שיטה להערכת ההשפעות של טווח של אורכי גל ועוצמות של אדום / טיפול באור האינפרה-אדום קרוב בסטרס חמצוני<em&gt; במבחנה</em

Summary

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Abstract

Red טיפול / אור האינפרה-אדום קרוב (R / NIR-LT), מועבר על ידי לייזר או אור דיודה (LED), משפר את התוצאות תפקודיות ומורפולוגיים במגוון של פציעות של מערכת עצבים מרכזיות בגוף חי, ככל הנראה על ידי הפחתת לחץ חמצוני. עם זאת, השפעות של R / NIR-LT על סטרס חמצונים הוכחו להשתנות בהתאם לאורך גל או עוצמת הקרינה. מחקרים שהשוו בין פרמטרים טיפול חסרים, בשל העדר מכשירים זמינים מסחרי המספקים אורכי גל מרובים או עוצמות, מתאימים לגבוהה דרך-לשים במחקרי אופטימיזציה מבחנה. פרוטוקול זה מתאר טכניקה למסירה של אור בטווח של אורכי גל ועוצמות כדי לייעל את המינונים טיפוליים הנדרשים למודל פציעה נתון. חוקרים שערנו כי שיטה להעברת אור, שבו בקלות אפשר לשנות פרמטרים אורך גל ועוצמת, יכולה להקל על קביעת מינון אופטימלי של R / NIR-LT להפחתת מיני חמצן מגיבים(ROS) במבחנה.

אור קסנון ללא קוהרנטית היה מסונן דרך מסנני התערבות פס צר כדי לספק אורכי גל שונים (אורכי גל מרכז 440, 550, 670 ו810nm) וfluences (8.5 x 10 ^-3 ל -3.8 x 10 ^-1 J / ² סנטימטר) של אור לתאים בתרבית. תפוקת אור מהמנגנון כוילה לפלוט מינונים רלוונטיים טיפולי, שווים quantal של אור בכל אורך גל. מינים תגובתי אותרו בגלוטמט הדגיש תאים שטופלו באור, באמצעות DCFH-DA וH ₂ O ₂ צבעי ניאון רגישים.

אנחנו בהצלחה נמסרו אור בטווח של אורכי גל רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית וטיפולי ועוצמות, לתאים בתרבית נחשפו לגלוטמט כמודל של פגיעה במערכת העצבים המרכזית. בעוד fluences של R / NIR-LT השתמש במחקר הנוכחי לא להפעיל השפעה על ROS שנוצר על ידי התאים בתרבית, השיטה של ​​מסירת אור ישימה למערכות חלקות אחרותEMS לרבות מבודד מיטוכונדריה או יותר מבחינה פיזיולוגית מודלים תרבות הפרוסה organotypic רלוונטיות, ויכול לשמש כדי להעריך את ההשפעות על מגוון של מדדי תוצאה של מטבוליזם חמצוני.

Introduction

מיני חמצן מגיבים (ROS) נדרשים למגוון רחב של מסלולי העברת אותות ותגובות נורמליות של חילוף חומרים תאיים, כוללים אלה של neuroprotection ^1. עם זאת, כאשר המנגנון נוגד חמצון אנדוגני אינו מסוגלים לשלוט בייצור של ROS, תאים עשויים להיכנע ללחץ חמצוני ^2,3. בעקבות פגיעה במערכת העצבים המרכזי, העליות הקשורות בנוכחות של ROS וסטרס חמצונים הם חשבו לשחק תפקיד משמעותי בהתקדמות נזק ^4,5. למרות המספר הרב של אסטרטגיות להחלשת לחץ חמצוני שכבר העריך, אין כיום, אסטרטגיות נוגדת חמצון רלוונטיים קליני יעילות לחלוטין להחלשת ייצור ROS וסטרס החמצונים הקשורים בשימוש קליני הבא neurotrauma ^6. לכן הנחתה של סטרס חמצונים נשארה מטרה חשובה להתערבות טיפולית ^7.

שיפורי מעקבR ing / NIR-LT כבר דיווח במגוון רחב של פציעות ומחלות, כולל הפחתה בגודל Cardial אוטם, סיבוכי כליות וכבדים בסוכרת, ניוון רשתית, פגיעה במערכת העצבים המרכזית ושבץ ^8, אולי על ידי הפחתת לחץ חמצוני. בהתייחס בפרט לפגיעה במערכת העצבים המרכזית, מחקרים פרה-קליניים של יעילות של 670nm אור הראו השפעות טובות במודלים של ניוון רשתית ^9-11, פגיעה בחוט השדרה ^12, מוות עצבי ^13. ניסויים קליניים שנערכו לגיל יבש הקשורים ניוון מקולרים והם מתנהלים כיום לשבץ ^14, אולם התוצאות של ניסויים אלה אינם מופיעים מבטיחות, אולי בשל כשל להעסיק טיפול יעיל פרמטרים ^15. ככזה, R / NIR-LT לא אומץ באופן נרחב כחלק מפרקטיקה קלינית רגילה בneurotrauma, למרות היותו קל לניהול, לא פולשנית וטיפול זול יחסית. חסמים לתרגום קליני כוללים חוסר CLמוקדם הבין מנגנון פעולה והיעדר ^16,17 פרוטוקול טיפול יעיל סטנדרטי. ספרות הקיימת לגבי טיפול באור מגלה שפע של וריאציה בפרמטרי טיפול ביחס למקורות קרינה (LED או לייזר), גל (לדוגמא, 630, 670, 780, 810, 830, 880, 904nm), מינון כולל (ג 'אול של קרינה / יחידת שטח), משך (זמן חשיפה), תזמון (עלבון מראש או שלאחר), תדירות טיפול ובמצב האספקה ​​(דופק או מתמשך) ^8. ההשתנות בפרמטרי טיפול בין המחקרים עושה השוואה קשה ותרמה לספקנות לגבי יעילות ^16.

לכן, אופטימיזציה של R / NIR-LT בבירור נדרשת, עם מערכות תרבית תאים מסוגלים לספק את מנגנון הקרנת התפוקה הגבוהה הדרוש כדי להשוות את המשתנים המרובים. עם זאת יש מערכות תאורה זמינות מסחרי כמה שיכול לספק גמישות מספקת ושליטה על wavelength ועוצמה לבצע ניסויי אופטימיזציה כזה. מסחרי התקני LED זמינים הם בדרך כלל לא מסוגלים לספק אורכי גל מרובים או עוצמות, וכתוצאה מכך חוקרי העסקת התקני LED מרובים של יצרנים שונים, אשר עשוי להשתנות לא רק בעצמה, אלא גם את הספקטרום של אורך גל של האור הנפלט. יש לנו לטפל בבעיה זו על ידי שימוש במקור אור בפס רחב קסנון המסונן דרך מסנני התערבות צר, ובכך לייצר מגוון רחב של אורכי גל וfluences של אור, המאפשר שליטה הדוקה, מדויקת של הפרמטרים של R / NIR-LT.

חשוב לציין כי המינון הטיפולי של טיפול מוגדר במספר הפוטונים אינטראקציה עם photoacceptor (chromophore), אשר, במקרה של R / NIR-LT הנחה היא להיות מונואמין ג ציטוכרום (COX) ^18. אנרגיית פוטון נמסרה משתנה עם אורך גל; כלומר מינונים שווים של אנרגיה באורכי גל שונה יהיה comיקר של מספרים שונים של פוטונים. לכן, האור הנפלט מהמכשיר כויל לפלוט מספר שווה של פוטונים לכל אחד מאורכי הגל שנבחרו להיבדק. פיתחנו מערכת שיכול לשמש כדי לספק R / NIR-LT במגוון של אורכי גל ועוצמות לתאים במבחנה והפגנתי היכולת למדוד את ההשפעות של R מועבר / NIR-LT על ייצור ROS בתאים נתון ל לחץ גלוטמט.

Protocol

1. כיול אופטי: מדידת תפוקת אור

1. כדי להכין את מנגנון מסירת האור, להתחבר למקור אור בפס רחב (למשל, קסנון או מנורת טונגסטן) לאספקת חשמל מתאימה. מקם עדשת collimating מול מקור האור כדי לייצר קרן collimated של אור. להעביר את האור דרך מסנן חום נוזלי כדי להסיר ביותר של החום מקרן האור. בהתאם ליישום, למקד את אלומת collimated על צמצם הכניסה של מדריך אור נוזלי, אשר מספק למסירה גמישה יותר של האור (לדוגמא., לחממה).
2. בקצה השני של ספר אור הנוזלי, למקם את העדשה שנייה collimating ולאחר מכן בעל להפרעות ומסנני צפיפות ניטראליים. בדוק שהסדר זה מייצר מקום מואר באופן שווה של אור של תחום הגלים ועוצמה הרצויים.
   הערה: המרחק בין סוף ספר האור ומטוס הדגימה ייתכן שיהיה צורך להשתנות בהתאם להאזור זה חייב להיות מואר, אך יש לזכור כי ככל שהמרחק מהקצה של עליות מדריך אור, עוצמת אור תקטן. במחקר הנוכחי, מרחק זה הוא 14cm ומייצר חתך קורה שבאופן שווה מאיר אזור היטב 3x3 על צלחת 96-היטב.
3. ודא שאור תועה מהמנורה והרכיבים אופטיים הקשורים הוא לא הצליח להגיע לדגימה.
4. הפעל את מתקן המים הקרים למסנן החום הנוזלי ולהבטיח שיש חילופי מים דרך מסנן המעיל. הפעל את מקור כוח המנורה ולחכות לפחות 5 דקות למקור אור בפס רחב לייצוב. הערה: השימוש במים הקריר נדרש כדי למנוע חימום יתר של המכשיר.
5. בחר מסנן התערבות צר (בדרך כלל שתואר על ידי אורך הגל שלהם המרכז, העברת שיא ורוחב חצי מקסימום רוחב פס (FWHM)) על מנת ליצור את תחום הגלים הרצויים של תאורה. הערה: מסנני ההתערבות צר ששמשו במחקר הנוכחי היו 442 ננומטר, 550 ננומטר, 671 ננומטר ו810 ננומטר.
6. מדוד את האור המיוצר על ידי המנורה במטוס שבו הדגימה היא להיות ממוקמת במהלך טיפול. למדוד אור באמצעות בדיקה מכוילת irradiance (אספן קוסינוס) מחוברת לspectroradiometer מתאים, באמצעות תוכנת תקינות לפי הוראות יצרן.
7. השתמש במסנני צפיפות ניטראליים כדי להתאים את עוצמת האור עד התפוקה הרצויה מתקבלת. הערה: במחקר הנוכחי, את עוצמת האור שנתקבל בכל מסנן התערבות מותאמת לתת תפוקת quantal שווה בכל אחד מארבעת תחומי תדרי הטיפול. חשוב לבדוק את הכיול באופן קבוע, כפלט המנורה עשוי להשתנות.
   הערה: בעקבות ההגדרה של המנגנון, התאים מוכנים להיות מואר איור 1 הוא ייצוג של מנגנון אספקת האור השתמש במחקר הנוכחי..

תמונת איור 1. של מנגנון משלוח האור. אילוסטרייטד היא מקור כוח האור, מנורת קסנון עם דיור, עדשת collimating, מסנן מים, צמצם כניסה, מדריך אור נוזלי, עדשת collimating שנייה, בעל מסנן, מסגרת טיפול ושחור כרטיס מט. שים לב כי מסנני אורך הגל ועוצמת צרי אינם מוצגים.

2. תא הכנה

1. שיטת ההצגה המתוארת R / NIR-LT יכולה להיות מיושמת על כל סוג תא או במערכת מודל חוץ גופית; כתיאורים של תרבית תאים כגון הבאים הם כלליים, תוך שימוש בטכניקות מבוססות היטב לpheochromocytoma התרבות (PC12), Müller (rMC1) ותאי רשתית מעורבים עיקריים.
2. לפני זריעת תאים לטיפול באור וassay סטרס חמצונים, התרבות הנציחה תאים בתקשורת הצמיחה שלהם המכילות תוספים מתאימים (לדוגמא., FBS, אנטיביוטיקה) בflas T75ks עד מחוברות 70-80%.
3. ניתוק תאים הונצחו מצלוחיות T75, תוך שימוש בשיטה מתאימה לסוג התא להיבדק למשל., טריפסין. אם יש צורך, לפני שתמשיך עם הזריעה של תאים ב96-גם צלחות assay, בארות צלחת assay המעיל עם 10μg / poly-L ליזין מיליליטר עבור 1h (למשל., לתאי PC12) או 10μg poly-L ליזין / מ"ל ל 1H ואחריו O / דגירה N עם 10μg / ml laminin (למשל., לתאי רשתית מעורבים).
4. תאי צנטריפוגה כדי לאסוף מתאימים כ( למשל., 3 דק 'ב 405 XG לתאי PC12 או 10 דקות ב 218 XG לתאי rMC1), להסיר את supernatant וגלול ב8 מיליליטר של תקשורת בתרבות התא המתאימה.
5. אם תאים ברשתית מעורב הם לשמש, להכין מגורי חולדה ילוד P0-5 על ידי עיכול אנזימטי (פפאין) על פי נהלים שנקבעו ¹⁹
6. לספור את מספר תאי קיימא בניכוי 0.4% (w / v) צבע כחול trypan, באמצעות haemocytometer.
7. התאם suc צפיפות תאיםh כי תאים יהיו כ 70-80% ומחוברות לאחר 24 או 48 שעות בתרבות. (לתאי PC12 צפיפות הזריעה היא 4.0 x 10 ⁵ תאים / מיליליטר קיימא, לתאי rMC1, זה 2.5 x 10 ⁵ תאי קיימא / מיליליטר ולתאי רשתית מעורבים זה 8 x 10 ⁵ תאים / מיליליטר קיימא). לאחר הוספת תאים לאו 96-גם צלחות ברורות או שחורות (המשמשות לH ₂ O ₂ או assay DCFH-DA בהתאמה), בתקשורת של צמיחה המתאימה 100 μl, לאפשר צלחת לשבת על משטח שטוח על 37 מעלות צלזיוס, 5 % CO ₂ (או מה תנאים מתאימים לסוג תא המסוים) לפחות 24 שעות כדי לאפשר לדבקות תא.
8. תרבות תאים בתקשורת צמיחה במגשי 96 גם המתאימים עד שהם ומחוברות 70-80% (24 שעות לPC12 ותאי rMC1, 48h לתאי רשתית מעורבים).

3. הוספת גלוטמט לחץ לתאים

1. הכן ריכוזי לחץ מימה מלח L-גלוטמית מונוסודיום החומצה של 0-10mM בgrow המלא המתאיםתקשורת ותרבות ה.
2. הסר את המדיה מהתאים ולשטוף בעדינות תאים 3 פעמים עם PBS (PC12) או HBSS (rMC1 ותאי רשתית מעורבים). לאחר שטיפה, להוסיף מדיה המכיל גלוטמט להיקף כולל של 100 μl / טוב.

4. ראשית מינונים של טיפול אור

1. מייד עם תוספת של גלוטמט או הלחץ של בחירה, חושף את התאים לטיפול באור באורכי הגל והעוצמות הרצויים על ידי הצבת תחת מנגנון אספקת האור מוכן. הקפד לשנות את פלט quantal של קרן האור באמצעות שילובים הוקמו במסנני צפיפות ניטראליים בהתאם לאורך הגל להיות מנוהלת.
   הערה: בניסויים הנוכחיים, חושף את התאים לטיפול באור 3 דקות לשמור על הטמפרטורה על ידי נח 96 הצלחות גם על משטח חום C 37 ^o. זמן טיפול עשוי להיות מגוון, כנדרש.
   1. הנח שחור מט כרטיס מתחת לתאים כדי למנוע אור המשקף לבארות סמוכות ב96-welמגש l מיועד לפרמטרים טיפול אחרים.
2. אם הטיפול הוא רצוי לאורכי זמן ארוכים יותר, להוסיף למאגר 25mm Hepes לשמור pH של התקשורת בתרבות תא או באופן אידיאלי, במקום צלחות המנגנון וטיפול בתוך חממה עם ריכוז CO ₂ המוסדרים עד 5% CO _2, או תנאים שהם אופטימליים לסוג תא המסוים.
3. לאחר השלמת הטיפול באור, למקם את התאים על משטח ישר ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ (או מה תנאים אופטימליים לסוג התא) ל24h.
   הערה: מינונים נוספים של R / NIR-LT יכולים להינתן כמתואר לעיל, כרצונכם.

5. סופי מינון של אור טיפול ואיתור של ROS

1. לפני ביצוע הסיבוב של טיפול באור האחרון, להכין את חומרים כימיים שישמשו לזיהוי ROS. הכן חיץ 50mm ציטרט (pH6.0), טריטון X100, וH ₂ O ₂ מגיב זיהוי עובדפתרון (1: 2: 97 יחס של ₂ O ₂ פתרון מניות מגיב זיהוי 10mm H; 10 U / peroxidase חזרת מיליליטר; נתרן ציטרט 50mm (pH 6.0)). הכן DCFH-DA בריכוז סופי של 100μM בתקשורת מתאימה.
   הערה: מגיב DCFH-DA לתאי PC12 הוא בתקשורת RPMI, מגיב DCFH-DA לתאי rMC1 הוא בתקשורת DMEM. שים לב שיש לי ריאגנטים זיהוי זמינים מסחרי רגישויות ההפרש לROS הספציפי ויש לבחור ריאגנטים בקפידה כדי לספק את המידע מבוקש עבור יישום בודד.
2. לנהל טיפול באור לתאים, כמתואר בשלב 4.1-4.1.2. מטופלים להבטיח את התאים עם fluences / אורכי הגל הרצויים של אור.
3. מייד לאחר טיפול באור, להסיר את המדיה המכיל גלוטמט ולשטוף פעמיים עם פתרון חיץ מתאים (לתאי PC12, PBS משמש ולתאי rMC1, HBSS משמש). לבצע את מבחני ROS בתאים באופן הבא:
   1. H ₂ O ₂ assay: להוסיף 45 μl של חיץ 50mm ציטרט (pH 6.0) ו -5 μl טריטון X100 לכל אחד מהבארות. נער בעדינות את התאים בייקר מסלולית למשך 30 שניות ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ במשך 15 דקות. הוסף 50 μl של H ₂ O ₂ פתרון עובד איתור ודגירה של 30 דקות ב RT. למדוד הקרינה באמצעות קורא צלחת עם גל עירור של 530nm ואורך גל פליטה של ​​480nm.
   2. assay DCF: להוסיף משל DCFH-DA הפתרון 100 מיקרומטר לכל אחד מהבארות 100 μl ו דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2. הסר את המדיה המכילה 100 מיקרומטר DCFH-DA ולשטוף עם פתרון חיץ מתאים (כמתואר לעיל) פעמיים. להוסיף 90 μl של פתרון חיץ ו -10 μl טריטון X100 לכל אחד מהבארות ובעדינות לנער על שייקר מסלולית למשך 30 שניות לפני 15 דקות דגירה על 37 מעלות צלזיוס. למדוד הקרינה נגזרה DCF באמצעות קורא צלחת עם גל עירור של 480nm וwavel פליטהength של 530nm.
   3. Express ROS ערכים ביחס לריכוז החלבון של תאים שנותרו בבארות, באמצעות ערכת colorimetric לכמת ריכוז חלבון על פי הוראות יצרן, תוך התייחסות לעקומה סטנדרטית לחישוב חלבון מ"ג.

תוצאות

הפלט של אור נמסר באורך גל של 670nm כויל באמצעות מסנני צפיפות ניטראליים כדי להקרין תאים עם מגוון רחב של fluences מקיף מינון של 670nm אור הראה בעבר להיות מועיל in vivo (0.3 J / cm ^{2) 20.} ככל שמספר מסנני צפיפות ניטראליים מול מקור האור גדל, עוצמת (W / m ²⁾ ירד, מה שמאפשר פחות אור ל...

Discussion

יש לנו להתאים בהצלחה מערכת אספקת האור מדויקת ומכוילת לספק מנגנון למחקר של אופטימיזציה של R / NIR-LT במבחנה. פרמטרים אורך גל ועוצמת R / NIR-LT מסוגלים לטפל בצורה מדויקת ויעיל באמצעות מערכת זו. אנחנו קבענו כי טיפול באור של התאים לא הובילו למוות של תאים, אם כי ROS לא הוקטן באו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
OxiSelect Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence)	Cell Biolabs	STA-342
Amplex UltraRed Reagent	Molecular Probes	A36006
300 Watt Xenon Arc Lamp	Newport Corporation	6258	Very intense light source, do not look directly into the lamp. Ensure there is sufficient cooling to the lamp whilst it is switched on
USB4000-FL Fluorescence Spectrometer	Ocean Optics
CC-3-UV Cosine Corrector for Emission Collection	Ocean Optics
200μm diameter quartz fibre optic	Ocean Optics
SpectraSuite Spectroscopy Platform	Ocean Optics
2300 EnSpire Multimode Plate Reader	Perkin Elmer
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1	Acute toxicity, wear gloves when handling.
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	142-47-2 (anhydrous)
Pheochromocytoma rat adrenal medulla (PC12) cells	American Type Culture Collection	CRL-2522
Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Media	Gibco	11875-119
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin	Gibco	10082-147	Warm to 37 °C in water bath before use
Horse Serum, New Zealand origin	Gibco	16050-122	Warm to 37 °C in water bath before use
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050-061	Warm to 37 °C in water bath before use
100 mM Sodium Pyruvate	Gibco	11360-070	Warm to 37 °C in water bath before use
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122	Warm to 37 °C in water bath before use
100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140-050	Warm to 37 °C in water bath before use
Retinal Muller (rMC1) cells	University of California, San Diego
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965-118	Warm to 37 °C in water bath before use
75 cm2 Flasks	BD Biosciences	B4-BE-353136
Poly-L-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	25988-63-0	Aliquot and store at -20 °C
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14025-134	Warm to 37 °C in water bath before use
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	10010-049	Warm to 37 °C in water bath before use
Laminin Mouse Protein, Natural	Gibco	23017-015	Aliquot and store at -20 °C
1X Neurobasal Medium	Gibco	21103-049	Warm to 37 °C in water bath before use
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250-061
165U Papain	Worthington
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	W326305
Corning 96 well plates, clear bottom, black	Corning	CLS3603-48EA
Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates Untreated; Well shape: Round; Sterile.	Costar	07-200-103
Seesaw Rocker	Standard lab epuipment
Centrifuge	Standard lab epuipment
Neutral Density Filter Paper (0.3)	THORLABS
442 nm Bandpass Filter	THORLABS	FL441.6-10
550 nm Bandpass Filter	THORLABS	FB550-10
670 nm Bandpass Filter	THORLABS	FB670-10
810 nm Bandpass Filter	THORLABS	FB810-10e
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.1)	THORLABS	NE01B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.2)	THORLABS	NE02B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.3)	THORLABS	NE03B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.5)	THORLABS	NE05B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.6)	THORLABS	NE06B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (1.0)	THORLABS	NE10B