פרספקטיבה טכנית במחקר העץ-טבעת מודרנית - כיצד להתגבר על Dendroecological ואתגרי אנטומי עץ

Summary

Here we present a protocol outlining how to sample wooden specimens for the overall assessment of their growth structures. Macro- and microscopic preparation and visualization techniques necessary to generate well-replicated and highly resolved wood anatomical and dendroecological dataset, are described are described.

Abstract

מחקר Dendroecological משתמש במידע המאוחסן בטבעות עץ להבין איך עצים בודדים ואפילו מערכות אקולוגיות יער כולו הגיבו לשינויים סביבתיים ולבסוף לשחזר שינויים כאלה. הדבר נעשה על ידי ניתוח וריאציות צמיחה אחורה בזמן ומקשרים פרמטרים מפעל ספציפי שונים לרשומות (לדוגמא) בטמפרטורה. שילוב פרמטרים אנטומיים עץ בניתוחים אלו יחזקו שחזורים, אפילו עד להחלטת הפנים-שנתית. לפיכך, אנו מציגים פרוטוקול על איך לטעום, להכין, ולנתח דגימה מעץ לניתוחים מקרוסקופית משותפים, אלא גם עבור ניתוחים מיקרוסקופיים שלאחר מכן. יתר על כן אנחנו מציגים פתרון אפשרי לניתוח תמונות דיגיטליות שנוצרו מדגימות קטנות וגדולות משותפות לתמיכה בזמן סדרת ניתוחים. הפרוטוקול מציג את השלבים הבסיסיים כפי שהם כיום ניתן להשתמש. מעבר לכך, יש צורך מתמשך לשיפור טכניקות קיימות, ופיתוח של t החדשechniques, להקליט ולכמת תהליכים סביבתיים בעבר ובמתמשך. מחקר אנטומי עץ מסורתי צריך להיות מורחב כדי לכלול מידע אקולוגי לתחום זה של מחקר. זה יתמוך Dendro-מדענים שמתכוונים לנתח פרמטרים חדשים ולפתח שיטות חדשות כדי להבין את ההשפעות לטווח קצרות וארוכות של גורמים סביבתיים ספציפיים על האנטומיה של צמחים עציים.

Introduction

עצים, כמו גם שיחים, שיחים ננסיים, ואפילו עשבי תיבול, להראות דפוסי תגובת סעפת קשורים לשינויים בסביבה שלהם. דפוסים אלה היו כפופים לבוטניקה ופיזיולוגיה של צמח מאז אמצע המאה ^ה 19. אז, מחקר על צמחים עציים התמקד בעיקר בעצים וניתוח תיאורים של המבנה והשונה של טבעות שנתיות בהקשר אקולוגי ^1. כאשר אנדרו Ellicott דאגלס המציא את טכניקת היכרויות הצולבות לעץ-טבעת מחקר ^2, הקשר אקולוגי זה היה פחות או יותר דוכא על ידי היכולת החדשה לתאריך מדויק ממצאי עץ בארכיאולוגיה. צלב-היכרויות בפעם הראשונה אפשרו התארוך מדויק של טבעות עץ לשנה קלנדרית ועד עכשיו נחשבות כעמוד השדרה של מחקר עץ-טבעת בכל תחומי יישומה ^1.

במקביל, מאז סוף המאה ה -19, האנטומיה העץ התפתחה לדיסציפלינה מחקרית חשובה להתייחסד לתחומים רבים אחרים של מדעי טבע והוחלו ^3. שני תחומים עיקריים שהוקמו: אנטומיה השיטתית עץ, אשר מהווה את הבסיס לזיהוי עץ בארכיאולוגיה ^4, ואת האנטומיה העץ מיושמת, הקשורים לטכנולוגית עץ, פיזיולוגיה, פתולוגיה, ואקולוגיה ^3.5.

במחקר עץ-טבעת, dendroecology כיום מוגדר כנושא הכולל מחקרי עץ-טבעת קשורה מתמקדים במחקרים סביבתיים כגון תהליכי geomorphic (dendrogeomorphology), טמפרטורה ושחזורי ממטרים (dendroclimatology), שינויי מפלס מים (dendrohydrology) או אפילו תנודות קרחון ( dendroglaciology) ^6. כהגדרה זו מציינת, ניתוחי עץ-טבעת הפכו חשובים יותר ויותר בתחום היכרויות ושחזור תהליכים סביבתיים כגון (i) תנאי אקלים בעבר על ידי ניתוח שינויים שנתי בטבעת-רוחב ^7,8, עץ צפיפות ⁹ או ¹⁰ איזוטופים, או (Ii) tהוא להשנות מרווחים של תהליכי geomorphic ^11. מחקרים מפורטים מאוד על אלה וריאציות טבעת רוחב והתוכן האיזוטופי שלהם להפגין את הצורך לנתח טבעות בפירוט רב יותר, כלומר, כדי ללמוד את המבנה האנטומי של הטבעות. עם זאת, מחקרים מפורטים של תכונות אנטומיים עץ בתוך הטבעות השנתיות הקשורים לשינויים סביבתיים הם נדירים ^12,13. למרות שידועות בתכונות המיקרוסקופיות אלה ^14, יש להם רק לעתים נדירות יושמו ברמה מיקרוסקופית למחקר dendroecological. יתר על כן, התזמון מדויק של תגובות צמיחה אלה בעצים גדלו באופן טבעי, חיוניים למטרות היכרויות מדויקות, כמעט ולא תעד לאחרונה ^15.

לגבי ההשפעות של התחממות כדור הארץ ^16, השיפור של קיים ופיתוח של טכניקות חדשות כדי להקליט ולכמת תהליכים סביבתיים בעבר ובמתמשך נדרש, במיוחד במונחים של מחקר השפעת האקלים ^11.על ידי הרחבת מחקר אנטומי עץ מסורתי לאנטומיה עץ מבוסס מבחינה אקולוגית ^17, Dendro-מדענים יכולים לנתח פרמטרים חדשים ולפתח שיטות חדשות כדי להבין את ההשפעות קצרות טווח וארוך טווח של גורמים סביבתיים ספציפיים על האנטומיה של צמחים עציים ^18. ידע מפורט על שינויים בפרמטרים שונים בתוך תא טבעות בודדות הקשורים לנהגים מסוימים (לדוגמא, כוחות מכאניים, וריאציות אקלים) הוא הדרישה הבסיסית להבנה השונות בהיווצרות טבעת עץ. בהשוואה למדידות טבעת-רוחב נפוצה, זיהוי וריאציות אנטומיים עץ דורש טכניקות הכנה מורכבות יותר ורחבה שדורשות הרבה עבודה וזמן. נהלים מפורטים של חיתוך מדגם, צביעה, והטבעה הם מגוונים והם תמיד תלויים במטרה של המחקר ^19.

לניתוח מקרוסקופית של רוחב טבעת בעצי מחט או מבנים אפילו למספר, גודל או distribution כלי מעץ קשה ב, את פני השטח של מדגם נפוץ מלוטש באמצעות נייר מחוספס קנס או מכונות ליטוש מיוחד ^20. חסרון של שיטה זו הוא במילוי של התאים הבודדים עם אבק שמונע ניתוח מיקרוסקופי חצי אוטומטי נוסף ^21. התוצאות הטובות ביותר עבור הכנת מדגם מקרוסקופית מושגות כאשר פני השטח מדגם נחתכים באמצעות סכין גילוח או אחר סכין חד.

ואילו עבור מדגמים קטנים, סכיני גילוח הם כלי מושלם; דגימות גדולות יותר כליבות דורשות החיתוך של משטחי מטוס על פני כל ליבות המידה. בניגוד למלטש, התאים אינם מלאים באבק, המאפשר הכנה נוספת לניתוח תמונה רצוף. יתר על כן, לומן הפתוח התא, קירות התא לחתוך כראוי, ועל פני השטח המטוס מכלל המדגם לאפשר היישום של צפיפות בתדירות גבוהה ²² לכל ליבת המידה. לתמונת ניתוחים, את פני השטח של דגימות (תאקירות) יכולים להיות מוכתמים באמצעות דיו כהה ולאחר מכן ניתן יהיה לבצע את לומן התא הפתוח עם גיר לבן על מנת לשפר את הניגוד שבין דופן התא ואזור הלום ^19,23. טכניקה פשוטה למדי זה מאפשרת הערכה מקרוסקופית בסיסית של מבני תא גדולים יותר למדידות גודל כלי דם.

טכניקות אלה לחיתוך משטחי מטוס מספיקות לניתוחים מקרוסקופיים. לאנטומיים עץ מפורט ניתוח (כלומר, מיקרוסקופי), מיקרוסקופ אור מועברת היא השיטה הנפוצה ביותר שיושמה במדעי Dendro. תאי עצה להבחין בתהליכים מורכבים הכוללים קביעת סוג התא, חלוקת תא, התמיינות תאים, ולתכנת תאי מוות ^24. מאז התזמון והקצב שבו תהליכים אלה מתרחשים לקבוע מאפיינים אנטומיים תא, תנאים סביבתיים המשפיעים על תהליכים אלה יכולים ליצור סטיות אנטומיים במבנה הטבעת. כתנאי חשוב לאלה לנתחים, קטעי מיקרו צריך להיות מוכנים עם ¹⁹ microtome. בעת הכנת דגימות עבור חתך, את הנראות של כיוון tracheid או סיבים היא קריטיות. השימוש ביד מונעת החלקת microtomes מומלץ לחתוך קטעי מיקרו כי טכניקה זו מאפשרת חלקים באיכות גבוהה בהתאם לצורך לתמונה מנתח ^19. בהתאם למטרה הספציפית של מחקר מסוים, קטעי מיקרו נחתכים בניצב או מקביל במידת האורך של התאים. אז סעיפים אלה מצולמים מתחת למיקרוסקופ וממדים תא נמדדו באמצעות תמונה מיוחדת מנתחים תוכנה.

עד לאחרונה, את היכולת להכין קטעי מיקרו הוגבלה לגודל מדגם קטן (כ 1 סנטימטר x 1 סנטימטר) בלבד. זה מקובל לנתח אירועים בודדים כמו הפרעות בשנים מסוימות, אבל טכניקה זו אינה מאפשרת ניתוח סדרת הזמן הממושך הנדרש לשחזורים סביבתיים. מאמץ זה יכול להיות רק להביןד באמצעות הפיתוח של נהלי הכנה חדשים, יעילים וכלכליים ושיטות אנליטיות. בשנים האחרונות, אנשי המעבדה עץ-הטבעת בWSL מכון המחקר השוויצרי הפדרלי בשוויץ החלו עבודה אינטנסיבית בנושא זה. כתוצאה מכך, מכשירים חדשים וטכניקות ניתוח פותחו כדי לתמוך ברעיון של שילוב תכונות אנטומיים עץ למגוון רחב של נושאי מחקר סביבתיים.

Protocol

1. טכניקות דגימה

1. דגימת Core
   1. לעץ דגימה נובע, לחלץ לפחות שתי ליבות באמצעות corer תוספת מכל הגזע לנתח פיתוח הצמיחה שלה. לשנות את המיקום של דגימה על עצם את משימת המחקר, למשל, לשחזורי אקלים נפוצים לקחת מקבילי ליבות למדרון. כאשר עובד עם מינים טרופיים, תיקח לפחות שלוש או יותר ליבות.
   2. השתמש corer חידד תוספת (5, 10 או 12 מ"מ קוטר) ולמקם את corer ניצב לציר הגובר של הגזע.
      הערה: כדי להיות עמדה מבוקרת ויציבה של corer, להשתמש דחפן, כדי למנוע תנועות של corer האחר מאשר הסיבוב שלה, כאשר קידוח אותו לעץ. נשא לגזע כל הדרך אליה ובאמצעות השעם. לעץ ליבה צפוף מאוד (כלומר, מינים טרופיים), משתמש בגוף המנסרים מחדש מיוחד עם מתאם של ליבות תוספת שתאפשרנה לאף יער צפוף ליבה כebenum Diospyrus (אבוני).
   3. השתמש חולץ ולהסיר את הליבה וכתוצאה מהעץ. לכבות את corer ולהסיר אותו מהגזע.
   4. הוסף ID ספציפי לליבת חילוץ באמצעות עיפרון רך על ידי כתיבה על קלטת, אשר לאחר מכן ממוקמת ישירות על הליבה. חזור על התהליך בצד השני של הגזע.
   5. אחסן שתי דוגמאות של העץ בצינורות פלסטיק או נייר או תיבות מיוחדות כדי למנוע כל נזק.
      הערה: קשיות נייר מועילות במיוחד בסביבות טרופיות, כי הם מונעים מליבות דפוס.
   6. לבסוף, הר הליבות (כיוון סיבים זקופים) על קורות תמיכה מעץ. השתמש בדבק עץ עמיד במים קרים ולתת להם להתייבש.
      הערה: לעולם אל הר הליבות על תומך עץ אם מטרת המחקר כוללת כימית נוסף, איזוטופ או ניתוח צפיפות. למטרות אלה, לתקן את הליבות בתעלות כבלים פתוחות או קרטון גלי פנים בודדים.
2. דגימת מיקרו-ליבה
   1. השתמש במכשיר ניקוב מיוחדאו מחט עם פתיחה של 2 מ"מ. בהתאם לעובי הקליפה להשתמש אזמל כדי להסיר חלק הכרחי של הקליפה.
   2. מניחים את המכשיר בניצב לציר גדל על הגזע כפי שתואר לעיל, ולהשתמש בפטיש כדי לחדור לעצה של הגזע לכ -2 סנטימטרים בעומק.
   3. הפעל את המחט כדי לשבור את ליבת מיקרו וכתוצאה מכך בתוך הכלי ולהסיר אותו מהגזע. אחסן את ליבות מיקרו בבקבוקוני microcentrifuge ולתייג אותם.
3. דגימת דיסק
   1. במקרים מיוחדים (ובמיוחד באזורים הטרופיים), למשל, כאשר דגימת גדמי עצים שנפלו ואו בכל הזדמנות אפשרית, לקחת דיסקים (חתכים בניצב לציר הגובר) עם מסור שרשרת. פשוט לתייג את הדיסקים ולאחסן אותם עד לניתוח נוסף.
      הערה: הליך דגימה זו מיושם לרוב לכל חומר יבש-מתים, היסטוריים, ארכאולוגיים ותת-מאובנים כמו גם מעץ קשה מאוד צפוף שאינו מאפשר השימוש בcorers תוספת.

הכנת 2. דוגמא

1. מלטש דיסקים
   1. הנח את הדיסקים במכונה ליטוש ולטחון את פני השטח תוך שימוש ברצף של המירוק עדין יותר ויותר, החל בנייר זכוכית של 80-חצץ, ואחריו 120, 220, 300-חצץ. ליטוש סופי עם 400-חצץ מספיק עבור רוב עצי מחט. לעץ קשה ומינים טרופיים במיוחד, שימוש מלטש גריסים עד 1,200 להבחין גבולות צמיחה-טבעת.
2. חיתוך משטחי מטוס על ליבות
   1. תקן את ליבות תוספת בבעל הליבה של microtome ליבה חדש שפותח מאפשר לחתוך משטחי מטוס על ליבות על כל המידה שלהם.
      הערה: תקן את הכיוון של הליבה בתוך המחזיק יש כיוון הסיבים של המדגם זקוף, שהוא בזווית ישרה לסכין של microtome.
   2. הרם את הליבה עד שמעט נוגע בלהב. משוך את הלהב, שהוא קבוע בהדרכת נושאות כדור מעל היקף הליבה למ"קt את חלקו ראשון של הראש.
   3. להדוף את הסכין מאחורי הליבה, להרים את בעל מדגם עם הליבה כ -10 מיקרומטר ולחזור על תהליך החיתוך. האם זה עד כשליש מהקוטר של הליבה הוא לקצץ כתוצאה מכך שטח מטוס רציף.
3. הכנת חלקי מיקרו על ידי הוספת פתרון עמילן תירס.
   1. לניתוח תמונה מפורט של המבנה האנטומי, לתקן ליבות או דוגמאות אחרות התפלגו מדיסקים בבעל microtome. מקם את להב microtome, מודרך על ידי הדרכת מיסב של microtome מזחלת חדש שפותח בקצה העליון של המדגם ולמשוך מעליו.
   2. להדוף את הלהב להרים את המדגם של כ 20 עד 30 מיקרומטר ולמשוך את הלהב על המדגם שוב. חזור על תהליך זה עד שמשטח רציף על גבי המדגם נוצר.
   3. מכסה את פני השטח וכתוצאה מכך עם פתרון קורנפלור (10 גרם של עמילן תירס, 8 מיליליטר של מים, ו- 7 גרם של glycero 100%l) עם מברשת נפוצה.
      הערה: הדגנים העמילן למלא את התאים הפתוחים של המדגם לייצב את המבנה לחיתוך הבא של החלקים הדקים.
   4. הרם את המדגם של 15 מיקרומטר, למקם את מברשת על פני השטח של המדגם ולמשוך את הלהב באיטיות לכיוון המדגם מתחיל לחתוך את קטע דק (מתחת למברשת). בעת גזירה, וכתוצאה מכך החלק מחליק על הלהב מונחה על ידי המברשת.
   5. כאשר כל הסעיף הוא לחתוך, להסיר את סעיף מיקרו מהלהב עם מברשת ומים (כדי להפחית את החיכוך) ולמקם את הסעיף בשקופית זכוכית להכנה נוספת. כדי למנוע מהם הייבוש, לכסות אותם תוך שימוש בכמות קטנה של גליצרול (33% = חלק אחד של גליצרול 100% ושני חלקים של מים).

3. הכנת Microslide

1. להכנת שקופיות קבועות הבא, לשטוף ראשון גליצרול מהסעיף מיקרו עם טפטפת ומים.
2. לכסות הרטוב section עם כמה טיפות של Safranin (1 גרם של אבקת Safranin מים + 100 מיליליטר) וAstrablue (0.5 גרם של אבקה הכחולה אסטרה + 2 מיליליטר של 100% חומצה אצטית מים + 100 מיליליטר) להבחין בין lignified ולא lignified מבנים, אלא גם כדי לשפר את הניגוד לניתוח תמונה שלאחר מכן.
3. תן את שאר סעיף 5 דקות מכוסות בצבע ולאחר מכן לשטוף אותו עם טפטפת ומים שוב.
4. ברגע שהצבע מוגזם מוסר, מייבשים את הסעיף עם טפטפות על ידי שטיפתם עם רצף של 75% בדילול מלא, 96% ולבסוף 100% אתנול.
5. טפטפות השימוש לשטוף את הדגימות בשקופית הזכוכית במקום להניח את הדגימות באמבטיה כדי לצמצם את זמן עיבוד לכשני עד 3 דקות לתהליך ההתייבשות כולו.
   הערה: התייבשות עם אתנול מונעת שבירות דגימות מהשבירה.
6. לאחר מכן לשטוף את הסעיף עם xylol 100%.
   הערה: קסילן הוא מסרטנת והאוורור הוא חובה במעבדה כאשר משתמשים בו. אחרמוצרים קיימים החלפת xylol, אבל אם יש כוונה לאחסן דגימות על פני תקופות זמן ארוכות יותר (שנים, עשרות שנים) לניתוח מחודש פוטנציאלי, אפרסמון קנדה (צעד 3.5.2) הוא מדיום ההטבעה היחידה שנשאר ברור מבלי לשנות צבע לאורך זמן. למרבה הצער לזם קנדה צריך להיות בשימוש בשילוב עם xylol.
7. כל עוד xylol הופך חלבי (לבנבן), לחזור על תהליך ההתייבשות כפי שהוא לא מספיק מיובש.
8. ברגע שxylol נשאר ברור, לכסות את הקטע עם ירידה של 100% בלזם קנדה ולכסות אותו עם מכסה זכוכית של לפחות בגודל של הסעיף.
   הערה: שים לב להסרת בועות אוויר בעדינות על ידי הלחיצה על מכסה הזכוכית למטה.
9. מניחים את שקופית מיקרו וכתוצאה מכך בין שתי רצועות פלסטיק עמיד בחום ולמקם אותו על צלחת מתכת. מניחים במשקל (למשל, מגנט) על גבי השקופית ללחץ כלפי מטה ולהשאיר את הסעיף שטוח במהלך תהליך הייבוש הבא.
10. מניחים את השקופיות בתנור בC ° 60 במשך כ -12 שעות. לאחר 12 שעות, לקחת את השקופיות מהתנור ומניח אותם על מדף לתת להם להתקרר לRT (כ -20 מעלות צלזיוס). כאשר קריר, להסיר את המשקל ואת פס הפלסטיק ולנקות את השקופית באמצעות סכיני גילוח כדי להסיר את לזם קנדה העודפת.

4. לדמיין תוכן סלולארי

1. הכן פתרון Nawashin ^25.
   1. הכן פתרון (א) עם 5 גרם של חומצה כרומית, 50 מיליליטר של 96% חומצה אצטית, ו-320 מיליליטר של מים ללא יונים. הכן פתרון אחר (B) עם 200 מיליליטר של פורמלין עם 175 מיליליטר של מים ללא יונים.
   2. מערבבים פתרון ופתרון B ביחס של 1: 1 כדי ליצור את פתרון Nawashin.
2. כדי להמחיש את תוכן התא, לתקן את המדגם עם פתרון Nawashin ללעצור 10 דקות כל תהליכי הפירוק בתוך התא.
   הערה: הקיבעון שומר גרעין תא ומאפשר להערכת תוחלת חיים של תאים (תאי אריכות הימים = גרעינים הנוכחיים / גרעינים נעדרו; o הנוכחותהיעדר r של הגרעין מציין אם התא חי או מת).
3. לאחר קיבוע, לשטוף את החלקים במים כדי להסיר את פתרון Nawashin באופן מלא לפני צביעתם עם כחול Safranin-אסטרה ולפני בנוסף מכתים אותם עם picric-אנילין הכחול (anilin מסיסים במים רוויים חלק 1 + 4 חלקים כחולים של 10% חומצת picric) .
4. זהירות לחמם את המדגם לכ -80 מעלות צלזיוס (בכל מקרה מתחת לנקודת רתיחה) כדי להאיץ את תהליך הצביעה. להתייבשות והטבעה של הדגימות לעקוב אחר פרוטוקול צעדים 3.4-3.8.

5. הכנת תמונות דיגיטליות של תכונות אנטומי

1. ליצור תמונות דיגיטליות של משטחי ליבה לניתוח כלי.
   1. חותך את מטוס משטח ליבה באמצעות microtome הליבה ולהכתים את פני השטח וכתוצאה שחורים פשוט על ידי שימוש סמן מורגשת.
   2. ברגע שהצבע התייבש, לשפשף את פני השטח של הליבה בגיר לבן. לחץ על הגיר בתאים פשוט על ידי שפשוף הגיר מעלעל פני השטח באמצעות אצבע. כמו כן להסיר את עודפי גיר על ידי הליך זה.
      הערה: כתוצאה מכך קירות התא שחורים וחלקי לומן של הספינות הם לבנים. הניגוד הזה הוא תנאי מוקדם לניתוח תמונה אוטומטית.
   3. הנח את הליבה מוכנה מתחת למיקרוסקופ דו עיני מצויד במצלמה דיגיטלית. קח רצף של מעט חופף (כ.) 10% תמונות מתחילות בצד אחד של הליבה עד שכל פני השטח הוא נתפס. לתפור את התמונות בודדות כדי ליצור תמונה של פני השטח הליבה מלאה.
2. ליצור תמונות דיגיטליות משקופיות מיקרו
   1. מניחים את שקופיות מיקרו ניקו מתחת למיקרוסקופ ולקחת חופפים תמונות מכל הסעיף.
   2. להגדיר הגדלה מסוימת בהתאם למבנים להיות מנותח, הנע בין 40X וגדלת 1,000X.
   3. לתפור את התמונות בודדות כדי ליצור תמונה אחת שלמה של הסעיף. כדי להימנע מעיוותים אפשריות בתהליך התפירה, להשתמש "; תכנית "ברווחים מסוג עדשות אובייקטיביות עם מיקרוסקופ.

6. תכונות כימות אנטומי

1. כדי לזהות תאים וגבולות טבעת באמצעות ROXAS18 כלי ניתוח תמונה או תוכנה דומה, לטעון תמונה של סעיף מיקרו וכיול מרחבי הקשורים להשגת תוצאות כמותיות ביחידות מטריות מלאה. לחשב את כיול מרחבי על ידי מדידת מספר הפיקסלים בין הקשקשים של תמונות שלב מיקרומטר נלקחו בהגדלה זהה וחלוקת השווי מתקבל על ידי ריווח ההיקף ביחידות מטריות (לדוגמא 1000 מיקרומטר).
2. בחר מתוך הרשימה (הניתנת בתוכנה) תצורה מתאימה לפני שמתחיל חלק האוטומטי של הניתוח.
   הערה: תצורה היא קבוצה מותאמת בעבר של הגדרות תכנית ש, למשל, לוקחת בחשבון את צבע ההכתמה של המדגם וטווח גודל ובצורה של התאים כדי להתגלות. תצורות מותאמות כךמאפשר לייצר תוצאות זיהוי אופטימליות למינים שונים ואיכויות תמונה.
   1. בחר אפשרויות נוספות כגון השימוש באזורים בתמונה שיש לכלול או לא לכלול להימנע, למשל, שוליים ריקים תמונה או סדקים במדגם, במידת צורך.
3. התחל הניתוח על ידי לחיצה על הכפתור Analyze. אם בחר, להגדיר אזורים בתמונה שיש לכלול או לא לכלול שימוש בכלי מצולע, מלבן או העיגול. הניתוח האוטומטי הבא משתמש באלגוריתמים גמישים כדי לתקן כמה ליקויי תמונה (למשל, לעומת זאת עני) ולשפר את ניגוד המבוסס על איכות התמונה.

תוצאות

כל ניתוחי dendroecological תלויים בדגימות מדויקות, לא משנה אם דיסקים, ליבות, או ליבות מיקרו נלקחות. לשם כך, המכשירים צריכים להיות בצורה מושלמת (חידדה בצורה מדויקת), כדי למנוע סדקי מיקרו בתוך מדגם העץ. בעת הכנת משטחים על ליבות תוספת, השימוש בmicrotome ליבה חיוני. היכולת יש תאים פתוחים, שיכול להיות מטופלים נוספים כדי לשפר בניגוד לתמונת בדיקות ומדידות גודל כלי (איור 1), היא צעד חשוב ראשון לקראת אימוצו של מבנים אנטומיים לזמן סדרת ניתוחים. לפעמים הצפיפות של מדגם פרקט מונעת את השימוש בmicrotome. במקרה זה ליטוש נכון וההסרה הבאה של נסורת מוגזמת מכלי עם מדחס או ואקום היא האפשרות הטובה ביותר.

לניתוח מפורט יותר של מבני תא קטנים יותר כמו earlywood וtracheids latewood בעצי מחט, קטעי מיקרו באיכות גבוהה יש צורך. כאן, potentiחפצי אל כגון קירות תא משניים שפשטו את קיר הצורך העיקרי שיש להימנע מן (איור 2). אם החפצים הללו מתרחשים בתמונות הדיגיטליות, ניתוח אוטומטי של ממדי התא הוא כבר לא אפשרי. החפצים אז צריכים להיות מתוקנים באופן ידני, וזה זמן רב, וברוב המקרים תוצאות במדידות לא נכונות של ממדי תא. היישום הפשוט של נוזל ללא הניוטונית, כלומר, פתרון עמילן תירס, לחלק העליון של המדגם תומך ביציבות המבנה, תוך צמצום ההתרחשות של חפצים למינימום (איור 2) ^26. יישום זה של עמילן תירס, מתאים לכל דגימות העץ כוללים מינים טרופיים, הופך את יישומו של נוהל ההטבעה על הדגימות לפני החיתוך מיותר.

קטעי מיקרו מאפשרים קביעה מאובטחת יותר של טבעות שנתיות. הדבר נכון במיוחד במקרה של עצי מחט גוברות על המגבלות טבעיות שלהם, כלומר </ Em>, בקו העצים באזורים אלפיניים גבוהים. מאוד טבעות צרות הן תכופות וקשים לזהות macroscopically (איור 3). במקרים קיצוניים, הטבעות מורכבות משורה אחת או שתיים מתאי earlywood ושורה אחת של תאי latewood שטוחים, אשר חסרים (בניגוד לתאי latewood נפוצים) קירות תא מעובה. לשם כך הם טובים יותר או אפילו גלויים רק בעת שימוש בחלקי מיקרו. יתר על כן, יכולות להיות מובחנות תנודות צפיפות מגבולות טבעת בצורה ברורה יותר, אשר מפשטת את זיהוי של טבעות שנתיות במיוחד בים התיכון והאזורים הטרופיים (איור 3).

בניתוח תמונות בהגדלה של 40X או גבוה יותר, תאים בודדים גלויים והעובי של קירות התא שלהם הוא גם לזיהוי. תוכנת ניתוח אוטומטית למחצה מאפשרת המדידה של פרמטרים ספציפיים לאורך שבילים מוגדרים הבאים לכיוון הפיתוח של הזמן ומרחב שלהם (איור 4). עם זאת, צ'אןGES של פרמטרים בודדים כגון לום התא או תא קיר עובי ניתן לקבוע מעל כל טבעת שנתית (איור 4) במידה. ניתן לעשות זאת לכל הטבעות הגלויות בתוך התמונה וזה תומך בצורך בניתוח סדרת הזמן ממושך באופן מלא.

גם ניתוחי תמונה ניתן להשתמש כדי לקבוע את השלבים ההתפתחותיים של טבעות שנתיות בתוך תקופת הצמחייה (איור 5). כאשר מנתח את דמותו של סעיף מוכתם בSafranin והכחול-אסטרה באמצעות אור מקוטב, אפילו בשלבים השונים של lignification, מתחיל בפינות החיצוניות של קירות התא עד lignification המלא של דופן התא המשני, להיות גלוי. סיבה לכך הוא קירות תא lignified (בוגרים) לזרוח באור מקוטב (איור 5). מידע מפורט יכול להיות קשור לנתונים סביבתיים המתועדים לתקופה הצמחייה המתאימה כדי לקבוע למשל relati אקלים צמיחה מפורט יותר onship.

איור 1. דוגמאות לסעיף מיקרו ומשטח מטוס מוכן של אלון כולל טבעת רוחב ומדידות גודל כלי שמאל:. חלק החיצוני ביותר של ליבת תוספת אלון. הליבה בקוטר 5 מ"מ נחתכה באמצעות microtome ליבה. המשטח היה אז מוכתם שחור באמצעות סמן המורגש ותאים היו מלאים בגיר לבן לאחר הכתם היה יבש. מימין: הגרף המצביע על מדידות טבעת רוחב וגודל הכלי נעשו על פני השטח של הליבה מוצגת בפינה השמאלית. לא היו צורך בחלקים מיקרו לעשות מדידות אלה בשל פני השטח ברורים שנוצרו על ידי microtome הליבה (שונה אחרי ^21). תחתון: סעיף Micro מנותק ליבת תוספת, מוכתם, מיובש וקבוע בלזם קנדה. עובי: 20 מיקרומטר, אורך: 25 סנטימטר. g "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. תמונות של חלקי מיקרו לחתוך ללא ייצוב לעומת לחתוך קטע באמצעות פתרון עמילן תירס שמאל:. סעיף מיקרו מראה חיתוך חפצים בtracheids earlywood של כוניפאר. המדגם לחתוך ללא הטבעה וכתוצאה מכך הקירות משניים ולא דקים של תאי earlywood פוצלו מהקיר הראשי (חיצים כחולים). מימין: סעיף מיקרו ללא חפצים כלשהם בtracheids earlywood של כוניפאר. סעיף זה (מדגם זהה כפי שמוצג בצד השמאל) נחתך לאחר יישום פתרון קורנפלור עם מברשת על גבי משטח המדגם. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ove_content "fo: לשמור-together.within-page =" תמיד ">
. איור 3. דוגמאות לגבולות טבעת שנתיות כמעט לא מורגש שמאל: סעיף מיקרו של ליבת תוספת (כאן: decidua Larix) מראה גבול טבעת (חץ שחור) שצוין על ידי שורה אחת של תאי latewood שטוחים ללא כל עיבוי של קירות התא. טבעת זה לא תהיה גלויה macroscopically. מימין: תנודות Intra-שנתי צפיפות (חץ לבן) הם נפוצות במינים ים-תיכוניים (סעיף מיקרו: Quercus אילקס). השינוי ההדרגתי של מבנה התא לכיוון latewood וחזרתי למבנה earlywood (חץ לבן) מאפשר הבחנה תנודות צפיפות מגבולות טבעת אמיתית (חץ שחור). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

הין-page = "תמיד">
איור 4. איור של אזור לומן ומדידות עובי דופן בתוך טבעת שנתית של כוניפאר למעלה:. תמונה חותך המראה את תוצאות למופת של ניתוח רוחס בעץ-טבעת של Pinus sylvestris (אורן סקוטי). גבולות טבעת מוצגים בצהוב ומתווים של ומינה tracheid בציאן. לקובץ אחד רדיאלי (ומינה tracheid הכחולה) עובי דופן התא שנמדד מיוצג על ידי עיגולים אדומים. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר שחור. תחתון:. שינויי פנים-שנתי באזור לום tracheid ותא-קיר tracheid עובי לטבעת השנתית כולו אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5. examplדואר של טבעת שנתית יוצרים. התמונה שנלכדה תחת מיקרוסקופ אור עם אור מקוטב ממייקרו-סעיף מוכתם Safranin והכחול-אסטרה מתקבל ממייקרו-ליבה שנדגמו ב ^-7 ליולי, 2007 מdecidua Larix גדלה ב Lötschental ב1,300 מ 'מעל פני ים. על מיקרו-סעיף זה תאי cambial, התאים בשלב ההתרחבות, התאים בשלב קיר העיבוי והתאים הבוגרים הם מוכרים. הרוחב משיק של התמונה מכסה ~ 1 מ"מ של חתך העצה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

האתגרים של שילוב מוצלח ובר קיימא של האנטומיה עץ למחקר dendroecological הם, מלבד בעיות אנליטיות סעפת, בעיקר בשל היבטים טכניים. אתגרים אלה נעים בין דגימת עיקרון גישות ליצירת קטעי מיקרו באיכות גבוהה והניתוח שלאחר מכן ^19.

במבט הראשון, הדגימה של ליבות או אפילו דיסקים היא תהליך פשוט, כי כבר ידוע כבר שנים רבות. יש הרבה דברים שאפשר לעשות לא נכון וחוסר דיוק קטן בדגימה יכול לגרום לבעיות חמורות בשלבי ההכנה וניתוח שלאחר מכן. אי דיוקים קטנים כגון coring שהוא לא בדיוק בניצב לציר הגזע או לשימוש corer חידד מושלם הם לא בעיה, אם המטרה של המחקר מוגבל לתצלצל רוחב מדידות. עם זאת, כאשר מכוונים לניתוח מיקרוסקופי של הדגימות, כיוון דגימה שגוי עלול לגרום לעיוותים אופטיות שלקירות תא, ואילו השימוש בתוצאות corers בוטות בסדקי מיקרו בתוך הליבה. כתוצאה מכך, כאשר מנסים לחתוך קטעי מיקרו של ליבות אלה, החלקים הדקים פשוט מתפרקים והכנה יעילה היא כבר לא מובטחת. הדבר נכון גם עבור דגימת מיקרו-ליבה. קצה קהה יגרום לחץ גבוה כאשר אגרופן הוא שהוחדר לתוך עץ הגזע. כתוצאה מכך שכבת cambial תהיה דחוסה. תאי cambial (איור 5) וכתוצאה מכך הם לחץ ולא ניתן לנתח.

דגימת דיסק היא אכן האסטרטגיה הטובה ביותר בעת ניתוח וריאציות צמיחה להתייחס לשינויים סביבתיים. למרבה הצער זה פשוט בלתי אפשרי לקחת דיסקים מכל העצים המיועדים לנדגמו לניתוח נוסף. אף על פי כן, במיוחד במקרה של מדעי זה נקרא דנדרוכרונולוגיה הטרופית, כמות מסוימת של דיסקי גזע יש צורך בשילוב עם ליבות תוספת. הדיסקים משמשים כבסיס להגדרת גבולות טבעת ולכך לתמוך בboundaries הוגדר על בסיס ניתוח ליבות תוספת ^12,27,28.

היתרונות והחסרונות של מלטש לעומת חיתוך לעתים קרובות דנו ^1,11,21. כפי שהוזכר לעיל, ההליך הטוב ביותר תמיד תלוי בשאלת המחקר והפרמטרים כדי להיות מנותחים (מקרוסקופית או מיקרוסקופיים). אם ניתוח איזוטופי או כימי מוקרן בשלב עבודה נוספת, זה הוא בעל חשיבות עליונה שהאבק שוחק נוצר על ידי מלטש שעשוי למלא לתוך תא ומינה על כל המדגם, הוא הסיר בזהירות על ידי שאיבת אבק או אוויר בלחץ.

חיתוך קטעי מיקרו הוא לכל מיקרוסקופי מנתח את הדרך המתאימה ביותר להכנת דגימות לניתוח נוסף. קודם כל, הסעיף מנותק המדגם, אז מה שיכול להישמר ללא זיהום כלשהו לניתוח נוסף פוטנציאלי. שנית סעיפים אלה מאפשרים למדידות ברזולוציה גבוהות של פרמטרים תא בודדים. יתר על כן, הימנעות הטבעת זמן רבטכניקה באמצעות פתרון קורנפלור ²⁶ כדי לייצב את התאים היא יתרון גדול בחתך מיקרו.

חסרון של חתך מיקרו הוא עדיין גודל המדגם המוגבל וכתוצאה מכך פעמים הכנה ארוכות. לסדרת ניתוחים בזמן אמת הולכת אחורה בזמן במשך מאות או אפילו אלף שנים, יש צורך בפיתוח נוסף מכשירים קיימים חיתוך ^17,19, אלא גם עיבוד תמונה וניתוח ^18. צעד ראשון לכיוון זה הוא הפיתוח של microtome הליבה ^21, תחילת דרך ייצר לחתוך משטחי מטוס על ליבות (איור 1). הבדיקות האחרונות חשפו את היכולת לחתוך קטעי מיקרו של ליבות כל שימוש במכשיר זה (איור 1).

קטעי מיקרו באיכות גבוהה לספק את העיקרון הבסיסי לניתוח תמונה יעיל. אם ניקח את התמונות תחת מיקרוסקופ הוא הליך נפוץ ^19, אבל הניתוח האפקטיבי שלהם הוא עדיין משימה שצריכהלהיות מפותח נוסף ^17. כל מערכות ניתוח התמונה הקיימות הן חצי אוטומטיות, כלומר, הם צריכים להיות פחות או יותר בשליטה בעוצמה על ידי הטכנאי. במקרים רבים, את התמונות צריכים להיות מתוקנות או אפילו תמונות חדשות צריכים להיעשות כדי לשפר בניגוד לרישום טוב יותר של המבנים על ידי התוכנה מבלי לשנות דופן תא עובי בתוך התמונה.

כלי ניתוח תמונה מיוחדים כגון ¹⁸ רוחס, WinCell או סקריפטים ספציפיים לImageJ ²⁹ מסוגלים לספק נתונים אנטומיים בסיסיים כמו מספר תא, ממד תא, דופן תא עובי ומיקום תא בתוך הטבעת השנתית. מדדים אנטומיים רבים נוספים שרלוונטיים בהקשר dendroecological ניתן לחשב ממדידות הבסיסיות אלה כגון גודל של הצינורות הגדולים, התפלגות גודל של צינורות, גודל earlywood או השורה הראשונה של צינורות, צפיפות עץ (אופטית), תוך שנתית פרופילים של גודל צינור וקיר תאעובי, ודפוסים של צינורות (בודדים, כפולות, וכו ') קיבוץ.

שימוש בתוכנה רוחס ^18, את קווי המתאר של ומינה צינור (כלומר, תא ניצוח מים) וגבולות טבעת שנתיות מזוהים אוטומטי וחזותיים מיוצגים כשכבות על התמונה המקורית. אלגוריתמים לזיהוי לצינורות מבוססים על צבע, גודל וצורת מידע, אלגוריתמים לזיהוי לגבולות טבעת בהקשר המקומי של כל צינור. ארגז כלים מאפשר לנו לשפר באופן ידני את התוצאות הללו ישירות על ידי עריכת התכונות של השכבות, כלומר, מחיקה, הוספה ושינוי גבולות טבעת והצינור מתאר. לאחר עריכה, הפלט הסופי הנתונים, כוללים תא קיר עובי (עצי מחט), נוצר באופן אוטומטי והציל לגיליון אלקטרוני. באופן מלא מערכות אוטומטיות אינם זמינות כרגע, אפילו לא לעצי מחט מראה מבנה פשוט יחסית, אבל זה מטרה להתפתחויות עתידיות. זה הייתי מאוד תומך בפושילוב ll פרמטרים אנטומיים עץ סדרת זמן בניתוחים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Increment corer			http://www.haglofinc.com/index.php?option=com_content&view=article &id=57&Itemid=88&lang=en
Core-Microtome			http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN
Laboratory microtome			http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN
Trephor micro corer			http://intra.tesaf.unipd.it/Sanvito/trephorEn.asp
Nawashin solution			Ten parts 1% chromic acid, four parts 4% formaldehyde and one part acetic acid
Picric-Anilin blue			One part saturated aniline blue and four parts Trinitrophenol dissolved in 95% ethanol
Safranin			Empirical Formula (Hill Notation) C20H19ClN4
Astra-blue			Empirical Formula (Hill Notation) C47H52CuN14O6S3
Ethanol			Linear Formula CH3CH2OH
Xylol (Xylene)			Linear Formula C6H4(CH3)2
Canada Balsam			Embedding solution for microscopy
Roxas Software			http://www.wsl.ch/dienstleistungen/produkte/software/roxas/index_EN
ImageJ Software			http://imagej.nih.gov/ij/
WinCell			http://imagej.nih.gov/ij/