Axotomy פנים עצב של עכברים: דגם לחקר תגובת Motoneuron לפגיעה

Summary

We present a surgical protocol detailing how to perform a cut or crush axotomy on the facial nerve in the mouse. The facial nerve axotomy can be employed to study the physiological response to nerve injury and test therapeutic techniques.

Abstract

המטרה של פרוטוקול כירורגית זו היא לחשוף את עצב הפנים, שמעצבב את שרירי פנים, ביציאתו מנקב stylomastoid וגם לחתוך או לרסק אותו כדי לגרום לפגיעה עצבית היקפית. יתרונותיו של ניתוח זה הם הפשטות שלו, שחזור גבוה, וחוסר ההשפעה על תפקודים חיוניים או ניידות משיתוק הפנים שלאחר מכן, ובכך וכתוצאה מכך תוצאות ניתוחיות קלות יחסית בהשוואה לדגמי פגיעה עצבית אחרים. יתרון עיקרי של שימוש במודל פגיעה בעצב גולגולת הוא שmotoneurons מתגורר באוכלוסייה הומוגנית יחסית בגרעין המוטורי הפנים בפונס, לפשט את המחקר של גופי תא motoneuron. בגלל האופי סימטרי של עצבוב עצב פנים וחוסר crosstalk בין הגרעינים מוטורי פנים, הפעולה יכולה להתבצע באופן חד צדדי עם צד unaxotomized משמש כבקרה פנימית לזווג. מגוון רחב של ניתוחים ניתן לבצע לאחר הניתוח לישבניםזה התגובה הפיזיולוגית, אשר פרטיו הן מעבר להיקף של מאמר זה. לדוגמא, התאוששות של תפקוד שרירים יכולה לשמש כסמן להתנהגות reinnervation, או ניתן לכמת motoneurons למדוד הישרדות תא. בנוסף, motoneurons ניתן ללכוד במדויק באמצעות microdissection לייזר לניתוח מולקולרי. בגלל axotomy עצב הפנים הוא פולשנית ונסבלת היטב, זה יכול להיות מנוצל על מגוון רחב של עכברים מהונדסים גנטי. כמו כן, מודל ניתוח זה יכול לשמש כדי לנתח את האפקטיביות של טיפולי פגיעה עצבית היקפיים. פגיעה בעצב פנים מספקת אמצעי לחקירה לא רק motoneurons, אלא גם את תגובותיהם של מייקרו-הסביבה המרכזית וההיקפי גליה, המערכת חיסונית, ושרירי יעד. מודל פגיעה בעצב פנים הוא מודל פגיעה עצבי היקפי מקובל שמשמש ככלי רב עוצמה ללימוד פגיעה עצבית והתחדשות.

Introduction

מודלים פגיעה עצבית היקפיים רבים קיימים, אבל אחד שבולט לחקר motoneurons הוא מודל axotomy עצב הפנים. עצב הפנים, הידוע גם בעצב גולגולת VII, מקורו בגשר המוח ומעצבב את שרירי הבעה בפנים ^1,2. בפרוטוקול זה כירורגית, עצב הפנים חשוף ביציאתו מנקב stylomastoid וגם לחתוך או כתוש. חומרת פגיעה עצבית יכולה להיות מסווגת הבאה סנדרלנד ³ סיווגים, המבדיל את הפגיעה המבוססת על שלמותו של אקסונים, endoneurium, perineurium, וepineurium, שהם שכבות רקמת חיבור שרצף לעטוף את חבילות האקסון. בפציעה למחוץ (axonotmesis), אקסונים, נותקו, אבל perineurium וepineurium נשמרים. התאוששות תפקודית מלאה מלמעוך עצב פנים מתרחשת בכ -11 ימים בגלל נדן העצב שלם משמש כצינור שבתוכו האקסונים לגדל מחדש ^4,5. בהיד השנייה, בפציעת החתך (neurotmesis), אקסונים וכל 3 שכבות רקמת החיבור נותקו, והעצב הדיסטלי כולו צריך לגדל מחדש כדי לשחזר עצבוב שרירים. חיבור מחדש של כירורגי epineurium מבוצע לעתים קרובות בחולים אנושיים עם פציעות חיתוך רוחב עצב, אולם תוצאות ההתאוששות הן לעתים רחוקות אופטימליות. נדרש מחקר נוסף על מנת להבין למה העצב לא מצליח להצמיח מחדש ליעד שלו ויכולים להיות מועסק מה טיפולים כדי לשפר ולהאיץ את תהליך ההתחדשות.

ישנם יתרונות רבים ללימוד פגיעה עצבית באמצעות מודל axotomy עצב הפנים. ראשית, הליך axotomy עצב הפנים הוא מהיר, קל, ומאוד לשחזור; והשיתוק כתוצאה של שרירי הפנים אינו משפיע פונקציות חיוניות ונסבל היטב על ידי בעלי החיים. כיוון שמדובר במודל פגיעה בעצב גולגולת, לומד את גופי תא motoneuron הוא פשוטים כי motoneurons מתגורר באוכלוסייה הומוגנית יחסית בהגרעין מוטורי פנים דואר בפונס. האוכלוסייה אינה שונה המבוססת על תבנית subnuclear בתוך הגרעין המוטורי הפנים, כפי שיש שבע subnuclei כל ספציפי לinnervating קבוצה ספציפית של שרירים, ולכן הבדלי subnuclear בתגובה לaxotomy עשויים להשפיע על תוצאות ^2,6,7.

יתרון עיקרי של מודל פגיעה בעצב פנים הוא שצד unaxotomized יכול לשמש כבקרה פנימית לזווג כי עצבוב העצב הוא סימטרי מאוד ואין crosstalk בין הגרעינים המוטוריים הפנים ^8. יתרון נוסף של שימוש בשיטה ניתוחית זו הוא חוסר טראומה ישירה למערכת העצבים המרכזית או השיבוש של מחסום דם מוח ^9. סיבוכים כגון דימום וזיהום מוגזמים הם נדירים בהליך זה.

מגוון רחב של ניתוחים ניתן לבצע כדי להעריך את התגובה הפיזיולוגית לפגיעה בעצב. ההתאוששות של רפלקס מצמוץ עין ופעילות זיף יכולה לשמש כהתנהגותמדד של ^10,11 החלמה התפקודי. הקלטת וידאו של פעילות vibrissae היא כיום השיטה החזקה ביותר לאיתור התאוששות של עצבוב עצב הפנים ^12,13. לאחר המתת חסד, ניתוח היסטולוגית של גזע המוח יכול להתבצע על גופי תא motoneuron בתוך הגרעין המוטורי הפנים. הגרעין מוטורי הפנים מחולק לשבע subnuclei, כל ספציפי לשרירי פנים מסוימים, המאפשר לבדיקת ההפרש של תגובות לפציעה ^2,6. ניתן לספור motoneurons פנים לכמת הישרדות תא, או אימונוהיסטוכימיה יכולה לשמש לזיהוי סמנים ביולוגיים ואוכלוסיות תאים ספציפיות ^14. הגרעין מוטורי הפנים יכול להיות microdissected במדויק באמצעות לכידת לייזר לניתוח מולקולרי של התגובה התאית לפגיעה בעצב ^15,16. השפעות של axotomy עצב הפנים ניתן לנתח בקליפת המוח המוטורי ^17,18. כמו כן, העצב יכול להיות גזור ללמוד ניוון Wallerian ¹⁹ אוהתחדשות האקסון ^20, ואת השרירים ניתן להסיר ללמוד צמתים עצביים-שרירית ^21. גם axotomy עצב הפנים יכול לשמש כדי לחקור את תאי גליה מרכזיים והיקפיים הנלווים ^22, למקד את המערכת החיסונית תגובת ²³ שרירים ^21, ו. למרות שדברים רבים הושג בלימוד מודל axotomy עצב פנים ^24, נדרש מחקר נוסף של פגיעה עצבית היקפית כי נזק עצבי היא בעיה משמעותית עבור חולים וטיפולים שוטפים לא מצליחים לייצר תוצאות אופטימליות. מודל זה הוא כלי רב עוצמה לבחינת התגובה הפיזיולוגית לפגיעה בעצב וניתוח היעילות של טיפולי התחדשות עצבים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל הנהלים מבוצעים מאושרים על ידי בית הספר לרפואה של אוניברסיטת אינדיאנה מוסדית טיפול בבעלי חי ועדת שימוש ופעלו מכון הלאומי לבריאות הנחיות.

1. טכניקה כירורגית

1. לשמור על טכניקת aseptic במהלך הליך זה על ידי שימוש בכפפות סטריליות, מכשירים, ותחום כירורגית סטרילית על פי הנחיות NIH ^25. לעקר כלים לפני תחילת ניתוח על ידי המעוקר (ראה טבלה של חומרים כימיים / ציוד ספציפי לרשימה מלאה). השתמש מעקר חרוז זכוכית לעקר כלים במהלך המבצע.

2. הרדמה והכנה

1. להרדים את העכבר בתיבת הרדמה בתערובת של 0.9 L חמצן / דקה וisoflurane 2.5% באמצעות מערכת אידוי isoflurane וטרינרים. ודא שהעכבר אינו מגיב לשינויים בתנוחת גוף לפני הסרתו מהתיבה.
2. החל משחת עיניים לmouעיניו של se כדי להגן עליהם מהתייבשות.
3. לעבור את זרימת הגז מהתיבה לחרטום. מניחים את העכבר ישירות על צדו השמאלי על משטח לוהט מכוסה עם כרית כירורגית ונייר סופג ספסל עם האף שלה ופה בתוך חרוט. לפקח באופן רציף קצב הנשימה של העכבר ושיעור ולהתאים את רמות isoflurane לפי צורך (בין 2.5 - 3% isoflurane) כדי לשמור על רמה נאותה של הרדמה, ולהשתמש ברפלקס קמצוץ הבוהן כדי לאשר הרגעה כוללת.

3. גישה ניתוחית

1. יישר ולהתמקד stereoscope עם את שדה הניתוח. התאם את החרטום וקלט אותו כך שהוא נמצא בעמדה בשולי שדה הראייה.
2. עם העכבר שוכב על צידו השמאלי, תדביק את קצה אוזן ימין לחרטום, וחושף את האזור שמאחורי האוזן שבו החתך ייעשה. ודא שוריד אוזן האחורי נוסע אופקי על פני האוזן. שימו לב כי המיקום הנכון של tהוא חיה ומקליטה של ​​האוזן הן קריטיות כדי למצוא עצב הפנים במהירות.
3. להרטיב את הפרווה ובמאחורי האוזן עם 70% אתנול ו לגלח את האתר כירורגית באמצעות סכין גילוח או אזמל. טרום להרטיב את הפרווה הופך גילוח קל יותר במיקום האנטומי הזה.
4. לנקות את העור עם תמיסת יוד, כגון לשפשף פולידין כירורגית (7.5% povidone- יוד), ואחריו אתנול 70%. חזור על ניקוי זה פעמים נוספות כדי לחטא את האזור ביסודיות.
5. כדי לקבוע היכן לבצע את החתך, לעקוב אחר וריד אוזן האחורי מהאוזן caudally לאזור האחורי לבליטת האוזן. בעזרת מספריים האביב, לעשות חתך 4 מ"מ - 2 מ"מ אחורי 3 לבליטה.
6. לנתח באמצעות השומן תת עורי וfascia באמצעות לנתיחה בוטה. הימנע חיתוך ישיר עם המספריים כי כלי דם או רקמת שריר יכולים להיפגע בקלות.
7. אם דימום מתרחש, להפעיל לחץ לאתר כירורגית עם מקלון צמר גפן סטרילילפחות 30 שניות. אם אובדן נוזלים משמעותי מתרחש, להזריק את העכבר intraperitoneally עם עד 0.5 מיליליטר של תמיסת מלח סטרילית 0.9% באמצעות 25 או 27 מחט G.
8. השתמש בכמה ציוני דרך מרכזיות, עצב אבזר השדרה, תעלת אוזן, וקדמיים שריר הדו-בטנים (שיפורט להלן), כדי לאתר את עצב הפנים. לנתח סביב ציוני הדרך הללו עד הסניפים של עצב הפנים הם דמיינו. העצב יופיע כמבנה לבן מוצק משמעותי כאשר הוא נחשף ושכבת fascia שומרת אותו למבנים שבבסיס.
   1. מצא את עצב אבזר השדרה, אשר נוסע מחלק הזנב של הגולגולת למעצבב את שריר הטרפז, ברגע שהשומן תת עורי וfascia כבר גזור. עצב הפנים עמוק לעצב אבזר השדרה.
   2. מצא את תעלת אוזן הסחוסים שנראית פנינים לבנה וניתן לראות מקורי לעצב הפנים.
   3. מצא את שריר הבטן של השריר הדו-הבטנים הקדמית שנמצאת על גבי וגaudal לעצב הפנים.
9. כאשר הענפים העיקריים של עצב הפנים הם דמיינו, לעקוב אחר אותם dorsally למצוא מוצאם מנקב stylomastoid. באמצעות קנס היטה מלקחיים דומון # 5/45 להחזיק אתר כירורגית פתוח, לקדם את הטיפים מספריים האביב הבא הנתיב של העצב, ולאחר מכן להעביר את המלקחיים dorsally לשמור על האזור המתקדם החדש פתוחים.
10. דמיינו את תא המטען של עצב הפנים עם הזיגומטית, buccal, וסניפים בלסת תחתונים, שוליים בנקודה זו.
    הערה: הסניף הזמני יימצא קרוב יותר לforamen. ענפי עצב הלסת תחתונים, השוליים לחלקיו העליונים ותחתונים קרובים ללסת, וכך בענפי עצב אלה לא יהיו גלויים ברמה זו.
    1. אם ביצוע חיתוך רוחב עצב, לייצב את העצב בעדינות עם המלקחיים טיפ הנאה וחתך את העצב עם המספריים באביב. הימנע מהפעלה יותר מדי מתיחה בעצב עם המלקחיים כדי למנוע avulsing העצבי מהמוח. Pushהגדמים אחד מהשני, או לחתוך ולהסיר חלק מהעצב הדיסטלי כדי לוודא ששום חיבור מחדש יכול להתרחש.
    2. אם ביצוע פציעה למעוך, להשתמש דומון # 5/45 במלקחיים כדי לדחוס את העצב למשך 30 שניות באמצעות לחץ מתמיד לנתק את כל האקסונים, ולאחר מכן לחזור למחוץ זה בזווית שנייה בניצב לאתר למעוך הראשון. הימנע מהפעלת כמויות משתנות של לחץ במהלך למעוך 30 שניות, אחרת הפציעה תהיה עקבית בין בעלי החיים.

4. סגירה ושחזור

1. למקם מחדש את השומן ושרירים על מבני היסוד.
2. בקירוב את הקצוות של החתך ולסגור את הפצע באמצעות קליפ פצע 7.5 מ"מ. תפרים או דבק מקובלים גם לסגירת פצעים. יכולים להיות מסופקים על משככי כאבים לאחר ניתוח בשלב זה.
3. הסר את הסרט מאוזנו של העכבר. כבה את זרימת isoflurane ולאפשר העכבר כדי לנשום חמצן טהור למשך 30 שניות לדקות 1. Plאס העכבר בכלוב ריק ללא מצע להתאושש מהרדמה.
4. כאשר העכבר הוא התאושש, לבחון את ההתנהגות שלה בחיפוש אחר סימנים לאישוש של שיתוק פנים. השפם יהיה משותק והזווית חזרה לכיוון הלחי, האף יהיה חרג, והעין לא למצמץ בתגובה למשב אוויר.
5. בעלי חיים במשותף הבית לאחר ניתוח אם הם ממין נקבה. הימנע דיור עכברי זכרים במשותף כי הם אגרסיביים יותר ונוטים להעביר בכפיית קליפים הפצע של cagemate, מה שמוביל לזיהום. לספק משככי כאבים לאחר ניתוח בשלב זה, במידת צורך.
6. לפקח על העכברים פעם ביום במשך כמה ימים לאחר הניתוח כדי לוודא ששום זיהום או סיבוך אחר מתרחש לאחר הניתוח. הסר קליפים פצע 7-10 ימים לאחר הניתוח, אם הם לא נפלו החוצה בכוחות עצמם.
7. החל הסיכה משחה העין לעין המושפעת מדי יום כדי למנוע סיבוכים בקרנית, או עד שרפלקס מצמוץ העין הוא מחדשמכוסה או עד המתת חסד.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

לאחר axotomy עצב הפנים מתבצע, אובדן motoneuron מתרחש כתוצאה מהפגיעה. הישרדות Motoneuron לאחר פציעה תלויה במשתנים רבים, כגון מין, גיל בעלי חיים בזמן הניתוח, ונקודה זמן שבה סעיפי motoneuron נעשים, ומורן וסקירת Graeber ²⁴ וJinno וסקירת Yamada ²² שני לסכם נתונים הישרדות motoneuron. בדרך כלל, כ -86%...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

The critical step for this protocol is positioning the mouse properly before surgery is begun. If the mouse is not lying flat on its side, the ear is not taped at the correct angle, or the incision is made in an incorrect location, then finding the facial nerve becomes much more difficult. When this technique is mastered, surgeries will take only minutes per mouse.

Either sutures, glue, or wound clips can be used to close the wound. Wound clips are preferred because of the small size of incis...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereo microscope	Leica	M60
Labeling tape	Fisher Scientific	15-952
Vannas-Tübingen spring scissors - straight/sharp/8.5 cm/5 mm cutting edge	Fine Science Tools	15003-08	Sterilize before use
Dumont #5/45 forceps - standard tips/angled 45°/Dumoxel/11 cm	Fine Science Tools	11251-35	Sterilize before use
Michel suture clips - 7.5 mm x 1.75 mm	Fine Science Tools	12040-01	Described as "wound clip" in protocol, sterilize before use
Hagenbarth cross action wound clip applier 5"	George Tiemann & Co	160-910	Used to apply wound clip, sterilize before use
Michel suture clip applicator & remover - For 7.5 mm clips	Fine Science Tools	12029-12	Used to remove wound clip
0.9% Sodium chloride injection, USP	Hospira	0409-4888-10
Betadine, 16 oz, with dispenser	Fisher Scientific	19-027132
70% Ethanol
Glass bead sterilizer