פרוטוקול עבור לימוד ההכחדה של פחד אוויר באופן טבעי רכיבה על אופני חולדות נקבות

Summary

Gonadal hormones such as estrogen modulate memory formation in a number of experimental paradigms including fear extinction memory. This protocol describes a set of methods for investigating the influence of gonadal hormones specifically during extinction in naturally cycling females, including estrous cycle monitoring and exogenous estrogen administration.

Abstract

הכחדה של פחד מותנה נחקרה בהרחבה במכרסמים זכר. לאחרונה, היה מספר גדל והולך של מחקרים המראים כי מנגנונים עצביים למשימות התנהגותיות מסוימות והתנהגויות תגובה שונים אצל נשים וגברים. שימוש בנשים במחקרים יכול לייצג אתגר בגלל הווריאציה של הורמוני אשכים במהלך מחזור הייחום שלהם. פרוטוקול זה מתאר נהלים מבוססים היטב כי הם שימושיים בחקירת תפקידו של אסטרוגן בגיבוש זיכרון הכחדת פחד בחולדות נקבות. שלב של מחזור הייחום וממשל אסטרוגן אקסוגני לפני אימון הכחדה יכול להשפיע על זיכרון הכחדה 24 שעות מאוחר יותר. טכניקת שטיפת הנרתיק לזיהוי שלב ייחום המתואר כאן מסייעת בחינה ומניפולציה של מטבע רכיבה על אופניים הורמוני אשכים. השימוש במודל מכרסם בסיסי זה עשוי להתוות עוד יותר את המנגנונים שבאמצעותם אסטרוגן יכול לווסת את זיכרון הכחדת פחד בנקבות.

Introduction

הבדלים בין מינים הטמונים הם נצפו על פני התנהגויות קוגניטיביות שונות ופרדיגמות למידה בשני בני אדם ומכרסמים. לדוגמא, זה כבר דווח כי, בדרך כלל, לנשים יש יכולות מילוליות ואורינטצית פירוט חזקות, בעוד שגברים יש יכולות מרחבית טובות יותר ^1-3. הבדלים בין מינים אלה עשויים להיות בין שאר כתוצאה מההשפעה של הורמוני אשכים. רמות אסטרדיול גבוהות לשפר את הביצועים במשימות שבו נשים הן יותר טובים, אבל להחמיר את הביצועים במשימות שגברים בדרך כלל עושים טובים ^4-6. למרות עדות זו היא משכנעת, היכולת המוגבלת לשלוט לחלוטין סביבות ניסוי במחקרים בבני אדם עושה את זה קשה לקבוע אם ניתן לייחס את ההשפעות הללו על התנהגות ספציפית להורמונים. מחקרים בבעלי חיים, לעומת זאת, מאפשרים לנסיבות בשליטה מלאה.

למרות המנגנונים העצביים הבסיסיים של הכחדת פחד זוהו ונלמדים גם בגברים, לא ברור אםמערכות אלה הן אותם בנקבות או איך הם משתנים לאורך מחזור הייחום. אוויר פחד והכחדה נמצאים בשימוש נרחב פרדיגמות התנהגות במכרסמים ובני אדם לבצע מחקרים הקשורים להפרעות חרדה. בהתחשב בכך שיש לי נשים בסיכון גבוה יותר להפרעות חרדה, כמו גם משך סימפטום גבוה יותר ובחומרה ^7-13, זה קריטי לכולל נקבות במחקרים אלה. תת-הייצוג של נשים במחקר זה ניתן לייחס לאתגרים של ניטור ייחום שלב וחשבונאיים להשפעות ההתנהגותיות של הורמוני מין. מעבדות שעושות לבחון נקבות בסוגיות מפגש הקשר זה, כי לעתים קרובות אינו מדווח או אינם מתואר בשיטות ללימודיהם.

מתעורר ראיות במכרסמים מצביע על כך שהבדלים בין מינים בהכחדת פחד הם מווסתים על ידי הורמוני אשכים ^14-18. בפחד אוויר, הם מאומנים לפחד גירוי מסוים. לאחר מספר מצגות unreinforced שלהגירוי, בעלי החיים ללמוד לא לפחד קיו, תהליך הנקרא הכחדה. כמה טוב בעלי החיים לומדים ומאחדים את הזיכרון של למידת משימה זו ניתן לצפות במהלך בדיקת זיכרון הכחדה נתנה כמה זמן אחרי אימון ההכחדה. ביטוי פחד פחות בזכרון הכחדה מדגים גיבוש זיכרון הכחדה טוב. ממצאים אחרונים מהמעבדה שלנו מציעים כי אסטרוגן יכול לווסת את האיחוד של זיכרון הכחדת פחד ולשפר את זיכרון הכחדה. באופן ספציפי, חולדות נקבות שכובו בproestrus, השלב של מחזור הייחום שבמהלכו במחזור שיא רמות האסטרוגן, שימור משופר תערוכת זיכרון הכחדה. בניגוד לכך, נשים שכבו בתצוגת שלב metestrus אסטרוגן הנמוך זוכרת הכחדה עניה יחסית, שניתן לשפר עם ממשל אסטרדיול אקסוגניים לפני או מייד לאחר אימון הכחדת ^15,16. המנגנונים העצביים של גיבוש זיכרון הכחדה (כולל מע"מuding את התפקיד של הורמוני אשכים) בנקבות אינם ברורים.

בחיות מעבדה, התפקיד של הורמונים יכול להיחקר באמצעות נהלי הסרה כירורגית פולשנית כגון סירוס וovariectomy. לאחר התאוששות מניתוח, הורמוני אשכים לעתים קרובות מניפולציות אקסוגני בזמן ההופעה של משימה התנהגותית ^19. גישה זו סיפקה מידע קריטי על הורמוני מין ושימושי משום שהיא מאפשרת למניפולציות מבוקרות היטב של הורמוני אשכים (במונחים של תזמון ומינון) ^20-23. גישה זו, עם זאת, לא להעריך את ההשפעה של התנודות טבעיות המתרחשות על פני מחזור הייחום וגם אינו מייצגים בעלי חיים "נורמלים", וכך להגביל את פוטנציאל translational למחקרים בבני אדם. זה תועד היטב כי שיא רמות הורמון מין נשי וירידה בשלבים מסוימים של מחזור הייחום, וביטוי קולטן אסטרוגן שינויים במחזור,ואחרי ovariectomy ^24. לפיכך, יש צורך לערוך מחקרים על נשים עם בלוטות מין שלמים ולשפר את העיצוב ניסיוני ללמוד באופן מהימן את ההשפעות שמדינות אסטרוגן גבוהות ונמוכות עשויות להיות בנקבות בכל תוחלת החיים שלהם.

פרוטוקול זה מתמקד בהשפעה של אסטרוגן על מערכות נוירו-הביולוגיות מעורבות בהכחדת פחד. הוא מתאר כיצד: 1) לפקח בזהירות את מחזור הייחום, 2) להכין מינונים אפקטיביים של אסטרדיול לממשל מערכתי, ו- 3) לעקוב אחר פרדיגמה התנהגות הכוללת אוויר פחד, הכחדה, ולהיזכר בחולדות נקבות באופן טבעי רכיבה על אופניים. פרוטוקול זה יכול להיות שונה עם מניפולציות תרופתיות אחרות וכלים תאיים ומולקולריים כדי לסייע מחקרים כדי להבין טוב יותר הבדלים בין מינים שנצפו במותנה פחד הכחדת התנהגות. שים לב כי הנהלים המפורטים להלן הם אלה המשמשים במעבדה שלנו, וקיים מספר הווריאציות של נהלים אלה in הספרות.

Protocol

הערה: כל הנהלים בפרוטוקול זה אושרו על ידי ועדת המשנה למחקר טיפול בבעלי חיים, המשמש כועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) לבית החולים הכללי מסצ'וסטס, ועומדים במכונים הלאומי לבריאות הנחיות.

1. שיכון בעלי חיים ונוהל טיפול

1. עם ההגעה, חולדות נקבות בוגרות בית ספראג Dawley כ 8-10 שבועות של גיל (במשקל 200-225 גר ') בקבוצות של 3-4 פחי פלסטיק אינץ' עם מצעי woodchip. לשמור אותם בדיאטת גישה כרצונך מודעה של לצ'ו ומים ושעתי אור 12 / מחזור כהה. השאר חולדות להסתגל למתקן תנאי דיור ובעלי חיים למינימום של שבוע 1.
   הערה: כל הנהלים בכתב היד הזה מתבצעים במהלך מחזור האור.
2. בעקבות תקופת הסתגלות זו, לטפל בכל בעלי החיים במשך 5 דקות כל אחד במשך 2-3 ימים. כראוי להרים את חולדות אחד בכל פעם (נתמך על ידי פלג הגוף העליון ולא בזנב),להחזיק אותם באופן מאובטח, וללטף אותם בתקופה זו. ידית בעלי חיים המופיעים יותר הדגיש, עצבני, או חרדה לתקופות זמן ארוכות יותר. לעשות את זה כדי למזער את הטיפול בלחץ, שעלול להשפיע על השלבים הבאים בפרוטוקול זה.
   הערה: מספר הימים ומשך זמן טיפול בבעלי החיים יכולים להשתנות בין מעבדות שונות; עם זאת, אלה צריכים להיות עקביים בין ניסויים באותה המעבדה.

2. ניטור מחזור הייחום: הנרתיק ספוגית מריחה ומכתים נוהל

1. הפוך 0.9% תמיסת מלח (נתרן כלורי מומס במים מזוקקים). להרטיב המוליך כותנה שקצה בפתרון זה. למחוק את הקצה בעזרת מגבת נייר, כדי למנוע oversaturation, מה שעלול להוביל לאוסף מדגם לקוי או אובדן של תאים. מחזיק את הזנב כלפי מעלה מאת פתח הנרתיק, בעדינות להכניס את קצה הכותנה לתעלת הנרתיק ולהתגלגל הקירות כדי ללכוד תאי נרתיק רופפים.
2. אם בעל החיים משתינים על המיטהטיפ טון, להחליף עם אחד חדש, כמו זיהום בשתן יקשה על זיהוי שלב. להיות זהיר מאוד כדי לא לגרום למצוקה לבעלי החיים במהלך הליך זה, כי חשיפה ללחץ תשבש את מחזור הייחום. כאשר בניקוי, במטרה להשיג הכנסה מהירה ונסיגה שאינה עמוק מדי במטרה לצמצם את הגירוי נוסף לצוואר הרחם, שיכול לגרום לpseudopregnancy.
   הערה: Pseudopregnancy יכול להיות מזוהה כמחזור ייחום אציקליים, כי בדרך כלל נמשך כ 12 ימים, כלומר ימים רצופים של diestrus ^25.
3. מוציא בזהירות את קצה המוליך ולגלגל אותו לשקופית מיקרוסקופ שכותרתו מראש. הימנע לחיצה חזקה מדי, יותר מדי נוזלים בשקופית יכול לעשות זיהוי שלב קשה ברגע שיבש.
   הערה: שקופית אחת יכולה להכיל מספר ימים לכל חיה, למרות שזה יכול להיעשות בהתאם להעדפות אישיות.
4. ודא העברות מדגם לשקופית. לאסוף דגימות לניתקימים רצופים אל על שקופית אחת כדי להיות מסוגלים לעקוב אחר טוב יותר ולזהות שינויי שלבי ייחום יומיים.
   הערה: במידת האפשר, את זה הוא גם אידיאלי אם אנשי איסוף דגימות יישארו זהים לכל בעלי החיים.
5. ברגע שהשקופית היא יבשה, להתחיל הפרוטוקול מכתים לזיהוי שלב. שימוש בערכת הצביעה (ראה טבלה של חומרים), לטבול את שקופיות 10 פעמים במקבעות (תכלת), 10 פעמים בפתרון כתם (ורוד), ו -5 פעמים בפתרון counterstain (סגול). יש לשטוף את השקופיות בעדינות מתחת למים זורמים. בואו שקופיות יבשות לחלוטין אוויר לפני הצגה תחת מיקרוסקופ.
   הערה: מחזור הייחום הארוך בדרך כלל 4-5 היום מורכב מ( לפי הסדר הזה): ייחום (E), metestrus (M), diestrus (ד '), וproestrus (P) ^26. הייחום מאופיין בתאים כחולים, cornified, metestrus על ידי כדוריות דם לבנות ושילוב של תאי cornified והגרעיניים, diestrus דומה לmetestrus בנוכחות של סוגי תאים למעט הם מאוד דלילים, וproestrus ידי אגרגטים מוכתמים סגוליםתאים של בעלי הגרעין (איור 1). ישנם נהלים שונים צביעה, בנוסף לאלו שתוארו לעיל, כי הם יעילים באותה מידה לציטולוגית מריחה בנרתיק.
6. לאסוף דגימות לפחות שני מחזורים מלאים (כ 8-10 ימים) על מנת לעקוב אחר השלבים במדויק לפני ניסויים. בקנה אחד עם הזמן של יום הדגימות נלקחות. לאסוף דגימות משטח מהנרתיק יומי לאורך כל דרך ועד לסוף הניסוי.

3. טרום חשיפה

1. לפני תחילתו של הניסוי, לפני לחשוף את בעלי החיים לאוויר תאים לאפשר החיות להסתגל למסגרת (תאי אוויר) לפני כל בדיקות התנהגותיות.
   1. טרום לחשוף את הנקבות לתאי האוויר (הממוקמים בתיבות ממתנות-קול) עם אורות הבית בבמשך 20-30 דקות ביום במשך 3 ימים לפני כל ניסויים. הקצה את התיבה שהם כלתאם למחקר נחשף מראש. t לנקות ביסודיותהוא קופסות (קירות ומגשים) בין פגישות ובעלי חיים כדי להסיר ריחות שכן הם יכולים להשפיע על התנהגות ומחזור הייחום.

4. יום 1: הרגלה / פחד אוויר

1. ברגע שהבעלים החיים אומתו להיות בשלב הייחום של מחזורי הייחום שלהם, תתחיל את שלב התרגלות / אוויר של ניסוי 3 הימים.
   1. קח מראש טון צעדים בסיסיים של הקפאת מצגות לפני הגירוי המותנה הטון הראשון (CS) בכל יום של הניסוי. לעשות זאת על ידי רכישת ציוני הקפאת אחוזים (מחושבים על ידי חלוקת שניות בילו נייח על ידי משך המשפט, כפול 100) במרווח זמן הגירוי-נעדר בתחילת משפט CS-לבד הראשון לפני תחילת CS.
      הערה: צעדים אלה יכולים לשמש כדי להעריך ולהשוות את רמות הקפאה בסיסיות עם אלה במהלך הרגלה, אוויר, הכחדה, וזכירה.
   2. לנהל אימוני הכחדה בשלב metestrus,להתנות את החולדות ביום האחרון שלהם של ייחום. שלב ספוגית ולזהות ייחום (שלב 2) בכל יום לפני תחילת פרוטוקול הניסוי (אוויר / הכחדה / זוכר). כשלב הייחום עלול להימשך זמן רב יותר מיום אחד, היסטורית מחזור השימוש לחזות אורך שלבים כדי לקבוע מתי בעלי החיים מוכנים להתחיל אימון.
2. בתאי האוויר, לחבר את רצפת רשת רגל-ההלם לגנרטור גירוי חשמלי. השתמש ברמת גירוי של 0.5-0.6 mA כגירוי מותנה (US). השתמש kHz 4, 80 טון dB כגירוי המותנה (CS).
   הערה: פרמטרים אלו עשויים להשתנות בכל מעבדות ועשויים להיות שונה לאוויר אופטימלי.
   1. אם תכנית ניתוח ההקפאה דורשת רמזים חזותיים (בניגוד לזמן), שיתוף להפעיל אור LED עם הטון. מקם את האור בצד החיצוני של התא אופרנטית, בתוך מסגרת וידאו. בתחילת כל ניסוי, להפעיל את אור LED ולשמור אותו מואר ועד לסוף המשפט דואר.
      הערה: אור זה לא נראה לעין על ידי בעלי החיים, ורק משמש כסמן לייזום ולסיומו של המשפט בתוך קבצי וידאו המוקלטים (שמשמש למדידת התנהגות הקפאה).
3. מניחים את בעלי החיים לתאי האוויר במשך 5 ניסויים CS-לבד של התרגלות. מייד לאחר פגישת הרגלה, לבצע ניסויי 7 CS-אמריקאים לזווג פחד האוויר. ודא שטון CS נמשך 30 שניות וcoterminates עם הלם שניות 0.5. ניסויים לרוץ בכל המפגשים (התרגלות, אוויר, הכחדה, וזכירה) עם מרווח intertrial משתנה בממוצע 3 דקות.
4. בסוף פגישת האוויר, להחזיר את החיות לכלובים בביתם ולמתקן בעלי החיים עד ליום המחרת.

5. יום 2: אסטרדיול הכנה

1. ספוגית ולזהות את שלב הייחום לכל בעלי החיים שעברו יום 1 של פרוטוקול זה. הכן אסטרדיול (הידוע גם בE2, 17beta-אסטרדיול, אובטא-אסטרדיול) ל15 מיקרוגרם / קילוגרם מינון הזרקה תת עורית באמצעות שמן שומשום או מלח 0.9% כרכב.
2. כדי לחשב את הסכום של אסטרדיול כדי להתכונן לזריקות, להשתמש במשקל הגוף של כל בעלי החיים, שנמדדו ונרשמו כאשר הם מותנים ביום 1 של פרוטוקול זה.
3. לעשות חישובים כדי לתקן את עוצמת הקול של אסטרדיול מנוהל (כלומר 0.2 מיליליטר) לחולדה. מאז אסטרדיול קשה לפזר בשל insolubility המים שלה ודורש נפח גדול של ממס למנה הקטנה, להכין פתרון מניות על ידי ערבוב אסטרדיול בשמן שומשום על אש עד שהיא נמסה. הפתרון אז יכול להיות מועבר דרך מסנן 0.22 מיקרומטר להסרת מזהמים. לדוגמא, להוסיף נפח מחושב של פתרון מניות שמן שומשום 3000 מיקרוגרם אסטרדיול מיליליטר / 1 עד נפח הדרושים הכולל של שמן שומשום על מנת להשיג 15 מיקרוגרם / קילוגרם מינון בהזרקה 0.2 מיליליטר לכל חיה נפח.
   הערה: לחלופין, להשתמש בצורות אחרות של tha אסטרוגן t הם מסיסים במים וקלים יותר לפזר.

6. יום 2: אסטרדיול מנהל / הדרכת הכחדה

1. לנהל את תת עורי אסטרדיול. הרם את העור הרפוי בין ההשכמות בצוואר בעת צרה עדינה ולהכניס את מחט המזרק לתוך המשולש שנוצר על ידי קפלי העור.
2. 30 דקות הבאות זריקות תת עוריות של אסטרדיול, למקם את בעלי החיים בתאי האוויר שוב ולהתחיל אימוני הכחדה. בפגישה זו הכחדה, לבצע 20 ניסויים CS-לבד, עם כל ניסוי בהיקף של 30 שניות, 4 kHz, צליל dB 80, שהוצג במרווח intertrial משתנה בממוצע 3 דקות.
   הערה: ההשפעה של אסטרדיול על החזרה מתרחשת כאשר אסטרדיול מנוהל לפני אימון הכחדה או מייד לאחר הכחדה. ההשפעה לא נצפתה הודעה הכחדה-4 שעות, ולכן מומלץ להזריק קרוב בזמן לתחילתו או בסופו של האימון ^15.

. Le "> 7 יום 3: Extinction Recall

1. 24 שעות לאחר אימון ההכחדה, ספוגית בעלי החיים שהשלימו יום 1 ו- 2 של פרוטוקול זה.
2. מניחים את החיות לתאי האוויר שהוקצו להם (כמו יום 1 ו -2). להתחיל את ההפעלה זוכר הכחדה על ידי הצגת 3 ניסויי CS-לבד (שלושה הניסויים של זיכרון הכחדה), אשר מורכבים מניסויי CS-לבד רק 3.80 dB עם מרווחי intertrial דומים ל -20 הניסויים מנוהלים לאימוני הכחדה כמתואר בשלב 6.2.
3. עם השלמת הפעלת הזיכרון, להחזיר את החיות לכלובים בביתם.

ניתוח נתונים 8.

1. לרכוש נתונים התנהגותיים באמצעות וידאו ולנתח אותם באמצעות תוכנת מחשב.
   הערה: ציוני הקפאה גם ניתן לספור ידני על ידי הנסיין שהוא עיוור לטיפול התרופתי על ידי תזמון התקפי הקפאה במהלך מצגת CS של כל ניסוי, הביע כאחוז מהזמן בילה בהקפאה את הטון. הקפאה היאשהוגדר על ידי חוסר מוחלט של תנועה למעט הנשימה במהלך 30 ניסויי שניות CS-ארה"ב. לחשב הקפאת אחוזים על ידי חלוקת שניות בילו הקפאה (נייח) על ידי 30 שניות (משך המשפט) כפולות 100.

תוצאות

בפרוטוקול זוכר הכחדת הפחד הזה, הקפאת אחוזים נמדדה כמדד לפחד. בעלי חיים שכיבו היטב ושמרו את זכרו של אימון ההכחדה הציגו פחד נמוך ביום האחרון של הבדיקות התנהגותיות במהלך זוכר הכחדה. חולדות זכרים ונקבה אינן שונות באופן משמעותי בביטוי פחד מותנה באוויר, ההכחדה, ולהיזכר בשל...

Discussion

הכחדת פחד, נחקרה בהרחבה בחולדות זכרים עם המנגנונים העצביים תיווך הכחדת פחד מותנה לזהות ולהעריך תחת מניפולציות שונות. מעטים יחסית מחקרים בחנו חולדות נקבות או את התפקיד של הורמוני אשכים בהכחדת פחד. ללמוד באופן ספציפי את ההשפעה של אסטרוגן על הכחדת פחד, חולדות נקבות באו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fear conditioning chamber	Coulbourn Instruments
Graphic State	Coulbourn Instruments
Sound-attenuating box	Med Associates, Inc.	NIR-022MD
Estradiol	Sigma-Aldrich	E1024	In sesame oil for subcutaneous injection
Sesame oil	Sigma-Aldrich	S3547-250ML
Freezescan	Cleversys, Inc.
Dip quick stain	Jorgensen Laboratories, Inc.	J0322A1, J0322A2, J0322A3
Cotton-tipped applicators	Fisher Scientific	23-400-114	6-inch, sterile
0.9% saline	LabChem, Inc.	LC23460-2	Sodium chloride w/v
Selectfrost microscope slides	Fisher Scientific	12-550-003
Virex II 256	Diversey, Inc.	5019317	Dilute 1:256 with water
Luer-Lok Tip 1ml Syringes	Becton Dickinson	309628
Hypodermic disposable needles	Exelint International, Co.	26402	26-gauge