JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

The lymphodepletive and immunomodulatory effects of chemotherapy and radiation standard of care can be leveraged to enhance the antitumor efficacy of T cell immunotherapy. We outline a method for generating EGFRvIII-specific chimeric antigen receptor (CAR) T cells and administering them in the context of glioblastoma standard of care.

Abstract

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo to express chimeric antigen receptors specific for glioma antigens (CAR T cells). The expansion and function of adoptively transferred CAR T cells can be potentiated by the lymphodepletive and tumoricidal effects of standard of care chemotherapy and radiotherapy. We describe a method for generating CAR T cells targeting EGFRvIII, a glioma-specific antigen, and evaluating their efficacy when combined with a murine model of glioblastoma standard of care. T cells are engineered by transduction with a retroviral vector containing the anti-EGFRvIII CAR gene. Tumor-bearing animals are subjected to host conditioning by a course of temozolomide and whole brain irradiation at dose regimens designed to model clinical standard of care. CAR T cells are then delivered intravenously to primed hosts. This method can be used to evaluate the antitumor efficacy of CAR T cells in the context of standard of care.

Introduction

גליובלסטומה (GBM) היא הגידול במוח הנפוץ ביותר הראשוני הממאיר והוא תמיד קטלני. כריתה כירורגית בשילוב עם כימותרפיה סטנדרטית של טיפול והקרנות שאינם ספציפי לא מצליחה לחסל לחלוטין תאים ממאירים, וכתוצאה מכך הפרוגנוזה עגומה של פחות מ -15 חודשים בחולים עם מחלה זו 1. בניגוד לכך, טיפול חיסוני מציע גישה מדויקת לאופן ספציפי מיקוד תאים סרטניים, ובכך יש לו הפוטנציאל לשמש פלטפורמת טיפול יעילה ביותר עם ​​סיכון מופחת של רעילות בטחונות 2-4. תאי T מהונדסים vivo לשעבר להביע קולטנים אנטיגן chimeric (מכוניות) מציעים אסטרטגיה רב-תכליתית לטיפול חיסוני גידול. מכוניות שנוצרו על ידי פיוזינג האזור משתנה תאי של נוגדן עם מולקולת תא T תאית אחד או יותר איתות (s), במקום histocompatibility הגדול באורך מלא מורכב (MHC) -restricted קולט תא T 5. מצב זה של פרסים והכרה אנטיגן כמו-נוגדןבמאפשר לתאי T אנטיגן הספציפי לתגובתי לזהות ולהגיב לאנטיגנים סרטניים בהעדר MHC ויכולים להיות מותאמים לרפרטואר אנטיגן כמעט אינסופי.

תאי T CAR המהונדסים נגד מגוון רחב של אנטיגנים סרטניים הראו יעילות קלינית ופרה הבטחה מצטיינת במרפאת 6-9. באופן ספציפי, בהקשר של GBM, גרסת CAR פלטפורמת תא T מיקוד צמיחת אפידרמיס קולטן גורם III (EGFRvIII), מוטציה גידול ספציפי הביעה על פני תא 10, הוצג להארכת הישרדות בעכברי נושאי גליומה 11. למרות צדדיות שלהם, לעומת זאת, התועלת הקלינית של טיפול המאמץ CAR לא התממשה במלואו, נובע בחלקו הדיכוי החיסוני גידולים הקשורים והעלמת חיסונית 12-16, כמו גם אתגרים בהקמה ואחזקת תאי T אנטיגן הספציפי in vivo. מינוף הטיפול סטנדרטי (SOC) עם טיפול חיסוני עלולה להתגבר כמה מאלה lחיקויים, וכתוצאה מכך היעילות משופרת בשתי ההגדרה פרה-קלינית וקלינית.

SOC להודעה כריתה-GBM מורכב מtemozolomide במינון גבוה (TMZ), סוכן אלקילציה DNA 17, והקרנת המוח כולו (WBI) 1. טיפולים אלה בחזקתו יתמזגו עם חיסוני גידול באמצעות גברת ביטוי של גידול ביטוי MHC 18-20 ושפיכת אנטיגנים על ידי תאים סרטניים מתים 17,19,21,22. ואכן, התוספת של TMZ 20,23 או WBI 18,24 מוביל ליעילות אנטי-סרטנית משופרת של טיפולים מבוססי חיסון בהגדרה פרה-קלינית. יתר על כן, כמו רבים chemotherapeutics ציטוטוקסיות שאינו ספציפי, TMZ ידוע כגורם 25,26 lymphopenia מערכתי, שניתן למנף כאמצעי למארח-אוויר לפלטפורמות טיפול מאמצים 27-29. lymphodepletion תיווך TMZ הוכח כדי לשפר את התדירות ואת התפקוד של תאי T אנטיגן ספציפי, שמוביל ליעילות מוגברת של adopפלטפורמת טיפול מופרזת נגד גידולים תוך-גולגולתי 30. בהקשר של טיפול CAR, lymphodepletion משמש כאמצעי למארח-אוויר על ידי שני צמצום מספר מדכא אנדוגני תאי T 31, וגרימת תרבות הומיאוסטטית 32 באמצעות הפחתת תחרות לציטוקינים 33, וכך לשפר את הפעילות אנטי-סרטני 11,34. בהתחשב ביחסים סינרגטיים בין פלטפורמות SOC ואימונותרפיה GBM, הערכת טיפולים מאמצים רומן ופלטפורמות חיסון בהקשר של SOC היא קריטית להסקת מסקנות משמעותיות לגבי יעילות.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה לדור והעירוי לוריד של תאי T CAR העכבריים EGFRvIII הספציפי לצד TMZ וWBI בעכברי נושאי גידולים תוך-גולגולתי EGFRvIII-חיובי (ראה תרשים 1 לציר זמן טיפול). בקצרה, תאי T CAR נעשים לשעבר vivo על ידי התמרה retroviral. כליה עוברית אנושית (HEK) 293T תאים transfected באמצעות מורכב DNA / שומנים בדם (המכיל את וקטור CAR ופלסמידים PCL-Eco) לייצר וירוס, אשר לאחר מכן נעשה שימוש כדי transduce splenocytes העכברי הופעל שנקצרים ותרבותי במקביל. במהלך דור CAR, מארחים עכבריים נושאות גידולים תוך-גולגולתי EGFRvIII חיובית מנוהלים הקרנה מופרד המוח כולו רנטגן וטיפול TMZ מערכתי במינונים דומים לSOC הקליני. לאחר מכן תאי T CAR מועברים דרך הווריד למארחי lymphodepleted.

ההליך הבא מתואר בשבעה שלבים נפרדים: (1) מנהל של temozolomide לעכברים, (2) הקרנת המוח כולו של עכברים נושאי גידול, נושאי גידול (3) Transfection, (4) כריתת טחול ותא T הכנה, (5 ) התמרה, (6) תרבות תא T CAR וקציר, ו( 7) ממשל תא T CAR לעכברי נושאי גידול. שלבים אלה מורכבים מכמה שלבים שמשתרעים על פני 6-7 ימים ומבוצעים במקביל.

Protocol

פרוטוקול זה מבוסס על עיצוב ניסיוני שבו מטופלים 10 עכברים עם 10 תאי T 7 CAR כל אחד. משמעות דבר היא כי יהיו צורך 10 8 תאי T CAR; התשואה צריכה להפריז בשיעור של 5 x 10 x 10 7 -1 8 לחשבון להפסד בכדאיות. הפרוטוקול הבא ישתנה לייצר כ 200 x 10 6 תאים. אז התאים בהזרקה לוריד לC57BL / 6 נקבות עכברים עם גידולי 9 יום הוקמו syngeneic EGFRvIII החיובי תוך גולגולתי, שפותחו משורות תאים מלנומה אסטרוציטומה KR158B או B16 הקיימים. בד בבד עם דור תא CAR T, עכברי נושאי גידול מנוהלים מינונים רלוונטיים קליני של TMZ lymphodepletive (60 מ"ג / קילוגרם) וWBI (16.5 Gy).

עכברים נשמרו וגדלו בתנאי הפתוגן ללא במרכז הרפואי של אוניברסיטת דיוק (DUMC). כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי דוכס מוסד האוניברסיטהאל טיפול בבעלי חי ועדת שימוש (IACUC).

1. מנהל של temozolomide לעכברי נושאי גידול

ימים 0 עד 4:

  1. לחשב את המספר הכולל של עכברים להיות מוזרק ולהכפיל את זה ב -0.5 כדי לקבוע את עוצמת הקול של פתרון TMZ הדרוש (לדוגמא, 30 עכברים x 0.5 מיליליטר = 15 מיליליטר TMZ) ולהוסיף 1.5 מיליליטר לכרך זה כדי להסביר את גלישה (16.5 מיליליטר TMZ ).
  2. להכפיל נפח כולל זה על ידי 3 מ"ג / מיליליטר כדי לקבוע את המשקל של TMZ lyophilized הדרוש (לדוגמא, 16.5 x 3 = 49.5 מ"ג TMZ). לשקול את זה בחרוטים 50 מיליליטר.
    זהירות: TMZ הוא רעיל על ידי שאיפה, בליעה, ומגע עם עיניים, עור, וקרומים ריריים. התייעץ עם הבטיחות של המוסד בעיסוק ו / או סביבתי ובריאותית מחלקת בריאות להמלצות להפחתת סיכון של חשיפה.
  3. להכפיל את הנפח הכולל של 0.15 כדי לקבוע את עוצמת הקול של sulfoxide דימתיל (DMSO) דרוש (לדוגמא, 16.5 x0.15 = 2.475 מיליליטר DMSO). סנן לעקר כרך זה של DMSO (בתוספת 2 מיליליטר נוסף לחשבון עבור גלישה) דרך מסנן 0.2 מיקרומטר לתוך צינור סטרילי. הוספת 2.475 מ"ל של DMSO סטרילי לאבקת TMZ.
  4. מניחים את פתרון TMZ / DMSO בכוס של מים על צלחת חמה ב 65 מעלות צלזיוס במשך 10-15 דקות. ברגע שTMZ נמס לגמרי, הפתרון צריך להיות בצבע צהוב בהיר בצבע; אם הפתרון הופך ורוד, אז TMZ נפגע, ופתרון חדש צריך להיות מוכן עם הרבה טרי של TMZ.
  5. חשב את הנפח המתאים של תמיסת מלח סטרילית צורך על ידי הכפלת 0.85 על ידי הנפח הכולל (0.85 x 16.5 מיליליטר = 14.025 מיליליטר מלוח). הוסף 15 מיליליטר של תמיסת מלח סטרילית לחרוטי 50 מיליליטר. בעוד TMZ מתמוסס בDMSO, מלוח חום עד 65 מעלות צלזיוס.
  6. וורטקס הפתרון / DMSO TMZ על מנת להבטיח כי אבקת TMZ נמס לגמרי ולאט לאט מוסיפה מלח מחומם לפתרון / DMSO TMZ.
  7. מייד לאחר הכנה, לטעון syring טוברקולין 15 x 1 מיליליטר באופן מלאes עם פתרון TMZ לממשל לעכברי גידול נושאות הוקמו 4 ימים.
  8. חזור על תהליך זה בימים 1 עד 4 עבור הסכום כולל של חמישה ממשלים TMZ.

2. מוח כל הקרנה של עכברים נושאי גידול

ימים 2 עד 4:

  1. כוח על irradiator רנטגן ולאפשר לו להתחמם-עד מתח מלא. ודא שהמסנן המתאים נמצא במקום וקלט המתח הנכון והגדרות הנוכחיות (איור 2 א).
    הערה: dosimetry של irradiator יש לקבוע מראש כדי לקבוע את הגדרות מתח ופריסת רשת (איור 2 א, ב ') המתאים.
  2. חשב את משך זמן שנדרש כדי לגרום 5.5 קרינת רנטגן Gy. לדוגמא, אם צילומי רנטגן מועברים בשיעור של 2 Gy / min, אז 2.75 דקות יש צורך לספק כולל של 5.5 Gy. קלט משך הזמן המתאים.
    הערה: טבלה 2 מספקת עכבר WBI מינוניםnd שווה הקלינית שלהם בבני אדם. בהקשר של גליומות בדרגה גבוהה, 60 Gy מופרד WBI (2 שברים Gy, 5 ימים / שבוע למשך 6 שבועות) הוא התקן של טיפול הקליני, ואת המקבילה העכברית משמשת כאן היא 16.5 Gy (5.5 Gy x 3).
  3. הכן פתרון חדש של קטמין / xylazine להרדמה מערכתית על ידי הוספת 2 מיליליטר קטמין ו1 מיליליטר xylazine ל -17 מיליליטר מלוח כך שהפתרון הסופי הוא 10 מ"ג / מיליליטר קטמין ו1 מ"ג / מיליליטר xylazine.
  4. לשקול עכברים ולנהל 10 μl של קטמין / xylazine intraperitoneally לגרם של משקל גוף כך שבעלי החיים מקבלים מנה של קטמין ב 100 מ"ג / קילוגרם ו -10 מ"ג / קילוגרם xylazine. עכברים צריכים להיות מסוממים באופן מלא וגלוי נשימה בתוך 2 דקות של ממשל / xylazine קטמין.
  5. כדי לשמור על לחות עיניים בבעלי חיים מסוממים, לשפשף בעדינות כמות קטנה של משחה דמעות מלאכותיות בכל עין.
  6. מניחים עכברים מסוממים ברשת כך שהראשים ממוקמים באזור שמקבל את X-ray הגבוה ביותר בדריכות (איור 2 ב, ג). גופי חומת מהצוואר ומטה עם הגודל מתאים צינורות עופרת לחסום משלוח X-ray מערכתי (איור 2 ד).
  7. מניחים עכברים ממוקמים מתחת לקרן רנטגן כך שהליזר המציין את הנקודה של קרן רנטגן המוקד הוא בתיאום (0,0) על פריסת הרשת. בגין משלוח X-ray.
  8. כאשר משלוח X-ray הוא מלא, להסיר חיות מirradiator והמקום על כרית חימום חמה. אל בית חיות מסוממים עם בעלי חיים מודעים עד בעלי חיים שב להכרתו מספיק כדי לשמור recumbence sternal. ברגע שבעלים חיים יכולים לשמור על recumbence sternal, למקם את החיות בהכרה חזרה בכלובים המתאימים שלהם.
  9. חזור על תהליך זה בימים 3 ו -4 בסכום כולל של שלוש מנות מופרדים של קרינה.

3. Transfection

יום -1:

  1. הכן תקשורת D10 על ידי הוספת 50 מיליליטר סרום שור עוברי (FBS) עד 500 מיליליטר של M של Dulbeccoodified נשר בינוני (DMEM).
  2. הכן תקשורת תא T (TCM) על ידי הוספת 5.5 מיליליטר L-גלוטמין, 5.5 מיליליטר פירובט נתרן, 5.5 מיליליטר חומצות אמינו שאינו חיוניות, ושל 5.5 מיליליטר הפניצילין / סטרפטומיצין (עט / סטרפטוקוקוס) 500 מיליליטר תקשורת RPMI-1640. לאחר מכן, להוסיף 550 μl של 2-mercaptoethanol ו -550 גנטמיצין μl. לבסוף, להוסיף 50 מיליליטר FBS.
  3. במבחנה תאי HEK293T תרבותיים קציר ולהביא לריכוז של 7.5 x 10 6 תאים / מיליליטר בתקשורת D10.
  4. צלחת תקשורת 10 מיליליטר D10 ולהוסיף 1 מיליליטר של תרחיף תאי HEK293T בכל 16 x 10 סנטימטרים poly-D- ליזין (PDL) צלחות מצופים.
  5. דגירה הלילה בשעה C ° 37 עם 5% CO 2.

יום 0:

  1. החלף תקשורת עם D10 הטרי 10 מיליליטר דקות לפחות 30 לפני transfecting תאים.
  2. לקבוע את סכום פלסמיד וקטור, וקטור PCL-אקו, ומגיב transfection liposomal נדרש לtransfection על ידי הכפלת המספר הכולל של צלחות + 1 (16 + 1 = 17) על ידי 14.1 מיקרוגרםפלסמיד וקטור (14.1 x 17 = 239.7 מיקרוגרם), 9.9 מיקרוגרם וקטור PCL-אקו (9.9 x 17 = 168.3 מיקרוגרם), ומגיב 60 μl transfection liposomal (60 x 17 = 1,020 μl). כל ריאגנטים צריכים להיות בטמפרטורת חדר לפני הכנת פתרונות.
  3. תווית שני צינורות ו- B. בצינור, להוסיף 239.7 מיקרוגרם פלסמיד וקטור ו168.3 וקטור מיקרוגרם PCL-אקו ל( 1.5 x 17) מיליליטר מופחת סרום שונה בינונית של הנשר (RS-ממ). בצינור B, להוסיף מגיב transfection liposomal 1,020 μl ל( 1.5 x 17) מיליליטר RS-ממ.
  4. דגירה A ו- B בנפרד במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
  5. מערבבים A ו- B יחד בעדינות (מערבולת במשך 1-2 שניות או להפוך כמה פעמים) ודגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת חדר כדי ליצור שומנים / מורכב DNA.
  6. הוסף טיפה מורכבת שומנים / DNA חכם לתאי HEK293T בצלחת 10 סנטימטר.
  7. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 6-8 שעות או למשך לילה (לא יעלה על 24 שעות).
  8. לאחר 6-8 שעות דגירה, להחליף בינוני עם 12 מיליליטר של TCM הטרי לייצור נגיפי. זה מצופה תקשורתישמש ביום 2 בsupernatant ויראלי עבור התמרה תא T.

4. כריתת טחול והכנת תא T

יום 0:

  1. יוצקים 10 מיליליטר של TCM לחרוטי 50 מ"ל ומניחים על קרח לאוסף טחול.
  2. להקריב את המספר המתאים של בעלי חיים על ידי CO 2 מחנק ועריפת ראש המשני: בעלי חיים מקום בכלוב קבלת CO 2 בקצב זרימה של 10-30% נפח / דקת כלוב, בהתאם להנחיות איגוד האמריקאי לרפואת וטרינרית (לא יותר מ 5 בעלי חיים יכולים להיות הקריב בו-זמנית) עד מסתיימת נשימה ובמשך שתי דקות לאחר מכן. הסר בעלי חיים מתא CO 2 ולערוף.
    הערה: טחול אחד C57BL / 6 עכבר נקבת 6-12 בן שבוע יניב כ 4.5-5 x 10 7 splenocytes. כאן, 4 טחולים יהיו לקצור כ 200 x 10 6 תאים.
  3. הנח את העכבר כך שצידו ממני פונה כלפי מעלה, ולרסס עם אתנול 70%. עם המלקחיים, לתפוס קפל דק של עור מתחת לבית החזה השמאלי וחתך חתך קל עם המספריים. לקלף את העור, לתפוס בזהירות לקפל דק של הצפק עם מלקחיים, וחתך חלל קטן.
  4. הטחול הוא איבר קטן, מוארך בצבע אדום כהה שדומה שעועית שטוחה; בעדינות לתפוס את הטחול עם המלקחיים ובלו על ידי חיתוך משם רקמת חיבור שמסביב. מניחים את הטחול נכרת לחרוטים המכילים 10 מיליליטר של TCM על קרח.
  5. יוצקים טחולים מעל מסננת תא רשת 70 מיקרומטר וdisaggregate מוחץ עם הקצה הקהה של החלק הפנימי של מזרק 5 מיליליטר כדי ליצור השעיה תא בודד. מקסימום של שני טחולים צריך להיות מפוצל למסננת רשת.
  6. השתמש בנפח קטן של TCM לשטוף את המסננת הבאה disaggregation לאסוף כל splenocytes שנותר בזהירות. בריכה כל הטחולים המפוצלים להשעית תא בודד. תביא נפח סופי 50 מיליליטר עם TCM לשטיפה אחתד ספין ב XG 300 עבור 10 דקות.
  7. הכן פתרון של מאגר תמוגה 1x ידי הוספת 5 מיליליטר 10x חיץ תמוגה ל 45 מיליליטר מים סטריליים. לחסל את תאי דם אדומים, resuspend גלולה ב 5 מיליליטר של חיץ תמוגה 1x לטחול בחרוטי 50 מיליליטר, ערבבו היטב על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה. אם עולה על 5 טחולים, להשתמש צינור צנטריפוגות 250 מיליליטר. הנח חרוטי או צינור צנטריפוגות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  8. הסר את תגובת תמוגה מאמבט המים ולהוסיף TCM ביחס של 1: 1 עם חיץ תמוגה כדי לנטרל את התגובה. לשטוף על ידי ספינינג ב XG 300 עבור 10 דקות.
  9. לשאוב supernatant וגלול גלול באופן מלא בTCM (2 מיליליטר / טחול, 8 מיליליטר כולל 4 טחולים) על ידי pipetting מעלה ומטה.
  10. ספירת תאים על ידי הוספת 10 μl של השעיה תא 190 μl trypan כחול (01:20 דילול). הכפל את המספר שהתקבל באחד מארבעת הריבועים gridded על ידי 20 x 10 x 4 נפח כולל (8 מיליליטר) להשיג המספר הכולל של התאים (לדוגמא, 125 x 20 x תאים 10 4 x 8 מיליליטר = 200 x 10 6 splenocytes).
  11. לדלל תאים בריכוז של 2 x 10 6 תאים / מיליליטר בTCM, בתוספת 2 מיקרוגרם / מיליליטר concanavalin (ConA) ו -50 IU / interleukin-2 אנושיים רקומביננטי מיליליטר (rhIL-2). כך, 200 x 10 6 splenocytes, להוסיף 92 מיליליטר תקשורת עד 8 ​​מיליליטר תאים, 200 מיקרוגרם ConA, ו5,000 IU rhIL-2.
  12. הוסף 2 מ"ל תאים היטב בכל צלחות רקמות תרבות 24 גם טופלו, כך ש4 x 10 6 תאים היטב בכל אחד (לדוגמא, תאי 100 מיליליטר ידרוש כ 4 צלחות).
  13. דגירה הלילה בשעה C ° 37 עם 5% CO 2.

5. התמרה

יום 1:

  1. לחשב את מספר התרבות הלא-רקמה שטופל 24 גם צלחות דרושות לתמרה על ידי הכפלת מספר הטחולים שנקטפו על ידי 2 (8 צלחות נדרשות ל4 טחולים).
  2. בשלב הבא, לחשב את הנפח הנדרש של בר פיברונקטין האנושי רקומביננטי פתרון (RHFF)צריך צלחות מעיל על ידי הכפלה (מספר הכולל של בארות + 3) x 0.5 מיליליטר (8 צלחות x 24 בארות = 192 + 3 = 195) x 0.5 מיליליטר = 97.5 מיליליטר.
  3. הכן 97.5 מיליליטר פוספט שנאגרו מלוח (PBS) המכיל RHFF בריכוז של 25 מיקרוגרם / מיליליטר על ידי הכפלת הנפח הכולל של 25 מיקרוגרם (97.5 x 25 = 2,437.5 מיקרוגרם). להוסיף סכום זה של RHFF ל97.5 מיליליטר PBS.
  4. תרבות הלא-רקמת מעיל טופלה 24 גם צלחות על ידי הוספת 0.5 מיליליטר פתרון PBS / RHFF בכל טוב.
  5. דגירה הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.

יום 2:

  1. לזרוק את פתרון PBS / RHFF מהתרבות הלא-רקמה שטופל 24 גם צלחות.
  2. הוסף 1 מיליליטר / גם אלבומין 2% בסרום שור (BSA) בPBS ודגירה בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות.
  3. הסר BSA על ידי תקיפות הפיל את הצלחת. לשטוף ידי הוספת 2 מיליליטר PBS.
  4. איסוף supernatant הנגיפי על ידי העברת תקשורת מכל צלחת PDL HEK293T לתוך צינור 250 מיליליטר צנטריפוגות ולסובב 10 דקות ב 500 x גרם.
  5. להעביר בזהירות su הנגיפיpernatant לתוך צינור צנטריפוגות 250 מיליליטר טרי, להיות בטוח שלא להפריע התא גלולה שאולי נוצר.
  6. להוסיף TCM הטרי לsupernatant ויראלי כך שהנפח הסופי הוא 3 מיליליטר יותר מהסכום הדרוש לבארות מצופות RHFF. לדוגמא, עבור 192 בארות מצופות RHFF, להביא את הנפח של supernatant ויראלי 192 מיליליטר + 3 = 195 מיליליטר.
  7. הסר splenocytes התרבותי מן החממה והגלולה על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה 2 - 3 פעמים בכל טוב. העברה לחרוטי 250 מיליליטר. אם בעזרת פיפטה רבה, תוך שימוש במאגר סטרילי לפני ההעברה יעזור לזרז את הצעד הזה. ספירה כפי שתואר לעיל וספין ב XG 300 עבור 10 דקות.
  8. להוסיף rhIL-2 לsupernatant ויראלי בריכוז של 50 IU / ml. לדוגמא, להוסיף 50 x 195 = 9,750 IU rhIL-2-195 מיליליטר של supernatant ויראלי.
  9. Resuspend splenocytes בsupernatant ויראלי ב1 x 10 6 תאים / מיליליטר
  10. הוסף 1 מיליליטר / היטב ההשעיה splenocyte לצלחות 24 גם מצופות RHFF.
  11. ספין למשך 90 דקות על פי ההגדרות הבאות: 770 XG, תאוצה = 4, בלם / האטה = 0, 32 ° C.
  12. הכן פתרון TCM עם 50 IU / ml rhIL-2. לדוגמא, להכין פתרון TCM 200 על ידי הוספת 10,000 IU rhIL-2. הוסף 1 מיליליטר של rhIL-2 / TCM היטב כל אחד לאחר צנטריפוגה.
  13. תרבות הלילה בשעה 37 ° C ב 5% CO 2.

6. CAR תא T תרבות וקציר

ימים 3 ו -4:

  1. אם תאי T להשיג> מפגש 80%, תאים עשויים להיות מפוצלים (זה קורה בדרך כלל ביום 3 או 4 ימים). כדי לפצל תאים, בעדינות pipet למעלה ולמטה בכל טוב 2-3 פעמים, ולהעביר 1 מיליליטר מכל טוב לבארות חדשות של צלחת 24 גם טרי רקמות תרבות שטופלה. לאחר מכן, להוסיף 1 מיליליטר של TCM הטרי עם 50 IU IL-2 מיליליטר / היטב כל אחד כך שנפח סופי הוא 2 מיליליטר בכל הבארות.
  2. אם תאים אינם מגיעים למפגש> 80%, לבצע שינוי תקשורת מחצית על ידי pipetting לאט את 1 מיליליטר של תקשורת מהחלק העליון של כל אחד. הימנע דisturbing תאים התיישבו על הקרקעית תוך הסרת תקשורת. הוסף 1 מיליליטר של TCM הטרי המכיל 50 IU / ml rhIL-2.

יום 5:

  1. Resuspend CAR T תאים על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה 3 פעמים בכל טוב ולהעביר צינור צנטריפוגות 250 מיליליטר. ספין תאים ב XG 300 עבור 10 דקות.
  2. supernatant לחלוטין לשאוב מבלי להפריע גלולה. שטפי פעם עם PBS, לספור תאים כפי שתואר לעיל, ולשטוף עם PBS בפעם שנייה. תשואת תא T CAR טיפוסית היא כ 1 x 10 6 תאים לכל היטב (8 צלחות תאי x 24 בארות = 192 x 10 6 T CAR).
  3. תאים גלולים בPBS בריכוז של 5 x 10 7 / מיליליטר להזרקה של 1 x 10 7 בנפח של 200 מיקרוגרם (לדוגמא, עבור 192 x 10 6 תאי T CAR, resuspend שטפו גלולה ב3.84 מיליליטר PBS).

7. CAR מנהל תא T לעכברי נושאי גידול

יום 5:

  1. Transpoתאי rt על קרח למתקן בעלי חיים להזרקה תוך ורידית. עומס 500-1,000 μl לתוך מזרק אינסולין עם 27-31 מחט G, להבטיח כי כל הבועות מגורשות.
  2. תפוס את העכבר בבסיס הזנב ולמקם בעוצר צינור.
  3. משוך את הזנב מתוח עם הווריד פונה כלפי מעלה, ולהחליק את המחט כ 1-2 מ"מ מתחת לעור לתוך הווריד על ידי הכנסתו במקביל לוריד הזנב. לאט לגרש 200 μl לווריד. אם המחט מוכנסת כהלכה לתוך הווריד, הנפח יהיה בקלות לזרום ב; אחרת תהיה התנגדות ואת המחט צריכה להיות מוסר מהזנב ומחדש הוכנס בצורה נכונה.

תוצאות

תאי T CAR מופקים על ידי התמרה עם וקטור retroviral EGFRvIII CAR 11. וקטור זה, MSGV1, פותח מוקטור SFGtcLuc_ITE4 35, המכיל את הווירוס בתאי גזע העכבריים (MSCV) חוזר מסוף ארוך, אזור איסור פרסום ואתר שחבור מעטפה המורחב (תורם אחוי, SD, ואחוי acceptor, sa), וויראלי אות אריזה (ψ). CAR EGFRvIII מכיל בר האדם אנט?...

Discussion

ציר זמן הטיפול המתואר כאן נועד מודל הסטנדרטי של טיפול קליני ולמנף את השפעתו לטיפול מאמצת CAR. מינוני CAR T תא, משטרי TMZ, וממשל הקרנות יכולים להיות שונה כדי לשפר את הפעילות בvivo T תא, lymphodepletion, והרג גידול. ניתן להגדיל משטרי TMZ להניב myeloablation מארח והתרחבות מוגברת של תאים הוע?...

Disclosures

The authors have no conflicts of interests to declare.

Acknowledgements

The authors would like to acknowledge Dr. Laura Johnson and Dr. Richard Morgan for providing the CAR retroviral construct. The authors also thank Giao Ngyuen for her assistance with dosimetry for whole brain irradiation. This work was supported by an NIH NCI grant 1R01CA177476-01.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
pCL-Eco Retrovirus Packaging VectorImgenex10045PHelper vector for generating CAR retrovirus
Concanavalin ASigma AldrichC2010Non-specific mitogen to induce T cell proliferation and viral transduction
RetronectinClonTech/TakaraT100BFacilitates retroviral transduction of T cells
Lipofectamine 2000Life Technologies11668-019Transfection reagent
DMEM, high glucose, pyruvateLife technologies11995-065HEK293 culture media
RPMI 1640Life Technologies11875-093T cell culture media
Opti-MEM I Reduced Serum MediumLife technologies11058-021Transfection media
200 mM L-GlutamineLife technologies25030-081T cell culture media supplement
100 mM Sodium PyruvateLife technologies11360-070T cell culture media supplement
100X MEM Non-Essential Amino Acids SolutionLife technologies11140-050T cell culture media supplement
55 mM 2-MercaptoethanolLife technologies21985-023Reducing agent to remove free radicals
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)Life technologies15140-122T cell culture media supplement
Gentamicin (50 mg/ml)Life technologies15750-060T cell culture media supplement
GemCell U.S. Origin Fetal Bovine SerumGemini Bio Products100-500Provides growth factors and nutrients for in vitro cell growth
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V–Standard GradeGemini Bio Products700-100PBlocks non-specific binding of retrovirus to retronectin-coated plates
Pharm Lyse (10x concentrate)BD Biosciences555899Lyses red blood cells during splenocyte processing
70 μm Sterile Cell StrainersCorning352350Filters away large tissue particles during splenocyte processing
100 mm BioCoat Culture Dishes with Poly-D-LysineCorning356469Promotes HEK293 cell adhesion to maximize proliferation after transfection
[header]
TemozolomideBest PharmatechN/ALyophilized powder prepared on the day of administration
Dimethyl SulfoxideSigma Life SciencesD2650Necessary for complete dissolution of temozolomide
SalineHospiraIM 0132 (5/04)Solvent for temozolomide and ketamine/xylazine
Ketathesia HClHenry Schein Animal Health11695-0701-1Ketamine solution
AnaSedLloyd IncN/AXylazine sterile solution 100 mg/ml

References

  1. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).
  2. Kantoff, P., Higano, C., Shore, N., Berger, E., Small, E. Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer. N Engl J Med. (363), 411-422 (2010).
  3. Hodi, F. S., et al. Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma. N Engl J Med. 363 (8), 711-723 (2010).
  4. Schwartzentruber, D. J., et al. gp100 peptide vaccine and interleukin-2 in patients with advanced melanoma. N Engl J Med. 364 (22), 2119-2127 (2011).
  5. Gross, G., Gorochov, G., Waks, T., Eshhar, Z. Generation of effector T cells expressing chimeric T cell receptor with antibody type-specificity. Transplant Proc. 21 (1 Pt 1), 127-130 (1989).
  6. Pule, M. A., et al. Virus-specific T cells engineered to coexpress tumor-specific receptors: persistence and antitumor activity in individuals with neuroblastoma. Nat Med. 14 (11), 1264-1270 (2008).
  7. Kochenderfer, J. N., et al. B-cell depletion and remissions of malignancy along with cytokine-associated toxicity in a clinical trial of anti-CD19 chimeric-antigen-receptor-transduced T cells. Blood. 119 (12), 2709-2720 (2012).
  8. Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N Engl J Med. 365 (8), 725-733 (2011).
  9. Brentjens, R. J., et al. Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias. Blood. 118 (18), 4817-4828 (2011).
  10. Wikstrand, C. J., et al. Monoclonal antibodies against EGFRvIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas and malignant gliomas. Cancer Res. 55 (14), 3140-3148 (1995).
  11. Sampson, J. H., et al. EGFRvIII mCAR-modified T-cell therapy cures mice with established intracerebral glioma and generates host immunity against tumor-antigen loss. Clin Cancer Res. 20 (4), 972-984 (2014).
  12. Kuppner, M. C., Hamou, M. F., Sawamura, Y., Bodmer, S., de Tribolet, N. Inhibition of lymphocyte function by glioblastoma-derived transforming growth factor beta 2. J Neurosurg. 71 (2), 211-217 (1989).
  13. Wintterle, S., et al. Expression of the B7-related molecule B7-H1 by glioma cells: a potential mechanism of immune paralysis. Cancer Res. 63 (21), 7462-7467 (2003).
  14. Fecci, P. E., et al. Increased regulatory T-cell fraction amidst a diminished CD4 compartment explains cellular immune defects in patients with malignant glioma. Cancer Res. 66 (6), 3294-3302 (2006).
  15. Wilmotte, R., et al. B7-homolog 1 expression by human glioma: a new mechanism of immune evasion. Neuroreport. 16 (10), 1081-1085 (2005).
  16. Yang, B. C., et al. Mediation of enhanced transcription of the IL-10 gene in T cells, upon contact with human glioma cells, by fas signaling through a protein kinase A-independent pathway. Journal of Immunology. 171 (8), 3947-3954 (2003).
  17. Reilly, S. M., et al. Temozolomide: a new oral cytotoxic chemotherapeutic agent with promising activity against primary brain tumours. Eur J Cancer. 29A (7), 940-942 (1993).
  18. Newcomb, E., et al. The Combination of Ionizing Radiation and Peripheral Vaccination Produces Long-term Survival of Mice Bearing Established Invasive GL261Gliomas. Clin Cancer Res. 12, 4730-4737 (2006).
  19. Park, B., Yee, C., Lee, K. M. The effect of radiation on the immune response to cancers. Int J Mol Sci. 15 (1), 927-943 (2014).
  20. Fritzell, S., et al. Intratumoral temozolomide synergizes with immunotherapy in a T cell-dependent fashion. Cancer Immunol Immunother. 62 (9), 1463-1474 (2013).
  21. Park, S. D., et al. Cross-priming by temozolomide enhances antitumor immunity of dendritic cell vaccination in murine brain tumor model. Vaccine. 25 (17), 3485-3491 (2007).
  22. Emens, L. A., Jaffee, E. M. Leveraging the activity of tumor vaccines with cytotoxic chemotherapy. Cancer Res. 65 (18), 8059-8064 (2005).
  23. Murphy, K. A., et al. An in vivo immunotherapy screen of costimulatory molecules identifies Fc-OX40L as a potent reagent for the treatment of established murine gliomas. Clin Cancer Res. 18 (17), 4657-4668 (2012).
  24. Newcomb, E. W., et al. Radiotherapy enhances antitumor effect of anti-CD137 therapy in a mouse Glioma model. Radiat Res. 173 (4), 426-432 (2010).
  25. Su, Y. B., Krown, S. E., Livingston, P. O., Wolchok, J. D., Chapman, P. B. How lymphotoxic is dose-intensified temozolomide? The glioblastoma experience. J Clin Oncol. 23 (18), 4235-4236 (2005).
  26. Neyns, B., Tosoni, A., Hwu, W. J., Reardon, D. A. Dose-dense temozolomide regimens: antitumor activity, toxicity, and immunomodulatory effects. Cancer. 116 (12), 2868-2877 (2010).
  27. Muranski, P., et al. Increased intensity lymphodepletion and adoptive immunotherapy-how far can we go. Nat Clin Pract Oncol. 3 (12), 668-681 (2007).
  28. Wrzesinski, C., Restifo, N. P. Less is more: lymphodepletion followed by hematopoietic stem cell transplant augments adoptive T-cell-based anti-tumor immunotherapy. Current Opinion in Immunology. 17 (2), 195-201 (2005).
  29. Dudley, M. E., et al. Adoptive cell therapy for patients with metastatic melanoma: evaluation of intensive myeloablative chemoradiation preparative regimens. J Clin Oncol. 26 (32), 5233-5239 (2008).
  30. Sanchez-Perez, L. A., et al. Myeloablative Temozolomide Enhances CD8(+) T-Cell Responses to Vaccine and Is Required for Efficacy against Brain Tumors in Mice. Plos One. 8 (3), (2013).
  31. Su, Y. B., et al. Selective CD4+ lymphopenia in melanoma patients treated with temozolomide: a toxicity with therapeutic implications. J Clin Oncol. 22 (4), 610-616 (1200).
  32. Dummer, W., et al. T cell homeostatic proliferation elicits effective antitumor autoimmunity. J Clin Invest. 110 (2), 185-192 (2002).
  33. Gattinoni, L., et al. Removal of homeostatic cytokine sinks by lymphodepletion enhances the efficacy of adoptively transferred tumor-specific CD8+ T cells. J Exp Med. 202 (7), 907-912 (2005).
  34. Wrzesinski, C., et al. Increased intensity lymphodepletion enhances tumor treatment efficacy of adoptively transferred tumor-specific T cells. J Immunother. 33 (1), 1-7 (2010).
  35. Hughes, M. S., et al. Transfer of a TCR gene derived from a patient with a marked antitumor response conveys highly active T-cell effector functions. Hum Gene Ther. 16 (4), 457-472 (2005).
  36. Morgan, R. A., et al. Recognition of glioma stem cells by genetically modified T cells targeting EGFRvIII and development of adoptive cell therapy for glioma. Hum Gene Ther. 23 (10), 1043-1053 (2012).
  37. Kerkar, S. P., et al. Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies. J Immunother. 34 (4), 343-352 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

96chimerictemozolomide

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved