Transfection גן לתאי ספרואיד על צלחות micropatterned תרבות להשתלת תאים גנטיות-שונה

Summary

This protocol describes a cell transplantation system using genetically modified, injectable spheroids. Cell spheroids are cultured on micropatterned culture plates and recovered after gene introduction using polyplex nanomicelles. This system facilitates prolonged transgene expression from the transplanted cells in host animals while maintaining the innate function of the cells.

Abstract

כדי לשפר את היעילות הטיפולית של השתלת תאים, מערכת השתלה, spheroids זריקות מהונדס גנטי פותחה. Spheroids התא ערוכים מערכת תרבות על צלחות micropatterned מצופות פולימר thermosensitive. מספר spheroids נוצרים על הצלחות, מתאים לאזורי הידבקות תא של 100 מיקרומטר קוטר הערוך באופן קבוע באופן דו-ממדי, מוקפים באזורים שאינם דבקים שהם מצופים בפוליאתילן גליקול מטריצה ​​(PEG). ניתן לשחזר בקלות spheroids כהשעיה נוזלית על ידי הורדת הטמפרטורה של הצלחות, והמבנה שלהם נשמר היטב על ידי עובר אותם באמצעות מחטי הזרקה עם קליבר גדול מספיק (מעל 27 G). שינוי גנטי מושגת על ידי transfection גן באמצעות המוביל המקורי שאינו נגיפי הגן, nanomicelle polyplex, אשר מסוגל החדרת גנים לתאים מבלי לשבש את מבנה אליפטית. לחסודspheroids hepatocyte ארי transfected עם גן להביע לוציפראז, לוציפראז מתקבל בר קיימא בבעלי חיים מושתלים, יחד עם פונקצית hepatocyte נשמר, כפי שצוין על ידי ביטוי אלבומין. מערכת זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של סוגי תאים, כולל תאי גזע mesenchymal.

Introduction

טיפול השתלת תאים משך תשומת לב נרחבת לטיפול במחלות שונות סוררות. הפעילות וזמן מחצית החיים של גורמים ביו המופרשים על ידי התאים המושתלים הם חיוניים ליעילות טיפולית משופרת של מערכת השתלת תאים. הנדסה גנטית של התאים לפני ההשתלה היא טכניקה מועילה להסדיר ולטפל פונקציות סלולריות, כולל ההפרשה של הגורמים ביו. כמו כן, חשוב לשמור על מייקרו-סביבה נוחה לתאים למניעת מוות של תאים או הפסד של פעילות תא. תרבות תלת ממדי תא (3D) אליפטית, שבו אינטראקציות תא אל התא נשמרות היטב, מבטיחה למטרה זו, למשל, לשיפור הפרשת אלבומין מhepatocytes העיקרי וקידום בידול רב שושלת מתאי גזע mesenchymal (MSCs ) ^1-7.

במחקר זה, מערכת שילוב רומן של spheroiתרבות ד וtransfection הגן משמש לשמש כפלטפורמה להשתלת תאים מהונדסת גנטי. ליצירת תאי אליפטית, משמשת מערכת תרבות אליפטית על צלחות תרבות micropatterned. על צלחות אלה, אזורי הידבקות תא של 100 מיקרומטר קוטר ערוכים באופן קבוע באופן דו-ממדי ומוקפים באזורים שאינם דבקים המצופים על ידי מטריקס PEG ^3. על ידי זריעת מספר מספיק של תאים, מערכים של spheroids 3D של 100 מיקרומטר בקוטר נוצרים מתאים למיטת תרבות micropatterned.

Spheroids הם התאוששו מבלי לשבש את המבנה שלהם 3D באמצעות צלחות תרבית תאי thermosensitive, שמצופים בפולימר thermosensitive, פולי (ISO-propylacrylamide) (PIPAAm) ^8-10. ארכיטקטורת micropatterned בנויה על צלחות thermosensitive (שנבנה מותאם אישית). פשוט על ידי הורדת הטמפרטורה של הצלחות, spheroids מנותק מהמיטה התרבות ולפזרד בפוספט שנאגרו מלוח (PBS). לפיכך, ניתן להשיג מספר רב של spheroids עם גודל אחיד של 100 מיקרומטר בצורה של השעיה להזרקה.

איור 1. ייצוג סכמטי של מערכת תרבות אליפטית על צלחת micropatterned. שינוי גנטי מושגת על ידי transfection גן באמצעות המוביל המקורי שאינו נגיפי הגן, nanomicelle polyplex. הוא מורכב מפלסמיד דנ"א (pDNA) וקופולימרים לחסום -polycation פוליאתילן גליקול (PEG) ^11. יש לי אלה מבנה ליבה-קליפה אופיינית מורכב מפגז PEG וליבה פנימית של pDNA תמצית, המאפשר הקדמת גן בטוחה ויעילה לתאים למטרות טיפוליות ^11. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של תידמות של.

איור 2. מבנה של nanomicelle polyplex שהוקם על ידי המורכב של חומצות גרעין וקופולימרים לחסום PEG-הגוש-polycation. במחקר זה, היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שמבנה אליפטית לא יופרע במהלך transfection גן על ידי nanomicelles. לאחר transfections תיווך nanomicelle של spheroids hepatocyte העיקרי עכברוש, ביטוי transgene ממושך מתקבל ליותר מחודש עם הפרשת אלבומין רציפה מhepatocytes ברמה דומה לזו של spheroids untransfected ^12. ביטוי transgene והפרשת אלבומין מspheroids גם נשמרים לאחר התאוששות מהצלחות thermosensitive. ברור שnanomicelles יכול להקל מבוא גן בבטחה מבלי לפגוע בפונקציות המולדת של ממולחatocytes. לפיכך, שילוב של תאי אליפטית תרבותיים על צלחות micropatterned thermosensitive עם מבוא גן באמצעות nanomicelles היא פלטפורמה מבטיחה להשתלת תאים מהונדסת גנטי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל המחקרים בבעלי החיים שנערכו באישור ועדת הטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטה של ​​טוקיו, טוקיו, יפן.

1. תא הכנה

1. לhepatocytes העיקרי, בצע את הפרוטוקול לבידוד hepatocyte מחולדה בתהליך עיכול collagenase שני שלבים שונה ^13,14.
   1. להרדים חולדות ספראג Dawley (SD) (זכר, 5 שבועות) תחת הרדמה משאיפת עם isoflurane. מניחים חולדה בתא מחובר למכונת הרדמה כדי לספק isoflurane לתא. קח את העכברוש לאחר להירדם, והניח אותו על שולחן הניתוחים עם אוורור באמצעות מסכה. לשלוט על זרימת isoflurane כ ב0.4-0.7 L / min על ידי בדיקת התנאים של החולדה. Perfuse את הכבדים של ספראג Dawley (SD) חולדות (זכר, 5 שבועות) מוריד השער הכבד עם פתרון מיוחד המורכב של נתרן כלורי 8 גרם / L (NaCl), כלוריד 400 מ"ג / ליטר אשלגן (KCl), 78 מ"ג / Ldodecahydrate פוספט מימן disodium dihydrate פוספט dihydrogen נתרן (אא ₂ PO ₄ · 2H ₂ O), 151 מ"ג / ליטר (Na ₂ HPO ₄ · O 12H _2), 2.38 גר '/ ל' 2 [4 (2-hydroxyethyl) -1 -piperazinyl] קרבונט מימן נתרן חומצת ethanesulfonic (HEPES), 190 מ"ג / ליטר חומצת אתילן גליקול tetraacetic (EGTA), 350 מ"ג / ליטר (NaHCO _3), ו -900 גלוקוז מ"ג / ליטר.
   2. להפיץ פתרון collagenase דרך כבד.
      הערה: הפתרון מורכב של 500 מ"ג / collagenase L, / מלח של L האנק 9.8 גרם נאגר, 2.38 גר '/ מיליליטר HEPES, 556 מ"ג / מימה סידן כלורי מיליליטר (CaCl ₂ · O H _2), 350 מ"ג / ליטר NaHCO _3, ומעכב 50 מ"ג / ליטר טריפסין, עם החומציות מותאמת ל7.2.
   3. הסר את הכבד בזהירות, ובררת אותו בעדינות על צלחת באמצעות סכין אזמל, להוסיף בינוני של הנשר (DMEM) בתוספת סרום 10% שור עוברי (FBS), השתנה Dulbecco ולסנן את ההשעיה התא דרך 100 מיקרומטררשת ניילון. כדי להסיר פסולת נוספת, צנטריפוגה ההשעיה התא ב 20 × גרם דקות 1. בשלב זה, hepatocytes נמצא בsupernatant.
   4. חזור על שלב צנטריפוגה פעמיים (בסך הכל שלוש centrifugations). לבסוף, צנטריפוגות hepatocytes ב 50 × גרם במשך 3 דקות לשחזר אותם בצורה של גלולה.
   5. להשעות מחדש hepatocytes לריכוז של 4 × מיליליטר / 10 ⁵ תאים במדיום תרבות מיוחד המורכב מDMEM בתוספת 10% FBS, 1% עט-דלקת-שפע (PSQ), 1% sulfoxide דימתיל (DMSO), 0.1 dexamethasone μmol / L, 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין, nicotinamide / L 10 mmol, ascorbate 0.2 mmol / L פוספורילציה (ASC-2P), ו- 10 ng / ml גורם האנושי צמיחת אפידרמיס (hEGF) ^15. מדיום מיוחד זה הוא חובה לשמירה על התפקוד הכבד בתנאים במבחנה.
2. לקבלת MSCs חולדה, להרדים ספראג Dawley חולדות (SD) (זכר, 5 שבועות) על ידי ממשל יתר של isoflurAne. לכרות עצמות הירך וtibias, ולאסוף את קישואי עצם על ידי החדרת מחט G 22 לתוך הפיר של העצם כדי לשטוף אותו עם 10 מיליליטר של DMEM בתוספת 10% FBS. לאסוף את התאים על ידי סינון דרך רשת ניילון 100 מיקרומטר.
3. זרעי התאים על 10 מנות תרבות סנטימטר באמצעות DMEM המכיל 10% FBS ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין. לניסויי אליפטית, להשתמש MSCs בתוך 5 קטעים.

2. הכנת Spheroids הסלולרי 3D

1. מסחרי להשיג צלחות תרבות micropatterned, שבאזורי דבק התא ערוכים באופן קבוע ב 100 מיקרומטר קוטר באופן דו-ממדי, מוקף באזורים שאינם דבקים המצופים על ידי מטריקס PEG.
   הערה: להשתלת תאים, ציפוי נוסף עם PIPAAm פולימר thermosensitive הכרחי כדי לאפשר ניתוק תא על ידי קירור הצלחות (ראה שלב 5.1). תנודות טמפרטורה יכולה לגרום לשינויים בכימיה של פולימרים זה^8-10. על 37 מעלות צלזיוס, PIPAAm הוא מעט הידרופובי, מאפשר לתאים להיות מתורבת בתנאים רגילים. ירידה בטמפרטורה מתחת 32 ° C תוצאות בלחות מהירה של הפולימר, שהובילה לניתוק הספונטני של התאים.
2. זרעי hepatocytes או MSCs על 12 גם צלחות micropatterned בצפיפות של 4 × 10 ⁵ תאים / גם andincubate על 37 מעלות צלזיוס באווירת humidified המכילה 5% CO _2. התאים יצטברו באזורי הדבקת micropatterned ויוצרים spheroids סיבוב בהדרגה ב 2 ימים.
   הערה: להכנת תאי שליטה בתרבות monolayer, להשתמש בצלחות 12 גם נורמליות וזרע התאים בצפיפות זהה, לאחר הליך דומה כפי שתואר לעיל.

3. הכנת Polyplex Nanomicelles

1. לסנתז קופולימר בלוק, PEG-PAsp (DET) (פולי [N '- [N - (2-aminoethyl) -2-aminoethyl] aspartamide]) (PEG Mw = 12,000, תואר פילמור (DP) של PAsp מגזר (DET) = 59), וhomopolymer שמורכב מרק מגזר קטיוני [PAsp (DET)] (DP = 55), בעקבות ההליכים שתוארו קודם לכן על ידי מהחברים ^{11, 16, 17.}
2. הכן פתרון מעורב של PEG-PAsp קופולימר הבלוק (DET) וhomopolymer PAsp (DET) ביחס טוחנת שווה של קבוצות אמינו שיורית בחיץ 10 מ"מ HEPES (pH 7.3) על ידי התאמת ריכוז הפולימר ל33.3 מיקרוגרם / מיליליטר ו 19.1 מיקרוגרם / מיליליטר, בהתאמה.
   הערה: ריכוזי הפולימר שתוארו לעיל הם ערכי נציג להכנת nanomicelles עם יחס שייר טוחנת בסך הכל קבוצות אמינו בשני פולימרים לקבוצות פוספט בpDNA (N / יחס P) של 10. היחס / P N יכול להשתנות בהתאם לסוג התא והמטרה (לפרטים, ראה דיון). השימוש בשילוב של שני פולימרים יכול להשיג את שניהם מיגון יעיל PEG ותפקוד של PAsp (DET) כדי לשפר את endosomalלברוח (לפרטים, ראה דיון) ^18.
3. הכן את לוציפראז pDNA קידוד Gaussia, לוציפראז GL4, או אריתרופויאטין על ידי שיבוט המקטע המבטא את הגנים המתאימים לפלסמיד pCAG-GS (http://www.cdb.riken.jp/pcs/protocol/vector/map/m36.html ) כדי לקבל ביטוי תחת האמרגן / משפר CAG באמצעות ערכה מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן. להגביר את pDNA בזן coli Escherichia מוסמך ולטהר אותו באמצעות מערכת טיהור פלסמיד דנ"א ללא רעלן פנימי. קבע את ריכוז pDNA בספיגה של 260 ננומטר כדי להשיג פתרון / מיליליטר 150 מיקרוגרם בחיץ 10 מ"מ HEPES (pH 7.3).
4. כדי להכין את nanomicelles polyplex, ומערבב היטב פתרון pDNA (150 / מיליליטר מיקרוגרם ב 10 חיץ HEPES מ"מ) ופתרון המעורבב מראש של שני הפולימרים ביחס של 2: 1 (לפי נפח).

4. ג'ין Transfection לSpheroids

1. דגירה התאים (hepatocytesאו MSCs) במשך 72 שעות לאחר זריעה על צלחות micropatterned כדי לאפשר ההיווצרות של spheroids הבוגר. עבור transfection גן, להוסיף את פתרון nanomicelle polyplex 100 μl (המכיל 10 מיקרוגרם של pDNA) זה טוב לאחר החלפת מדיום התרבות עם 1 מיליליטר של מדיום טרי. המשך דגירה עם פתרון nanomicelle למשך 24 שעות.
2. לשליטה באמצעות מגיב transfection שומנים מבוסס, לערבב פתרונות pDNA עם מגיב במגיב / pDNA יחס משקל של 3. כוון את המינון הסופי של pDNA להיות שווה לשניהם מגיב שומנים מבוססי ושיטות nanomicelle.

שחזור 5. והשתלות של Spheroids הסלולרי

1. החלף את מדיום התרבות עם 200 μl של PBS הקר ומניח את הצלחות על קרח.
   הערה: באופן כללי, spheroids יכול לנתק בכ -15 דק 'וניתן לשחזר בצורה של השעיה להשתלה.
2. לשאוב בעדינות את התאים בμl 200השעיה באמצעות מזרק עם G 23 או מחט 27 G זריקות in vivo.

6. הערכה של ביטוי transgene

1. להערכה במבחנה של הביטוי של בלוציפראז Gaussia מופרש במדיום התרבות, לאסוף 50-100 μl של המדיום בדיוק 24 שעות אחרי החלפה עם מדיום חדש. להעריך את הביטוי בלוציפראז באמצעות מערכת מסחרית לוציפראז renilla assay וluminometer פי הפרוטוקול של היצרן.
   הערה: לוציפראז Gaussia נותר יציב במדיום התרבות ליותר משבוע. לכן, כדי להעריך את היעילות של ביטוי transgene בזמן אמת, להחליף בינוני עם טרי אחד לפני האיסוף בינוני המדגם. העיתוי של השינוי הבינוני יכול להיות גמיש.
2. להערכה in vivo של ביטוי transgene בבעלי חיים מארח לאחר השתלת תאים, להרדים BALB / עכברים בעירום ג (נקבה; 7 שבועותישן) תחת הרדמה משאיפת עם isoflurane.
   1. מניחים את העכבר בתא מחובר למכונת הרדמה כדי לספק isoflurane לתא. קח את העכבר לאחר שנרדם, והניח אותו על שולחן הניתוחים עם אוורור באמצעות מסכה. לשלוט על זרימת isoflurane כ ב0.2-0.5 L / min על ידי בדיקת התנאים של העכבר.
   2. להזריק 200 μl של ההשעיה התא המכילה spheroids transfected עם pDNA להביע לוציפראז GL4 (כפי שמתואר ב4.1) לרקמה התת עורית באזור הבטן.
   3. מייד לאחר הזרקת D-luciferin (150 מ"ג / קילוגרם; מסלול תוך ורידי), למדוד את הביטוי בלוציפראז באמצעות מערכת ההדמיה IVIS פי הפרוטוקול של היצרן.
3. להערכת ההשפעות הטיפוליות של השתלת התאים, להזריק 200 μl של ההשעיה התא המכילה spheroids transfected עם pDNA קידוד-אריתרופויאטין לרקמה התת עורית באזור הבטן.
   1. לאסוף דגימות דם על ידי דימום submandibular להשיג כ -200 μl דם ^19. מדוד את ההמוגלובין והמטוקריט באמצעות נתח דגימת דם.
      הערה: מספר התאים להשתלה מוסדר על ידי המספר נזרע על הצלחות. למרבה הצער, קשה לקבוע את מספר התא המדויק, כי המספר בתוך spheroids לא ניתן למדוד.
4. לאחר ניסויים, למקם את העכברים על כרית חימום מחוברת עם בקר טמפרטורה עד התעוררות מהרדמה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

transfection הגן של pDNA להביע לוציפראז Gaussia בוצע בspheroids הוקם על ידי hepatocytes או MSCs באמצעות nanomicelles polyplex או מגיב transfection שומנים מבוססי שליטה ^12. Nanomicelles מושרה כמעט ללא שינוי במבנה אליפטית לעומת spheroids-transfected לא על צלחות micropatterned, ואילו מגיב השליטה שיבש באופן משמעותי את המבנה יום ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

בפרוטוקול זה, זה הוא קריטי כדי לשמור על מבנה 3D של spheroids במהלך השלבים של מבוא גן והתאוששות אליפטית. זה חיוני כדי לשמור על מייקרו-סביבות נוחים לתאים, כדי למנוע מוות של תאים או הפסד של פעילות תא. לדוגמא, הפרשת אלבומין, פונקציה מולדת נציג hepatocytes, נשמרה היטב בspheroids hepatocyte, בעוד ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pen-Strep-Glut	GIBCO
Dexamethasone	Wako Pure Chemical Industries	041-18861
Nicotinamide	Wako Pure Chemical Industries	141-01202
Hank’s buffered salt and L-ascorbic acid 2-phosphate (Asc-2P)	Sigma-Aldrich	A8960
Human epidermal growth factor (hEGF)	Toyobo	PT10015
Cell-able multi-well plates	Toyo Gosei	PP-12
Thermosensitive cell culture plates (Upcell)	CellSeed Inc		The micropatterned architecture is constructed on the thermosensitive plates (custom-built by Toyo Gosei)
Lipid-based transfection reagent (FuGENE HD)	Promega	E2311
Renilla Luciferase Assay System	Promega	E2810
pGL4 Luciferase Reporter Vector	Promega	E6651
pDNA expressing Gaussia luciferase	New England BioLabs	N8082S
Mouse erhthropoietin-expressing vector	Origene	MC208445
pCAG-GS			Kindly provided by Laboratory for Pluripotent Cell Studies, Center for Developmental Biology, RIKEN
Escherichia coli DH5α competent cells	Takara	9057
Endotoxin-free plasmid DNA purification system	Nippon Genetics	NucleoBond Xtra EF
Collagenase	Wako Pure Chemical Industries	639-00951
Trypsin inhibitor	GIBCO	R-007-100
Luminometer	Promega	GloMax™ 96 Microplate Luminometer
IVIS Imaging System	Xenogen Corp.	Xenogen IVIS Spectrum in vivo imaging system
Blood sample analyzer	Sysmex	pocH-100i Automated Hematology Analyzer