפריט הראשי, סקריפטים פתוחים וקבצים טען בחרו לסטאק.
   2. לייבא קבצי תמונת MP ללוח השכבות טען ובחר אישור. ודא כי הניסיון יישר אפשרות תמונות המקור באופן אוטומטי לא נבחר.
      הערה: אם אפשרות זו נבחרת, התוכנה יכולה להשתמש באלגוריתם יישור שמעווה את נתוני תמונה.
   3. ברגע שכל קבצי MP שנטענו לתוך חלונית השכבות, לוודא שכל התמונות הן בסדר כרונולוגי, כך שנקודת הזמן המוקדמת ביותר היא בחלק העליון של שכבת המחסנית. אם השכבות אינן בנכונה כדי, גרור ושחררו אותם עד שהם הזמינובצורה נכונה.
   4. בחר שכבות Auto-Align מכרטיסיית עריכה של התפריט הראשי. בחר מיקום מחדש ולחץ על אישור.
   5. אם האלגוריתם האוטומטי היישור נכשל כדי לכוון את המסגרות למוקד רלוונטי, לבצע התאמות קטין באמצעות כלי הזזה.
2. חידוד Composite:
   הערה: אזורי Out-of-פוקוס של תמונת MP ראשונית ניתן חידדו על ידי 'חיתוך' ערימת deconvoluted המקבילה בתוכנת LAS AF. חיתוך קובץ ערימה מאפשר להגביל את המרווח של Z- מחסנית כי הוא נתון אלגוריתם ההקרנה המקסימאלי באופן ידני.
   1. אתר את פונקצית היבול בלוח כלים (תחת לשונית התהליך). באופן ידני להגביל את הפרוסות הראשוניות וסופיים כך שהם מקיפים את חגורת ההידבקות רק בתוך האזור תחילה מחוץ לפוקוס. לחץ על החל כדי ליצור קובץ ערימה חדש שעבר אופטימיזציה לאזור זה.
   2. צור הקרנה המרבית חדשה לערימה מותאמת באופן מקומי ויצוא כקובץ TIFF.
   3. בהתוכנת דואר עריכת תמונות (ראה טבלה של חומרים), סקריפטים פתוחים (הממוקמים בכרטיסיית הקובץ של התפריט הראשי) וטען בחר קבצים לתוך סטאק.
   4. לייבא את הקובץ הראשוני תמונת MP וקובץ MP מותאם באופן מקומי לנקודת זמן מסוימת ללוח השכבות טען ובחר אישור. ודא כי הניסיון יישר אפשרות תמונות המקור באופן אוטומטי לא נבחר.
   5. בחר בשני השכבות בשכבות חלונית ולאחר מכן בחר 'שכבות Auto-Blend (הממוקם בכרטיסיית עריכה של התפריט הראשי) כדי להסוות באופן אוטומטי האזורים המתאימים של שני התמונות, מניב להתמקד ב- אחיד שדה רשתית. להציל את התמונה מורכבת זו כקובץ TIFF.
   6. חזור על שלבים 5.2.1 באמצעות 5.2.5 לכל תמונות MP הכי המוצלחות.
3. התאמות נוספות: לסובב, לחתוך, ולהתאים את הרמות של שכבות הסרט:
   1. עם כל השכבות שנבחרה, להשתמש בכלי המרה (Edit> Free Transform) כדי לסובב את התמונות כך שהציר הגבי-הגחון של הרשתית מיושרלציר y של מסגרת הסרט.
   2. במידת צורך, להשתמש בכלי החיתוך כדי לצמצם את שדה הראייה לגודל וצורה רצויים.
   3. השתמש בהתאמת רמה (של מסגרות בודדות) כדי לעזור לשפר את הניגוד שבין קרום התא ותא בגוף.
   4. למטרות סגנוני ולהדגיש התנהגויות תא מסוימות, להציג את הצבע כוזב כדי להדגיש נקודות עניין בכל מסגרת.
4. אנימציה: להמיר את התמונות לסרט:
   1. פתח את חלונית האנימציה מכרטיסיית Windows של התפריט הראשי. בחר הפוך מסגרות משכבות מהתפריט הממוקם בפינה הימנית העליונה של חלונית האנימציה.
   2. שים לב שהשכבות מתווספות לחלונית האנימציה בסדר רציף החל מתחתית הערימה. כדי להפוך את הסדר של המסגרות, בחר תחילה את כל המסגרות ולאחר מכן בחר הפוכה מסגרות מתפריט חלונית אנימציה.
   3. בחר עיכוב מסגרת זמן לכל מסגרת באמצעות התפריט הנפתח מתחת לאגודל המסגרתמסמר.
      הערה: עיכוב המסגרת לסרטים 1 עד 4 שהוצגו במאמר זה הוא 0.8 שניות.
   4. בכרטיסייה הקובץ של התפריט הראשי, היצוא פתוח ובחרו לדקלם וידאו. בחר QuickTime יצוא תחת אפשרויות קובץ ובחר בפורמט וידאו רצוי. תחת לדקלם אפשרויות להגדיר מסגרת שיעור מותאמת אישית, הזן במסגרת שיעור של 15, ולחץ על לדקלם.

תוצאות

Live-הדמיה של העין גלמים היא אסטרטגיה מוצלחת להתבונן התנהגויות תא שתורמים לדפוסים של neuroepithelium. תפקידם של חלבונים מסוימים ניתן להעריך בקלות על ידי להביע transgenes שמשנה את רמות חלבון במהלך פיתוח העין. כדי לעשות GMR-GAL4 זה משמש לנהוג ביטוי transgene מאחורי תלם המוךפו"גנטי. ז?...

Discussion

תיאור התפתחות wild-type (לעיל) מהווה את הבסיס להשוואות של אירועי דפוסים בRNAi או גנוטיפים ביטוי יתר. השוואות של פיתוח רקמת חיה הן לא יסולא בפז בעת קביעה בדיוק אילו התנהגויות תא מוסדרות על ידי חלבון של עניין. יתר על כן, ולא תאר כאן, הדמיה תא חי מאפשרת לאדם להפוך את התיאורים איכ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b	Available on request from authors
UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b	Available on request from authors
Scotch double stick tape	3M	665
Black Sylgard dissection dish			Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 hr to polymerize
Sylgard	Dow Corning	SYLG184
Sylgard (Black)	Dow Corning	SYLG170
Glass petri dish	Corning	7220-85
25 x 75 x 1 mm glass microscope slide	Fisher Scientific	12-550-413
22 x 40 mm glass coverslip	VWR	48393-172
Forceps	Fine Science Tools	91150-20
Whatman 3mm Chromatography Paper	Fisher Scientific	05-713-336
Vaseline	Fisher Scientific	19-086-291	Or purchase at local pharmacy.
30 ml syringe	Fisher Scientific	S7510-30
Leica TCS SP5 DM microscope	Leica Microsystems
LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software	Leica Microsystems