נתיחה והתקנה<em&gt; דרוזופילה</em&gt; גלמי דיסקי העין

Summary

The goal of this technique is to enable researchers to perform dissection, immunostaining and mounting of pupal eye discs from Drosophila melanogaster of any age.

Abstract

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes. It contains approximately 800 separate eye units, termed ommatidia¹. Each ommatidium contains eight neuronal photoreceptors that develop from undifferentiated cells following the passage of the morphogenetic furrow in the third larval instar². Following the sequential differentiation of the photoreceptors, non-neuronal cells develop, including cone and pigment cells, along with mechanosensory bristle cells³. Final differentiation processes, including the structured arrangement of all the ommatidial cell types, programmed cell death of undifferentiated cell types and rhodopsin expression, occurs through the pupal phase^4-7. This technique focuses on manipulating the pupal eye disc, providing insight and instruction on how to dissect the eye disc during the pupal phase, which is inherently more difficult to perform than the commonly dissected third instar eye disc. This technique also provides details on immunostaining to allow the visualization of various proteins and other cell components.

Introduction

תחומי ביולוגיה התפתחותית ותא כבר הושפע רב מאורגניזם המודל: דרוזופילה melanogaster. בתוך מודל זה, מחקרים של דיסק העין תרמו רב איתות ידע הנוגע ל, ביולוגיה של תא ובאזורים אחרים. דיסק הזחל השלישי מאוחר עין instar נחקר בהרחבה והוא מודל רב עוצמה לנצל, כפי שהוא נותן תמונת מצב של סדרה של תקופות התפתחותיות, כל אחד עם המולקולות שלו האיתות ייחודית ותהליכים, כמו תלם המוךפו"גנטי מתקדם פני דיסק העין ^8. עם זאת, יש צורך להרחיב עוד יותר את ההבנה של תהליכים התפתחותיים שלנו לשלב גלמים של פיתוח. אמנם היו מחקרים על דיסק עין גלמי ^3-7, הידע שלנו לא מתקרב לרוחבה של עבודה שבוצעה על דיסק עין instar השלישי. זאת בשל, בחלקו, לקושי הגדול יותר בלנתח את דיסק עין גלמים. לכן, הצגתשיטה נכונה של נתיחה יכולה להרחיב מאוד את המחקר בתחום זה.

אמנם יש שלבים בהתפתחות דיסק עין גלמים שבקלות גזורים, במיוחד סביב תקופת אמצע גלמים-, תקופות זמן אחרות הן הרבה יותר מאתגר לנתח. פרוטוקול זה מייצג שיטה אחת ללנתח דיסקי עין גלמים שניתן להשתמש בי אוניברסלי לכל מסגרות הזמן התפתחותי גלמים. פרוטוקול זה יכול לשמש כתחליף לעוד פרוטוקול ⁹ שמראה שיטה קלה ומהירה יותר לנתח דיסקי עין מנקודות זמן midpupal. פרוטוקול זה צולם במקור ופיתח להכשרת סטודנטים לתואר ראשון מתקדמים באוניברסיטת UCLA לתואר ראשון קונסורציום המחקר בגנומיקה פונקציונלית (URCFG) ^10,11 בטכניקה של נתיחת עין גלמים. סטודנטים לתואר ראשון רבים היו מסוגלים לנצל את וידאו ובשיטה זו כדי ללמוד את הטכניקה מאתגרת זו.

Protocol

הליך זה הוא הליך 2 יום.

יום 1 (שעה 2 + לנתח זמן)

Dissection 1. גלמי עין הדיסק

1. בחר גולם לנתיחה.
   הערה: גיל הגולם להיות גזורים תיקבע על ידי צרכי הניסיוניים. עם זאת, אם בוחן את המורפולוגיה של תאים, זה נעשה לעתים קרובות על 42 שעות לאחר היווצרות הגולם (APF) של 25 מעלות צלזיוס, שהוא הגיל של הגלמים ניתן לראות בסרטון. אסוף לבנים גלמים (APF 0 שעה הנחשבת) עם מכחול רטוב ולסדר אותם בסדר כרונולוגי (המבוסס על זמן איסוף) בבקבוקון אוכל לטוס חדש נשמר על 25 מעלות צלזיוס. לנתח את הגלמים המיושנים באותו סדר כרונולוגי זה כדי לשמור על פרש הזמן בין שני גלמים קרובים ככל האפשר.
2. העבר את הגולם לירידה של פוספט שנאגרו מלוח (PBS, pH 7.4, לראות חומרים למתכון) על צלחת לנתח סיליקון.
3. החזק את החלק העליון של המקרה גלמי עם מלקחיים ופירס ולפתוח את lחלק ower של המקרה גלמי עם זוג מלקחיים חדים. הסר את הגולם מהמקרה לחור שהוקם זה עתה.
4. לעשות חתך אלכסוני במספריים, באמצע בית חזה-, בגולם. הסר את הפסולת או להעביר את ראש הגולם לירידה חדשה של PBS. נקה באמצעות צינור מפוח פיפטה (ראה חומרים ואיור 1 לפרטים נוספים) ולהוסיף PBS נוסף בהתאם לצורך. ודא כדי למנוע התייבשות.
5. אחיזה מאובטחת העליון של ציפורן ראש גלמים עם זוג המלקחיים. באמצעות הקצה של מפוח הצינור, דחף בעדינות על המקרה גלמי כדי למתוח את המוח וברקמות אחרות, כוללים דיסקי העין, מתוך המקרה גלמי. הקפד להימנע תופס את כל רקמה בתוך הציפורן.
6. השימוש במפוח הצינור מלא PBS, בעדינות לפוצץ את רקמת שומן בגוף ופסולת אחרת ממקרה הראש להפריד באופן ברור ולזהות דיסקי המוח ועיניים.
   הערה: שמירה על המוח המצורף במקרה ראש גלמים תאפשר לחוקר להשתמשמקרה מודעה כ" ידית "למניפולצית עתיד של הרקמה מבלי לפגוע בדיסקי עין או במוח. עם זאת, זה נפוץ כדי לסלק את דיסקי המוח והעין ממקרה הראש וזה לא פוגע בהליך והתוצאות הכוללים. זה לוקח בדרך כלל ניסיונות מרובים של פיצוץ ודוחף להצלחה לחלץ את דיסקי העין ומוח מבפנים מקרה ראש גלמים וכך שהם באופן ברור, בנפרד מרקמה הסובבת. נקי יותר ויותר נפרד אחד יכולים לקבל דיסקי עין מן הרקמה הסובבת יסייעו למנוע רקמות זרות מתיקון לדיסקי עין.
7. בעקבות נתיחה, להעביר באופן מיידי את הרקמה לצלחת זכוכית 3 גם על קרח עם 0.5 מיליליטר של תמיסת תקן (ראה חומרים). לצוף הרקמה על פני השטח של פתרון תקן לכמה דקות (בדרך כלל הזמן שלוקח לנתח את הסדרה הבאה של דיסקי העין).
   הערה: אם זה לא דיסק העין הראשון להיות גזור בסיבוב הנתיחה, completel זהy להטביע את דיסק העין הקודם לפתרון תקן. אם ביצוע נהלים מיוחדים צביעה (לדוגמא, מיני חמצן תגובתי, lysosomes, וכו ') זה חייב להיעשות לפני הקיבוע. כדי לעשות זאת, לאחסן את תקליטורי עין גזורים בPBS קר כקרח לפני המשך הפרוטוקול מכתים המתאים.
8. בעקבות נתיחה והטמעה של כל דיסקי העין עוברת ניתוחים, להעביר את צלחת זכוכית 3 גם לנדנדה ורוק בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות.

2. Immunostaining

1. מוציא בזהירות את פתרון התיקון ומוסיף 0.5 מיליליטר של PBS עם 0.3% Triton X-100 (PBT 0.3%, לראות חומרים) ולשטוף את הרקמה על כיסא נדנדה במשך 10 דקות. חזור על פעולה זו שלוש פעמים נוספות עבור הסכום כולל של 4 שטיפות (10 דקות כל אחד).
   הערה: הסרה זהירה של הפתרון מהבאר ניתן לבצע תחת מיקרוסקופ לנתח כדי למנוע נזק לרקמות או הפסד. הפתרון יכול להישאף בזהירות עם pipet; אנחנו מעדיפים עדין tippeד, pipet העברה חד פעמי כי יש לו הפתיחה השטוחה כדי להקטין את הסיכוי של aspirating רקמה.
2. בסופו של השטיפה 4, להסיר את לשטוף ולהוסיף 0.5 מיליליטר פתרון לחסום (ראה חומרים) ולדגירה במשך 30 דקות.
   הערה: מסגרת זמן זו ניתנת להארכה בהתאם לצרכים שלך.
3. בסופו של זמן חסימת 30 דקות, pipet 10 μl של ראשי נוגדני פתרון (בדילול מלא פתרון בלוק) למספר המתאים של בארות בצלחת microwell.
   הערה: גם אחד מצלחת microwell יהיה להכיל כ 4 זוגות של דיסקי עין מצורפים במקרה גלמים או 8 זוגות בודדים של דיסקי עין עם המוח המצורף. הנוגדנים העיקריים בשימוש בפרוטוקול זה לנתונים הנציג הם אנטי-phosphotyrosine (1: 500 דילול) ואנטי-Cut (1: 200 דילול).
4. העברת הרקמה גזור לתוך בארות צלחת microwell מלאות היסודי נוגדני הפתרון מצלחת זכוכית 3 גם.
5. מקוםצלחת microwell על מגבת נייר רטובה (כדי למנוע התייבשות) בתיבת pipet הריק קצה (או מיכל דומה אחר) ולאחסן ב 4 ° C למשך הלילה.

יום 2 (4 שעות + ההרכבה זמן)

6. העברת הרקמה מצלחת microwell לצלחת זכוכית 3 גם חדשה עם 0.3% PBT (≈0.5 מיליליטר) ולשטוף את הרקמות של 10 דקות על הנדנדה. חזור על פעולה זו שלוש פעמים נוספות עבור הסכום כולל של 4 שטיפות (10 דקות כל אחד)
7. הסר את השטיפה האחרונה ומוסיף 0.5 מיליליטר של תמיסת הבלוק לבאר. לחסום למשך 30 דקות.
   הערה: מסגרת זמן זו ניתנת להארכה בהתאם לצרכים שלך.
8. הסר את פתרון החסימה ולהוסיף 0.5 מיליליטר של משני נוגדני הפתרון (עשוי מנוגדנים שכותרתו fluorescently מתאימים לנוגדן העיקרי שלך ואורך גל ניאון, בדילול מלא בפתרון בלוק) לטוב ולהגן על צלחת זכוכית 3 גם מהאור עם כיסוי או אלומיניום לסכל ודגירה של לפחות 2 שעות בחדרטמפרטורה.
   הערה: כל הצעדים הבאים צריכים להיות מוגנים באופן דומה מחשיפה לאור. דגירה זה יכול להתארך עד הלילה ב 4 ° C, בהתקנה דומה לדגירת הנוגדן הראשונית, אך הוא גם יכול להתבצע בכלי זכוכית 3 גם מכוסים בסרט מעבדה, או צלחת microwell אם שימור נוגדן הוא רצוי.
9. בסוף הדגירה הנוגדנים, להסיר משני נוגדני הפתרון ולהוסיף 0.5 מיליליטר של PBT 0.3% לטובים ולשטוף בנדנדה במשך 10 דקות. חזור על שלב זה עבור הסכום כולל של 4 שטיפות (10 דקות כל אחד).
   הערה: אם מכתים DAPI הוא רצוי, לפני שמתחילים לשטוף הראשון, להוסיף 0.5 μl של פתרון מניות DAPI (ראה חומרים) ל-500 μl של PBT שישמש להדחה הראשונה (1: 1,000 דילול).

3. הרכבה

1. בסופו של השטיפה האחרונה, הר דיסקי מחושים / עין על שקופית באמצעות גליצרול 70% או PBS כמדיום כדי להסיר את brעין וברקמות לא רצויות אחרות בבריכה בצד אחד של השקופיות.
2. בזהירות להזיז את הרקמות באמצעות לחץ ההידרוסטטי בין המלקחיים, או בעדינות עם קצה מלקחיים, ושורת דיסקי עין בטור לכיוון המרכז של השקופית.
3. הסר את כל גליצרול הזר או PBS מכל רחבי הרקמה (באמצעות פעולת הפתילה של מעבדה נגבתה או המלקחיים לעבוד על זה).
4. מניחים כמות קטנה (≈10 μl) של מדיום גובר בצד אחד של טור דיסק העין ובמקום coverslip על הרקמה על מנת להפיץ את המדיום גובר על דיסקי עין.
5. בואו לשבת שקופיות 1 עד 2 דקות כדי לאפשר לרקמות / ההרכבה בינונית להתפשט לחלוטין.
6. נגב כל מדיום הרכבה נוסף מן מסביב לקצוות של coverslip ולאטום אותו עם לק ברור.
7. צלם תמונות ניאון של דיסקי העין באמצעות מיקרוסקופ confocal.

תוצאות

כדוגמא לשימוש בפרוטוקול זה, תוצאות ממחישות midpupal (42 שעות APF של 25 מעלות צלזיוס) דיסקי עין immunostained עם נוגדנים שונים מוצגים באיור 2. על ידי שימוש בנוגדן מכוון נגד שאריות phosphotyrosine, הקרום של התאים יכול להיות (איור 2 א) שנצפה. זה יכול לשמש כדי לזהות את ההסדר הקבוע של תאי o...

Discussion

While it appears that the process is simple and easy to perform, in reality, this technique requires a great deal of practice to master. Routinely, we start students off by learning to dissect and mount third instar eye discs¹², which are much easier to work with. This practice helps to develop an appropriate dissection position of the arms, hands and fingers¹³ so that manipulation of the forceps under the dissecting microscope is stable, easy and experienced. In essence, the practice period shou...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.4)			80 g NaCl, 2g  KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4, Bring volume to 1 μl, adjust the pH to 7.4, autoclave or filter sterilize, dilute to 1x PBS with autoclaved ddH2O before using.
Triton X-100	Promega	H5142	Caution: Irritant! Wear gloves.
0.3% PBT			1.5 ml of Triton X-100, 500 ml 1X PBS.
37% formaldehyde solution	Fisher Scientific	F75P1GAL	Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves.
Fix Solution			(≈4% Formaldehyde in PBS) 50 μl of 37% Formaldehyde, 450 μl 1x PBS, make fresh before use
Normal goat serum	Rockland antibodies & assays	B304	Aliquot in 1 ml volumes and store at -80 °C
Block Solution			10% NGS in PBT.  This can be made and stored at 4 °C for a few days prior to use.
DAPI stock solution	Life Technologies	D3571	For coutnerstaining nuclei. Prepare a 1 mg/ml solution with ddH2O.
VectaShield Mounting Medium	Vector Labs	H-1000	Mounting medium
Glycerol	Sigma	G5516	For mounting. Prepare 70% dilution with ddH2O.
Equipment
Nutating mixer	VWR	82007-202	Used to rock tissue in 3 well glass dish
SylGard 182 Silicone Elastomer Kit	Krayden	NC9897184	Used to make silicone dissection dish
Silicone dissecting dish			Mix Sylgard elastomer kit (above) according to directions gently (to avoid bubbles). Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37 °C incubator.
3 well glass dish	Corning	7220-85	The 3 well variety of these are no longer available, this is the 9 well product.
72 well microwell minitray	Nunc	438733
Sharp forceps (Dumont #55)	Fine Science Tools	11255-20
Vannas-type Micro Scissors, Straight, 5mm blade	Ted Pella	1346
100 mm Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments	1B100-4	Pull with needle puller to make fine point tip that allows a small stream of PBS to flow.
Disposable Transfer Pipets, Fine Tip	Samco Scientific	231
Tubing dimensions given are inner diameter (ID) x outer diameter (OD) x wall thickness in inches
PVC tubing (1/8 x 3/16 x 1/32)	Nalgene	8000-0010	Use these with pulled needle to assemble the blower tube as shown in Figure 2.
Tygon Silicone tubing (3/32 x 5/32 x 1/32)	Saint Gobain Performance Plastics	ABW00004
Tygon Silicone tubing (1/32 x 3/32 x 1/32)	Saint Gobain Performance Plastics	ABW00001