כולסטרול מקרופאג דלדול והשפעתו על phagocytosis של<em&gt; Neoformans קריפטוקוקוס</em

Summary

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

Abstract

Cryptococcosis הוא זיהום מסכן חיים הנגרם על ידי פטריות פתוגניים של הסוג קריפטוקוקוס. זיהום מתרחש על שאיפה של נבגים, אשר מסוגלים לשכפל בריאה העמוקה. Phagocytosis של קריפטוקוקוס על ידי מקרופאגים הוא אחת הדרכים שהמחלה יכולה להתפשט למערכת העצבים המרכזית לגרום meningoencephalitis הקטלני. לכן, מחקר של הקשר בין קריפטוקוקוס ומקרופגים הוא חשוב להבנת ההתפתחות של הזיהום. המחקר הנוכחי מתאר פרוטוקול צעד-אחר-צעד כדי ללמוד infectivity מקרופאג ידי ג neoformans במבחנה. השימוש בפרוטוקול זה, התפקיד של סטרולים מארח על אינטראקציות מארח הפתוגן הוא למד. ריכוזים שונים של מתיל - cyclodextrin (MCD) שמשו לרוקן את הכולסטרול מJ774A.1 שורת תאים העכברי סרקומה הרשתית כמו מקרופאג. כולסטרול הדלדול אושר ולכמת באמצעות שני מסחרי availablערכת דואר כימות כולסטרול וכרומטוגרפיה בשכבה דקה. תאי כולסטרול מדולדל הופעלו באמצעות Lipopolysacharide (LPS) ואינטרפרון גאמא (IFNγ) ונגועים בneoformans קריפטוקוקוס-opsonized נוגדן תאי H99 wild-type ביחס מפעיל ליעד של 1: 1. תאים נגועים היו במעקב אחרי 2 שעות של דגירה עם ג neoformans ומדד phagocytic חושב. כולסטרול דלדול הביא לירידה משמעותית במדד phagocytic. הפרוטוקולים שהוצגו מציעים שיטה נוחה לחקות את תחילת תהליך הזיהום בסביבת מעבדה וללמוד את התפקיד של הרכב שומנים מארח על infectivity.

Introduction

Phagocytosis הוא תהליך שבו גופים תאיים מופנמים על ידי תאי מארח. זהו נשק מרכזי בארסנל של מערכת החיסון להגן מפני פתוגנים, אך התהליך עשוי לעתים קרובות להיות חתר תחת ידי פתוגנים כדי לאפשר להפנמה ולהתפשט בכל הגוף ^1. Phagocytosis מתווך על ידי מספר אירועי איתות שיביאו להתקשרות ובליעה באמצעות ארגון מחדש של שלד התא של התא המארח. phagocytes 'המקצועית' מסוגל לזהות ולהיקשר לopsonins על פני השטח של הפולש לאותת להתקשרות והיווצרות lamellipodia, אשר לבלוע את הפתוגן ויוצר phagosome ^2. בין phagocytes "המקצועי" שנקרא מקרופאגים. המקרופאגים הם תאים מאוד מיוחדים שיבצעו את התפקידים הגנתיים הכוללים לחפש וביטול גורמי מחלה גורמת, תיקון רקמות שנפגעו, ומתווך דלקת, רובאלה בתהליך של phagocytosis ^1,2.

neoformans קריפטוקוקוס הוא מינים של שמרים פתוגניים שגורם למחלה קשה הידועה בשם Cryptococcosis. נבגי קריפטוקוקוס הם נשאפים על ידי המארח ולגרום לדלקת ריאות שהיא בדרך כלל ללא תסמינים. הוא חשב כי החשיפה היא מאוד נפוצה; מדגם של 61 ילדים ממחל זיהומיות בילדי קליניקה במרכז בית החולים בברונקס-לבנון מצאה כי כל שהשתתפו בסקר היו אלה נוגדנים לglucuronoxylomannan פוליסכריד cryptococcal ומחקרים אחרים הראה שכיחות בשני וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) נגוע ומבוגרים נגועים ^{3, 4.} מקרופאגים מכתשיים הם הקו הראשון של תגובה לדלקת ריאות וברוב המקרים בהצלחה ברור הפתוגן. עם זאת, אצל אנשים מדוכאי חיסון (חולים למשל, HIV ואיידס) השמרים הוא מסוגלים לשרוד בתוך מקרופאגים. באלהמקרים, מקרופאגים יכולים לשמש כנישה לשכפול של הפתוגן ועשויים להקל על הפצתו למערכת העצבים המרכזית (CNS) שבו המחלה הופכת קטלנית ^5-8. הוא חשב כי מקרופאגים אולי אפילו לספק את השמרים ישירות לתוך קרומי המוח, עוזרים השמרים לחצות את מחסום דם המוח באמצעות המודל "סוס טרויאני" ^{3,9 - 11.} לפיכך, חשוב להבין את התהליך של phagocytosis וגורמים המשפיעים עליו, בעיקר בזיהומי cryptococcal.

העבודה קודמת במערכות פתוגן אחרות מצביעה על רפסודות כולסטרול ושומנים בדם נוצרות על ידי כולסטרול כבעל תפקיד חשוב בphagocytosis ^{12 - 15.} כולסטרול הוא מיני שומנים הנפוצים ביותר בתאי יונקים וכולל 25-50% מקרום התא היונקים ^16. זה כבר נמצא לשחק תפקיד בויסות הביופסיהמאפייני hysical של ממברנות על ידי שינוי קשיחותם ^17. כולסטרול וsphingolipids יחד יוצרים microdomains שומנים בתוך הקרום הידוע כרפסודות שומנים בדם. רפסודות שומנים בדם נמצאו להיות מעורבת בהיווצרות caveolae, כמו גם מתן תחום מבודד לסוגים מסוימים של איתות ^16-18. בשל גודלם הקטן, שקשה ללמוד רפסודות שומנים בגוף חי. דרך שימושית אחד כדי ללמוד את התפקיד של רפסודות שומנים היא לשנות בוחריהם. מתיל-β-cyclodextrin (MβCD) היא תרכובת שנמצאה לרוקן את הכולסטרול מקרומי יונקים ומשמש בדרך כלל כדי ללמוד את התפקיד של רפסודות שומנים ^18.

בפרוטוקול זה, אנו מציגים שיטה לרוקן את הכולסטרול מקרום תא מארח ולכמת את ההשפעה של הדלדול ביכולתם של תאי המארח לphagocytose ג neoformans במבחנה. הליך זה עושה שימוש בתרבית תאי techniques על מקרופאג הונצח כמו שורת תאים (J774A.1) כמודל לזיהום. כולסטרול דלדול הושג על ידי חשיפה לMβCD, שבו יש ליבה הידרופובי ספציפית לגודל של סטרולים והוא מסוגל לפעול ככיור לכולסטרול לצייר מתוך הקרום ^19. כולסטרול דלדול נמדד כמותית באמצעות ערכה זמינה מסחרי ואיכותי באמצעות שאיבת שומנים בליי-דייר שונה ואחריו כרומטוגרפיה שכבה דקה (TLC) ^20. . Phagocytosis נמדד על ידי הדבקה של תא הקו עם תרבות של שמרי opsonized מעורבבים עם קוקטייל של אינטרפרון-γ וlipopolysaccharide להפעלת מקרופאגים קריפטוקוקוס היה opsonized באמצעות נוגדן glucuronoxylomannan (GXM) ^{21 - 23.} מכתים וניסויים במיקרוסקופ אפשרו להדמיה של התאים וחישוב מדד phagocytic להעריך את מידת הרס עצמי. יחדיו, ד פרוטוקול זהescribes שיטה בסיסית, המשלבת את שינוי הרכב שומנים בדם עם תהליך פיסיולוגי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. כולסטרול דלדול של תאי J774A.1 עם MβCD

1. בארון בטיחות ביולוגי סטרילי, תאים כמו מקרופאג-10 ⁵ J774A.1 זרע לכל גם על צלחת תרבית תאי 96-גם ב -200 μl של הנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM) בתוספת סרום 10% שור עוברי (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין (P / S). לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ O / N.
2. הסר את המדיה מmonolayer התא ולשטוף את התאים פעמיים עם פוספט 1x שנאגרו (PBS) שסונן או autoclaved.
3. הוסף 200 μl של פתרון MβCD בריכוז הרצוי (10 מ"מ או 30 מ"מ בPBS) או 1x PBS כביקורת דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם רעד. הסר supernatant ובמילואים בRT לניתוח כמותי עם ערכה זמינה מסחרי ביצוע ההליך באופן מיידי.
4. שוטף את התאים פעמים עד שלוש פעמים עם 1x PBS או בסרום ללא DMEM ולהמשיך בתאי דלקת או lyse ידי pipetting פעמים עד שלוש פעמים עם H ₂ O deionized לניתוח עם כרומטוגרפיה בשכבה דקה או עם ערכה.
   הערה: בעקבות דלדול כולסטרול יכול לשמש ערכת כימות כולסטרול זמינה מסחרי. ראה סעיף חומרים לפרטים. עקוב אחר ההוראות של היצרן כפי שנכתב.

2. תצפית של כולסטרול תוכן על ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC)

1. לשטוף טנק TLC פעמיים עם אצטון ופעם אחת עם פתרון של אתר נפט: אתר diethyl: חומצה אצטית (65: 30: 1 על ידי נפח). להרוות את המכל באתר הנפט: אתר diethyl: חומצה אצטית (65: 30: 1 על ידי נפח) פתרון ולהשאיר O / N.
   יש להשתמש תמיד ממסים אורגניים תחת מנדף כדי למנוע שאיפה של אדים: הערה. כפפות ומעייל מעבדה צריכים להיות משוחק בכל העת. חומצה אצטית היא חומצה חזקה ויש להשתמש בזהירות.
2. בארון בטיחות ביולוגי סטרילי, זרע 10 תאים כמו ^{מקרופאג-6} J774A.1 לכל גם בce 6-גםצלחת תרבות ll בנפח של 5 מיליליטר של DMEM החם בתוספת 10% FBS ו -1% P / S. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ O / N.
3. רוקן מקרופאגים של כולסטרול על ידי ביצוע צעדים 1.2-1.4, החלפת 1 מיליליטר ל -200 μl ישים כדי להסביר את הגודל גם הגדול יותר.
4. הוסף 500 μl של טריפסין-EDTA היטב כל אחד, דגירה של 3 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, ובעדינות לגרד תאים עם מגרד תא.
5. להעביר לתוך צינור microfuge ולהוסיף 500 μl נוסף של DMEM החם בתוספת 10% FBS ו -1% P / S.
6. ספין התאים למשך 5 דקות ב XG 300 ולהסיר את supernatant.
7. להוסיף 500 μl נוסף של DMEM החם בתוספת 10% FBS ו -1% P / S לתא גלולה וresuspend בקפידה על ידי pipetting מעלה ומטה.
8. הסר 10 μl של תאים ולספור תאים על hemocytometer. לנרמל את ריכוזי תא מכל מדגם ולהוסיף מספר שווה של תאים לצינורות זכוכית.
   הערה: בשלב זה, במאי אחדלבחור לשלב תאים מאותו קבוצות הטיפול לקבלת תמצית שומנים סופיות מרוכזת יותר.
9. תאי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות על RT ולהסיר תקשורת.
10. הוסף 2 מיליליטר של מתנול ומערבולת. לאחר מכן, להוסיף 1 מיליליטר של כלורופורם ומערבולת. בדוק את מצב השלב לוודא הפתרון בmonophasic.
    הערה: ניתן לאחסן צינורות על 4 מעלות CO / N.
11. צנטריפוגה ב1,700 XG במשך 10 דקות ב RT ולהעביר את supernatant לצינור חדש
12. להוסיף 1 מיליליטר נוסף של כלורופורם ואחריו 1 מיליליטר של DH ₂ O. מערבולת פעמיים למשך 30 שניות. צנטריפוגה ב1,700 XG במשך 5 דקות בRT.
13. שוקל שפופרת זכוכית על איזון עדין ולהשתמש בזכוכית פיפטה פסטר להעביר את השלב נמוך יותר לתוך צינור הזכוכית של משקל ידוע.
14. ייבש את שומנים במאייד צנטריפוגלי עד (כ 2 שעות) יבשות. שוקל צינור עם שומנים מיובשים ולחשב את משקל השומנים היבש.
    הערה: שומנים יבשים יכולה להיות מאוחסן ב-20 ° C עד מוכן לבצע TLC.
15. לדלל שומנים מיובשים בכלורופורם מספיק כדי לנרמל את הריכוז של שומנים בדם (בדרך כלל 20-50 μl) ועומס 20 μl של השומנים בדם המדולל על צלחת TLC סיליקה. עומס 20 מיקרוגרם של הכולסטרול בדילול מלא 20 μl של כלורופורם כסטנדרט.
16. להוסיף צלחת TLC מיובשת למכל הרווי TLC ולאפשר ממס להעביר עד 1 סנטימטר לפני קצה צלחת. הסר את צלחת TLC מהטנק ולאפשר לו להתייבש כ -5 דקות.
17. דמיינו שומנים על ידי הצבת בטנק אדי יוד כדי לבדוק הגירה. הסר ולאפשר כתמים לדעוך במשך כ 10 - 15 דקות מתחת למכסת המנוע.
    הערה: יוד הוא מפגע שאיפה. להשתמש תמיד מתחת למכסת מנוע קטר.
18. הכן פתרון מכתים שומנים ניטראליים על ידי שילוב של 60 מיליליטר של מתנול עם 60 מיליליטר של H ₂ O deionized, 4 מיליליטר של חומצה גופרתית, ו 630 מ"ג כלוריד מנגן.
19. לאט ובזהירות לטבול את צלחת TLC לפתרון מכתים שומנים הניטרלי במגש ולהסיר ללא השלת מעליה את l סיליקהאייר.
    הערה: הפתרון מכתים שומנים הניטרלי ניתן לעשות שימוש חוזר מספר פעמים וכך שניתן לשלוף אותו מהמגש והניח בחזרה בבקבוק לשימוש מאוחר יותר.
20. לאפשר צלחת לייבוש מתחת למכסת המנוע בRT עד שכל הבועות נעלמו. מחממים את צלחת TLC על סט גוש חום 160 מעלות צלזיוס וchar לצבע הרצוי.
    הערה: תכנית צפיפות כגון LS עבודות חזון יכולה לשמש כדי לכמת את הלהקות החרוכות כדי להשוות דגימות שומנים.

3. זיהום של המקרופאגים עם ג neoformans (H99)

1. בארון בטיחות ביולוגי סטרילי, זרע 10 תאים דמויי מקרופאג ⁵ בכל טוב בצלחת תרבית תאי 96-גם ב -200 μl של DMEM בתוספת 10% FBS ו -1% P / S. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2, 5% CO ₂ O / N.
   הערה: זיהום יכול להיעשות גם בזכוכית תחתית מנות confocal הדמיה קלה יותר; כל הסכומים יישארו זהים.
2. לגדול תרבות של ג neoformans (H99)על ידי inoculating 10 מיליליטר של YNB עם מושבה אחת שהתקבלה מצלחת פגעה ודוגר זה O / N ב 30 מעלות צלזיוס עם רעד.
3. לשטוף ולספור C. neoformans תאים (H99).
   1. צנטריפוגה ג תרבות neoformans O / N ב1,700 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
   2. הסר תקשורת וזורקים. לשטוף את התאים עם 5 מיליליטר של 1x PBS. צנטריפוגה ב1,700 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
   3. הסר PBS ולשטוף עם 5 מיליליטר של PBS 1x המסונן. צנטריפוגה ב1,700 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. חזור על פעולה זו 2 פעמים יותר.
   4. הסר PBS ו resuspend ב 5 מיליליטר של 1x PBS.
   5. הפוך דילול סדרתי בPBS להשיג דילול 1: 500 של התרבות שטפה.
      1. הוספה של המדגם המקורי 100 μl 900 μl של 1x PBS להשיג דילול 1:10.
      2. הוספה של 1:10 מדגם מדולל 100 μl 900 μl של 1x PBS להשיג דילול 1: 100.
      3. הוסף 200 μl של 1: המדגם המדולל 100 עד 800 μl של 1x PBS להשיג 1: diluti 500ב
   6. קח 10 μl של 1: 500 דילול ולסמוך על hemocytometer כדי לחשב את מספר התאים.
4. הכן פתרון עובד להפעלת מקרופאגים וopsonizing ג neoformans.
   1. לדלל LPS ו100x IFNγ מפתרונות מניות על ידי הוספת 10 μl 990 μl.
      הערה: LPS וIFNγ משמשים כדי לשפר את ספיגת phagocytic אך אינם נדרשים לphagocytosis. אם יש עניין בפעילות קוטלי פטריות של מקרופאגים, לבצע O ההפעלה / N על 37 מעלות צלזיוס עם רעד לפני ההדבקה.
   2. לדגימה לשלב 7.5 μl של LPS המדולל, 1.25 μl של IFNγ המדולל, 1.25 μl של נוגדן GXM והנפח של ג תרבות neoformans שנותנת 1.25 x 10 ⁵ תאים. תביא נפח עד 250 μl מוכפל במספר הדגימות עם DMEM בתוספת 10% FBS ו -1% P / S.
   3. מערבולת דגירה פתרון למשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם רעד.
      הערה:כולסטרול דלדול (שלבים 1.2-1.4) יכולים להיעשות במקביל לצעד opsonization. הקפד לטפל מקרופאגים לפני שילוב הפתרון עובד, כצריכים בצורה אופטימלית לשמש תאי opsonized לא יותר מ -20 דקות הבאות הדגירה צעד 3.4.3.
5. להדביק המקרופאגים
   1. מקרופאגים שטפו פעמיים עם הסרום ללא DMEM ולהוסיף 200 μl של ג opsonized neoformans עובד פתרון לכל אחד.
   2. דגירה עבור שעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס.
6. תאים לתקן וכתם
   1. הסר מדיה ולשטוף תאים 2 פעמים עם DMEM.
   2. האוויר יבש monolayer התא במשך 10 דקות ולהוסיף 200 μl של מתנול הקר כקרח כדי לתקן את התאים.
   3. דגירה במשך 15 דקות ב RT ולהסיר כל מתנול שנותר.
   4. הוסף 200 μl של 10x Giemsa ודגירה של 5 דקות ב RT.
   5. לשטוף 2 - 3 פעמים במים ללא יונים וO היבש / N עם פקק.
      הערה: הדמיה ניתן לעשות ביום שלמחרת או עד followi שבועצביעת ng.
7. דמיינו והרוזן
   1. באמצעות מיקרוסקופ, לספור 300 תאים לכל נקודת נתונים (אם יש 2 של אותו הטיפול לספור 150 לכל טוב) ורשום את המספר של מקרופאגים הנגועים ומספר תאי קריפטוקוקוס נבלעו.
      הערה: כדי להבטיח אפילו דגימה לשימוש נקודת נתונים 2 צלחות לכל מצב, לבחור 3 אזורים שאינם חופפים לכל צלחת ולספור 50 תאים לכל אזור.
   2. חישוב מדד phagocytic על ידי הכפלת השיעור של מקרופאגים הנגועים במספר הממוצע של ג neoformans למקרופאג. לנרמל מדד phagocytic בהבעת ערכים כאחוז מPBS 1x טופל שליטה. לאחר כמה ניסויים לחשב את הערך הממוצע וסטיית התקן של הממוצע כדי לקבוע מגמות במדד phagocytic. השתמש במבחן t תלמיד כדי לקבוע משמעות.
   3. קח micrographs של תאים ב1,000X או הגדלת 400X.

4. Trypan הכחול Assay

1. בארון בטיחות ביולוגי סטרילי, זרע 10 ⁶ תאים כמו מקרופאג-לכל גם על צלחת תרבית תאי 6 גם בנפח של 5 מיליליטר של המדיום של Dulbecco המינימלי החיוני (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור עוברי ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין . לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ O / N.
2. רוקן מקרופאגים של כולסטרול על ידי ביצוע צעדים 1.2-1.4 החלפת 2 מיליליטר ב -200 μl ישים כדי להסביר את הגודל גם הגדול יותר.
   הערה: הקפד לכלול שליטה טופלה ב1x PBS, כמו גם שליטה שגרדה לפני כל טיפול.
3. הוסף 500 μl של 1x PBS היטב כל אחד ועדינות לגרד תאים עם מגרד תא. להעביר לתוך צינור microfuge ולהשעות את התאים על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה.
4. הסר 10 μl של תאים ואת הכתם עם 1 μl של 4% Trypan כחולים.
5. ספירת תאים על hemocytometer ולחשב את הכדאיות באמצעות המשוואה הבאה: כדאיות% = [1 - (תאים כחולים / תאים בסך הכל)]x 100. ערכים לנרמל לשליטה שהייתה שלא טופל. לאחר כמה ניסויים לחשב את הערך הממוצע וסטיית התקן כדי לקבוע מגמות בכדאיות. השתמש במבחן t תלמיד כדי לקבוע משמעות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

כולסטרול דלדול

ניתוח של supernatant שמורות בשלב 1.3 של הפרוטוקול על ידי ביצוע הוראות היצרן בערכת הכולסטרול Assay Amplex האדומה מניב ריכוז גבוה של כולסטרול במדגם MβCD טופל בהשוואה לשליטת 1x PBS. בהתאם לסוג תא ודלדול כולסטרול ריכוז MβCD משמש עשוי להש?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

בעבודה עם פרוטוקול זה חשוב להשיג ספירת תאים מדויקת כאשר ציפוי תאי יונקים וopsonizing ג תאי neoformans. זה ממזער וריאציה בין ניסויים ומבטיח 1 מדויק: יעד 1 יחס מפעיל לאורך כל תקופת המחקר. זה גם קריטי כדי לתאם את התזמון של דלדול הכולסטרול וזיהום כדי למנוע את תאי שמרי opsonized ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Class II type A2 Biosafety Cabinet	Labconco	3460009
J774A.1 cell line	ATCC	TIB-67	Arrives Frozen. See ATCC instructions for culturing.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Gibco	11995-065	Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use
HI Fetal Bovine Serum Performance Plus	Gibco	10082-147	Keep frozen at -20 °C and thaw before adding to DMEM
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco	15140-122	Used to suplement DMEM
Isotemp Cell culture incubator	Fisher Scientific		Model # 3530
96-Well culture dish	Corning Inc. Costar	3595
10x Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific BioReagents	BP3994	Dilute to 1x and filter or autoclave prior to use.
Methyl-β-cyclodextrin	Sigma Life Science	C4555-10G	Dissolve in 1x PBS to make solutions of 10 mM and 30 mM concentrations
Orbital shaker	Labline
Amplex Red Cholesterol Assay Kit	Life Technologies Molecular Probes	A12216	All reagents for Cholesterol Assay are contained within the kit. Follow Manufacturer instructions.
96-Well Black Assay plate	Corning Inc. Costar	3603
FilterMax microplate reader	Molecular Devices		Model F5
TLC chamber	Sigma-Aldrich	Z126195-1EA
Chloroform	Sigma-Aldrich	650498-4L
Methanol	Sigma-Aldrich	34860-2L-R
TLC Paper	Whatman	3030917	Cut down to size needed for TLC tank
Fume hood			Any fume hood that complies with AIHA/ANSI Standards
6-Well plate	Corning Inc. Costar	3506
Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054
Cell scraper	Corning Inc. Costar	3010
Hemocytometer	Hausser Scientific	1490
Centrifuge	Beckman Coulter		Model Alegra x-30R
Votex mixer	Fisher Scientific	12-812
Balance	Mettler Toledo		Model # MS104S meaures down to 0.1 mg
Glass Pasteur pipette	Fisherbrand	13-678-20A
Cholesterol	Avanti Polar Lipids	700000
SpeedVac concentrator	Thermo Scientific		Model # SPD2010
Petroleum ether	Fisher Scientific	E139-1
Diethyl ether	Sigma-Aldrich	309966
Acetic acid	Sigma-Aldrich	320099
TLC Silica Gel 60 with concentrating zone	Analytical Chromatograhy Millipore	1.11845.0001
Iodine chips	Sigma-Aldrich	376558-50G
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	320501
Manganese chloride	Sigma-Aldrich	244589
UVP EC3 Imaging System	Ultra-Violet Products Ltd.		Use the Vision Works LS software for densitometry analysis
Glass bottom confocal dish	MatTek	P35G-1.5-10C	www.glassbottomdishes.com
Cryptococcus neoformans (H99)			Obtained from Duke University Medical Center
YNB	BD	239210	See manufacturer for preparation instructions. Use a glucose concentration of 20 g/L.
Lipopolysaccharide	Sigma	L4391-1MG	Dissolve in 1x PBS to make 1 mg/ml stock. Store at -20 °C.
Interferon gamma	Sigma	I4777	Dissolve in 1x PBS to make 0.1 mg/ml stock solution
Glucuronoxylomannan antibody (anti-GXM)			Gift from Arturo Casadevall's Lab concentration is 1.98 mg/ml
Giemsa	MP Biomedicals	194591	Dissolve 0.8 g of Giemsa in 25 ml of glycerol and heat to 60 °C for 1 hr. Add 25 ml of methanol to the solution and allow to age at room temperature for at least 1 month.
Microscope	Zeiss		Observer.D1 microscope with AxioCam MRm for taking images