בחינת המהירה דופמין Dynamics עם הסריקה מהירה Voltammetry המחזורי במהלך פנים הפה Tastant מנהל בחולדות ערה

Summary

Rapid fluctuations in extracellular dopamine (DA) mediate both reward processing and motivated behavior in mammals. This manuscript describes the combined use of fast scan cyclic voltammetry (FSCV) and intra-oral tastant administration to determine how tastants alter rapid dopamine release in awake, freely moving rats.

Abstract

Rapid, phasic dopamine (DA) release in the mammalian brain plays a critical role in reward processing, reinforcement learning, and motivational control. Fast scan cyclic voltammetry (FSCV) is an electrochemical technique with high spatial and temporal (sub-second) resolution that has been utilized to examine phasic DA release in several types of preparations. In vitro experiments in single-cells and brain slices and in vivo experiments in anesthetized rodents have been used to identify mechanisms that mediate dopamine release and uptake under normal conditions and in disease models. Over the last 20 years, in vivo FSCV experiments in awake, freely moving rodents have also provided insight of dopaminergic mechanisms in reward processing and reward learning. One major advantage of the awake, freely moving preparation is the ability to examine rapid DA fluctuations that are time-locked to specific behavioral events or to reward or cue presentation. However, one limitation of combined behavior and voltammetry experiments is the difficulty of dissociating DA effects that are specific to primary rewarding or aversive stimuli from co-occurring DA fluctuations that mediate reward-directed or other motor behaviors. Here, we describe a combined method using in vivo FSCV and intra-oral infusion in an awake rat to directly investigate DA responses to oral tastants. In these experiments, oral tastants are infused directly to the palate of the rat – bypassing reward-directed behavior and voluntary drinking behavior – allowing for direct examination of DA responses to tastant stimuli.

Introduction

Phasic DA release plays an important role in mediating reward-directed behavior ^[1-3]. However, isolating and studying how a primary reward alters phasic DA release is often complicated by co-occurring behavioral or cognitive processes that are also capable of altering phasic DA release - such as decision making processes or reward-directed motor behavior to acquire the reward. In the current work, we isolate phasic DA responses to tastants through the use of in vivo fast-scan cyclic voltammetry (FSCV) combined with tastant delivery through intraoral cannulae. This technique bypasses choice and action and allows us to examine extracellular DA release during direct infusion of a tastant to the palate of a rat.

FSCV is an electrochemical technique with high temporal and spatial resolution, permitting measurements of DA release in a discrete local area (approximately 100 µm) on a sub-second scale (10 Hz resolution). The combination of intra-oral delivery and FSCV provides the advantage of observing rapid, 'real-time' DA responses to a tastant, which cannot be examined using conventional microdialysis methods. Furthermore, phasic DA release in response to either rewards or reward-associated cues occurs at concentrations between 20-100 nM, which is above the 10-20 nM detection threshold for FSCV ^[4]. The high spatial resolution of FSCV also permits recording from sub-regions of small brain areas, such as the nucleus accumbens core (NAc). Thus, FSCV combined with intraoral infusions of tastants is an ideal model for studying how tastants or other stimuli alter phasic DA release in an awake, behaving animals. Indeed, these techniques have permitted experiments investigating how rewarding and aversive tastants alter extracellular DA release ^[5].

Over the last decade, FSCV analyses have been successfully combined with intravenous drug delivery ^[6] and rat self-administration paradigms ^{[7, 8]} to identify the role of phasic DA mechanisms in drug addiction models. In addition, combined intraoral delivery with FSCV has been used to examine how tastant cues paired with cocaine availability modulate phasic DA release and behavioral responses that reflect emotional affect ^[3]. This combined intraoral and FSCV methodology can also be powerfully utilized to examine phasic DA responses to flavorants, such as menthol and oral sweeteners, that are added to cigarettes and dissolvable tobacco products ^[9-11]. Although many of the flavorants added to tobacco products are appetitive ^[9-11], it is unknown if these flavorants increase phasic DA release in a manner consistent with a rewarding hedonic valence. Indeed, flavorants added to cigarettes and to dissolvable tobacco products may have direct effects on the DA reward system and may act through dopaminergic mechanisms to influence the rewarding valence of cigarettes and other tobacco products. Thus, intraoral delivery combined with FSCV can provide new understanding on how flavorants modulate rapid DA release. The use of combined intra-oral and in vivo FSCV methodology, and the data obtained from such studies, can also facilitate future studies to determine how flavorants and nicotine interact to alter DA signaling and to potentially modulate nicotine reinforcement. Further, the data gained from such studies can be used to inform regulatory decisions about tobacco product flavorants.

Protocol

כל הניסויים שנערכו על פי המכון הלאומי לבריאות (NIH) מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה ואושרו על ידי ועדת אוניברסיטת ייל מוסדי טיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC).

הכנות 1) טרום-ניתוחיות

1. הכנת פתרון אוראלית
   1. ליצור פתרונות של סוכרוז 10% ו0.005% L-מנטול במים ללא יונים (pH 7.4). אחסן את הפתרונים הללו במיכלים סגורים, ב RT, ולעצב מחדש כל 2 שבועות, כדי למנוע השפלה.
2. פתרונות כיול אלקטרודה
   1. הפוך חיץ טריס (pH 7.4) בכל עת לפני הכיול. הפתרון מורכב מ12.0 מ"מ טריס HCl, 140 מ"מ NaCl, 3.25 מ"מ KCl, 1.20 מ"מ CaCl2, 1.25 מ"מ NaH2PO4, 1.20 מ"מ MgCl _2, ו2.00 מ"מ Na ₂ SO _4.
   2. צור פתרון מניות של דופמין 10 מ"מ (DA; hydrochloride דופאמין) ב0.1 חומצת perchloric M. חומצת perchloric מסייעת במניעת חמצון של dopaminדואר. אחסן פתרון מניות זה ב -20 ° C ולהשתמש עד 6 חודשים. הפוך כמה aliquots של פתרון מניות DA לאחסון לשימוש כל aliquot רק פעם אחת.
   3. ממניות 10 מ"מ DA, לדלל פתרונות במאגר טריס לריכוזים של 1 מיקרומטר, 500 ננומטר, 250 ננומטר, 125 ננומטר, 62.5 ננומטר, ו31.25 ננומטר.
   4. לכיול pH, להכין פתרונות של טריס חיץ עם pH של 7.2, 7.3, 7.5, 7.6 ו. זה יספק פתרונות המחקים משמרות pH שעלול להתרחש במהלך ניסוי in vivo.
3. ייצור אלקטרודה
   1. על ידי שאיבת אבק, לשאוב סיבי פחמן T-650 (7 מיקרומטר קוטר) לנימי זכוכית בורוסיליקט (אורך 10 מ"מ, קוטר 0.6 מ"מ חיצוני, קוטר פנימי 0.4 מ"מ).
   2. הנח נימי זכוכית מלאות בסיבי פחמן לחולץ אלקטרודה אנכי. לפרמטרים ראשוניים, הגדר את התנור ל55.0 ולכבות את המגנט. עם זאת, אופטימיזציה נוספת שתהיה דרושה כשני דוד והגדרות מגנטיות להשתנות frמעבדה אום למעבדה.
      הערה: אלקטרודה צריכה להיות לפחות 5.5 סנטימטר (כולל להתחדד), כך שהוא יכול להתאים בקלות לmicromanipulator ולהיות מוכנס לפחות 6.9 מ"מ מתחת דורה במוח החולדה. אם האלקטרודה הוא קצר מדי, הקלטות מחלק הגחוני של הגרעין נסמך לא תהיינה ברות השגה. מצד השני, הכולל את אורך אלקטרודה לא יעלה על 6.5 סנטימטר אחר זה יהיה יותר מדי זמן כדי להתאים את micromanipulator.
   3. באמצעות מיקרוסקופ אור, לחתוך החשוף סיבי פחמן, כך שהוא מרחיב 75-100 מיקרומטר מעבר לקצה של הזכוכית. ודא שיש לו את האלקטרודה חזק מאוד, בקושי אפשר להבחין, חותם בין אלקטרודת הזכוכית והסיבית פחמן, אשר תפיק רעש מינימאלי במהלך הקלטה שלאחר מכן. מחק את האלקטרודה אם יש סדקים בולטים בזכוכית או אם החותם הוא רופף, אשר מעיד על חותם עני. לקבלת הוראות מפורטות יותר ראו [12] ו [13].
4. הרכבת אלקטרודה לתוך המיקרופוןromanipulator
   1. להשיג 3 ב, חוט 30G כי הוא מבודד לאורך מחצית אורכו של החוט ולהשתמש במברשת קטנה ללמרוח שכבה דקה של כסף לצבוע ישירות לחוט. מייד לאחר החלת צבע כסף, להכניס את החוט לתוך החור בחלק העליון של האלקטרודה לספק חיבור פיזי וחשמלי לסיב פחמן. תחת מיקרוסקופ, להבטיח כי חוט הכסף יוצר קשר עם סיבי פחמן.
   2. אבטח את חוט הכסף ואלקטרודה לmicromanipulator באמצעות חום להתכווץ.
   3. מניחים את האלקטרודה סיבי פחמן מוכן לאלכוהול איזופרופיל מטוהר (IPA) במשך לפחות 10 דקות כדי לנקות את שטח האלקטרודה וכדי להגביר את הרגישות לאחר דופמין. לאחר השרייה בIPA, לשטוף את סיבי פחמן במים ברז כדי להסיר את IPA.
5. ייצור אלקטרודה התייחסות
   1. קח חוט 13 מ"מ כסף המכיל כ 6 מ"מ רשת Ag / Ag Cl (חוט כסף 7 מ"מ בלבד, 6 רשת מ"מ, קוטר 0.4 מ"מ),לחתוך את חלק הכסף עד כלמחצית אורכו המקורי ולרתך את החלק מכסף של החוט לסיכת זהב.
   2. החל אפוקסי על ההלחמה על הפין.
   3. טובלים את Ag / Ag Cl רשת הסוף לקופולימר של polytetrafluroethylene 5% וperfluoro-3,6-dioxa-4-מתיל-7octene-sulfonic חומצה 5 פעמים, לתקופות ייבוש אוויר 30 דקות בין כל טבילה.
   4. לאפשר Ag / Ag Cl המצופה רשת לO אוויר היבש / N.
   5. לרפא בתנור על 120 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.

2) ניתוח המשולב intraoral וניתוח תוך גולגולת Cannulation (כ -75 דקות)

1. ייצור קטטר שבעל פה
   1. הפוך את הצנתר דרך הפה, ולעקר על ידי עיקור אתילן אוקסיד, לפחות 10 ימים לפני הניתוח.
   2. חותך צינורות PE 100 ל6 סנטימטר מגזרים ארוכים.
   3. באמצעות מלחם, להמס קצה אחד של צינור PE וקש מייד על משטח מוצק כדי לקרר את צינורות PE. התוצאה צריכה ליצורדיסק קטן, שטוח בקצה אחד של צינור PE ולא צריך להיות טבלת מנגנון. שימוש במחט (18 G) או לדחוף סיכה כדי ליצור חור במרכז של הדיסק הזה.
   4. בצד השני של צינור PE, בנוחות להכניס את הקצה הקהה של מחט G 18 לתוך הצינור.
   5. באמצעות אגרופן חור נייר סטנדרטי, אגרוף כמה חתיכות עגולות של גיליון polytetrafluroethylene (3.18 מ"מ עובי, 6 מ"מ קוטר) כדי ליצור מנקי polytetrafluroethylene.
   6. ליצור חור במרכז של מכונת הכביסה. קח את המחט מחוברת לצינורות PE ולדחוף אותו לחלוטין באמצעות מכונת הכביסה. ברגע שהמחט היא דרך, להחליק את מכונת הכביסה לתחתית צינורות PE, כך שהוא סומק נגד מכונת הכביסה.
2. אוראלי ניתוח
   1. לאחר חיטוי כלים כירורגיים, הצינורית (גזוזות עד 2.5 מ"מ מתחת הכן לפני העיקור), והאלקטרודה התייחסות, להרדים את העכברוש עם זריקת intraperitoneal של קטמין (100 מ"ג / קילוגרם) ו xylazine (10 מ"ג / קילוגרם).
      1. אפter 5 דקות, להחיל מבחן גירוי מזיק (רגל או קמצוץ זנב) כדי להעריך את הרמה של הרדמה. אם הנושא מראה כל תגובה פיזית למבחן הגירוי המזיק (נרתע תגובה, עלייה בקצב נשימה או לב), לנהל דחיפה קטמין של 10% עד 15% מהמינון המקורי ולחזור על פרוטוקול הגירוי המזיק לעיל.
   2. לאחר העכברוש הוא בהרדמה מלאה ולא מראה תגובה למבחן הגירוי המזיק, להשתמש קוצץ שיער בעלי חיים לגלח הפרווה של החולדה מהעיניים כ 2 מ"מ מאחורי האוזניים. לאחר מכן מניח את החולדה על כרית חימום הסירקולציה המחודשת מים דקה כדי לשמור על טמפרטורת גוף במהלך ניתוח. החל סיכה עין. לנהל את התרופה אנטי דלקתי שאינם סטרואידים (NSAID), carprofen (5 מ"ג / קילוגרם), על ידי הזרקת intraperitoneal לפני ביצוע כל חתכים ולפני החדרת קנולות intraoral. השתמש בטכניקת ספטית בכל העת.
   3. החל בטאדין ואחריו אתנול 70% כדי לנקות את העור. חזור 3 פעמים.
   4. Plaהספירה החולדה על הגב שלה, ולפתוח את הפה באמצעות מקלון צמר גפן סטרילי. מצא טוחנת העליון הראשונה.
   5. הכנס את המחט לתוך הרקמה בין הלחי וטוחן העליונים הראשונה עד המחט יוצאת ממש מאחורי והמדיאלי לאוזניים.
   6. פירס המחט דרך העור עד צינורות PE יוצא העור ונגיש.
   7. משוך על הצינורית (מרתקת על ידי הצינורית עצמו ולא את המחט) ולאבטח את מכונת הכביסה polytetrafluroethylene לטוחנות כך שהצנתר נשאר במקום.
      הערה: חיתוך מכונת הכביסה לצורת טרפז ומאבטח אותו נגד הטוחנות עם הצד השטוח מול הלחי עושה צעד זה קל יותר.
   8. קח מכונת כביסה polytetrafluroethylene אחרת והחלק אותו על המחט החשופה, את צינורות הפלסטיק, וניגש נגד החתך.
   9. כדי לאבטח את מכונת הכביסה polytetrafluroethylene, להשתמש בקלטת מעוקרת ליצור "דגל" משולש כך שמכונת הכביסה לא להחליק למעלה. Secure לשטוףאה נגד העור של החולדה והקלטת מעוקרת.
   10. חותך את הקטטר החשוף כדי לאפשר 2-4 סנטימטר של צינורות להיחשף מעל הראש של החולדה.
   11. חזור על השלבים 2.2.1 באמצעות 2.2.10 לצד של הפה האחר.
3. ניתוח תוך-גולגולתי לvoltammetry
   1. מניחים את החולדה במסגרת stereotaxic ולנקות את הקרקפת של החיה באמצעות שני לשפשף שלב (לשפשף בבטאדין ואחריו לשפשף אתנול 70%, לבצע עם חזרת 3 מחזור).
   2. השתמש פינצטה מעוקרת מחט האף ומספריים כירורגיות כדי לחתוך קטע 15 x 15 מ"מ של רקמת קרקפת.
   3. נקה בעדינויות את פני השטח של הגולגולת באמצעות החלת קצה כותנה מעוקרת. נוסף לנקות את הגולגולת על ידי יישום 2-3 טיפות של מי חמצן 3%.
   4. השתמש תרגיל stereotaxic לעשות 3 חורים קטנים (בקוטר 1 מ"מ) בגולגולת להכנסה הבאה של ברגים, חור 1 לצינורית המדריך, חור 1 להאלקטרודה מגרה, וחור 1 לנבחר ההתייחסותרכב.
   5. להקלטות בליבת NAC, מקמו את צינורית המדריך ב1.2 מ"מ קדמי ו -1.4 מ"מ לרוחב גבחת. מנמיכים את מנגנון הצינורית עד בסיס הפלסטיק הוא מיושר עם הגולגולת.
   6. מניחים את האלקטרודה ההתייחסות מעוקרת בחצי הכדור הנגדי לצינורית המדריך. מנמיכים את ההתייחסות כ 2 מ"מ מתחת הדורה.
   7. מקם את האלקטרודה מגרה על 5.2 מ"מ אחורי ו1.0 מ"מ לרוחב גבחת והוריד 8.0 מ"מ מתחת דורה למקד אזור הגחון tegmental (VTA).
   8. השתמש במברג כירורגית קטן מעוקר כדי לאבטח ברגים לגולגולת. לאחר מכן, הכנס את האלקטרודה ההתייחסות, גירוי אלקטרודה, ולהנחות את הצינורית. לבסוף, לאבטח את כל הרכיבים באמצעות מלט cranioplastic.
   9. במשך 48 השעות הראשונות של טיפול שלאחר ניתוח, לנהל את התרופה אנטי דלקתית (NSAID) carprofen שאינו סטרואידים בהזרקה תת עורית (5 מ"ג / קילוגרם). לאפשר לפחות השבוע 1 להתאוששות כירורגית מלאה לפני ביצוע voltamהקלטת "חג.
      1. במהלך טיפול שלאחר ניתוח, צנתרים אוראליים סומק יומי עם מים. לספק מזון רווי במים במשך 2 ימים כדי לסייע לבעלי החיים בלעיסה ואכילה. לספק ניטור יומי לסימנים אפשריים של לחץ של כאב (עקב זיהום או התייבשות קל) ולספק התערבויות מתאימות במידת צורך (כולל ניהול של נוזלים, ממשל מקומי של חיטוי, וממשל או NSAID carprofen בשעה 5 מ"ג / קילוגרם).

3) הקלטות Voltammetric בערים, עכברוש באופן חופשי על העברה

1. הורדת האלקטרודה ורכישת סט אימון DA.
   1. ביום של הניסוי, לבדוק את הפתיחות של הצינורית דרך הפה על ידי יציקת 200 μl מים והתבוננות תגובות orofacial (כדי לוודא שהעכברוש הוא טועם את המים).
   2. צרף את headstage FSCV לחולדה על ידי החדרת אלקטרודה המגרה (על headstage) לcannu האלקטרודה מגרה דו קוטבילה (בחולדה). לפיכך, headstage (מיניאטורי ממיר נוכחי למתח) מתחברת ישירות לאלקטרודה דו קוטבי גירוי.
   3. הסר את צינורית הדמה ממנגנון הצינורית ולהחיל שתי טיפות של 50% פתרון הפרין לצינורית. ואז בעדינות להכניס צינורית דמה (מעט יותר שצינורית הדמה שהוסרה בעבר) כדי לנקות כל קרישי דם או צלקות גליה אשר ייתכן שאירעו, שישברו אלקטרודות סיבי פחמן שיהיה בהמשך להיות מוכנס במהלך הניסוי. להאריך את הצינורית המשמשת לניקוי קרישים 3-4 מ"מ מתחת לגולגולת (לפחות 2 מ"מ מעל אתר ההקלטה).
   4. הכנס את micromanipulator, עם אלקטרודה, לצינורית המדריך ולמקם את טבעת האומגה במצב "נעול".
   5. חבר את חוט האלקטרודה ההתייחסות מheadstage לסיכה המתאימה. אז לחבר את חוט האלקטרודה העבודה מmicromanipulator לחוט המתאים בheadstage.
   6. מנמיכים את ELECtrode כ 4-4.5 מ"מ מתחת גולגולת.
   7. השתמש potentiostat ליישם צורת גל משולשת (400 V / s, ל-0.4 1.3 V). החל הגל לאלקטרודה בתדר 60 הרץ לפחות 10 דקות, ולאחר מכן לשנות את תדר יישום צורת גל עד 10 הרץ להקלטות ניסיוניות שלאחר מכן.
      הערה: צעד יישום גל 60 הרץ מייצר משטח סיבי פחמן יציב ויסייע למנוע סחיפה חשמלית
   8. החל גירוי חשמלי לVTA באמצעות תדרים שונים (10 עד 60 הרץ) קטניות (10 עד 30 פעימות) וזרמים (50 עד 150 מיקרו-אמפר) כל עם רוחב פולס של 2 MS / שלב, לעורר ריכוזים שונים של שחרור DA ו- pH משמרות. לרכוש לפחות 5 ריכוזים שונים של שחרור DA ו -5 משמרות pH שונות. חכה (2 - מינימום 3 דקות) בין גירויים כדי לאפשר העמסת לפוחי [14].
      הערה: חשוב לקבל גירויים המייצרים ריכוזי DA על פני כל הטווח שייאסף במהלך שלאחר מכןניסוי שכן הם ישמשו כמערכת הכשרה לקרן רכיב ניתוח (ראה סעיף 5.1).
   9. מנמיכים את האלקטרודה לתוך ליבת NAC (הגחון 6.3 מ"מ לדורה). לאחר מכן מנמיך את האלקטרודה בבתוך ליבת NAC 100 מיקרומטר מרווחים עד אירועי שחרור DA חולפים הם נצפו בתדרים של לפחות 1 לדקה.
   10. חבר את צינורות (הקוטר פנימי 1/32 ", קוטר חיצוני 3/32") למזרק 20 מיליליטר, מחובר למשאבת מזרק. בצד השני של הצינור, להשתמש במחט 23 G משופע להתחבר צינורות לצינורית של החולדה. ודא שהצינור מלא לחלוטין עם tastant הרצוי ולוודא שאין בועות קיימות בצינור.
       הערה: בדרך כלל, לנהל כמות קטנה של tastant לתוך הפה של העכברוש לפני ההקלטה על מנת להבטיח כי העירוי הראשון להקלטה מספק את מלוא סכום עירוי ולא כל מים או אוויר שיורית בצינור. יתר על כן, זה מאפשר לבעלי החיים כדי לקבל קצת שנינות ניסיון קודמתh tastant מאז tastants רומן, גם תיאבון אלה, יכול להיות מרתיע בתחילה בשל החידוש שלה.
   11. לאיסוף נתונים, להחדיר 200 μl של tastant (6.5 שניות באמצעות משאבה וצינורות שתוארו לעיל). להשרות tastant כל דקות 1-3. להשרות כולל של 25 פעמים בtastant. כל עירוי מספק 200 μl של פתרון.
   12. אם tastants מרובים מועבר בניסוי אחד, לשטוף את הפה עם מים קטטר לאחר איסוף נתונים לtastant אחד ולחכות לפחות 20 דקות לפני יציקת tastant החדש.
   13. לאחר הקלטת DA, להתכונן לאימות היסטולוגית על ידי יצירת נגע קטן באתר ההקלטה. כדי לשמר את האלקטרודה סיבי פחמן לכיול הבא, לחזור בי ראשון האלקטרודה ולהסיר את micromanipulator. לאחר מכן השתמשתי micromanipulator חדש עם microelectrode זכוכית ותיל טונגסטן (הארכת 100 מיקרומטר מעבר לקצה של הכוס) לאותו עומק (להלן דורה) כF פחמן המקוריmicroelectrode iber.
   14. לאימות היסטולוגית, ליצור נגע קטן על ידי יישום 3 V בחוט טונגסטן והגדלת המתח במרווחים 1 V, כל 10 שניות, עד שתגיע ל- 10 V ההגדרה.
   15. אם עקומת ריכוז סטנדרטית כבר נוצרה באמצעות אלקטרודות פחמן סיבים מרובות, לבצע את צעד הנגע לעיל (3.1.14) על ידי יישום הפוטנציאל ישירות האלקטרודה סיבי פחמן.
       הערה: שיטת נגע זה יגרום ניזק לסיבי פחמן ולמנוע הכיול הבא עם שאלקטרודה הספציפית.
   16. להרדים את החיה באמצעות pentobarbital קטלנית הזרקה (150 מ"ג / קילוגרם, IP).
   17. לעקור את headcap עם cannulae באמצעות צבת ידי משיכת ישירות כלפי מעלה על headcap. אל תסובב headcap מאז זה יגרום נזק מיותר למוח ולגרום לזה מאתגר כדי לזהות את המיקום של האלקטרודה בהיסטולוגיה.
       1. הסר את המוח ואת המקום בפורמלין 4% במשך 3 ימים ואחריו 30% sucrose לשבוע 1. צור 30 מיקרומטר פרוסות באמצעות cryostat, לעלות על מכסה מחליק ולבחון פרוסות תחת מיקרוסקופ אור כדי לזהות את המיקום של סיבי פחמן או נגע טונגסטן.
          הערה: זלוף הוא אופציונאלי עבור 3.1.17.

4) אלקטרודה כיול

1. שימוש בתא הזרימה כדי ליצור גורם המרה נוכחי-ריכוז.
   1. על מנת לקבוע את רגישות אלקטרודה, לכייל אלקטרודות לאחר כל ניסוי באמצעות מנגנון "T-cell" זרימה. מנמיכים את האלקטרודה לתוך "T-cell" בעוד חיץ טריס, פתרונות pH, או פתרונות DA נשטפים על פני האלקטרודה (בשיעור של 2 מיליליטר / דקה). השתמש מפעיל סולנואיד האוויר שש-עמדה כדי לעבור קדימה ואחורה בין החיץ וpH או פתרון DA.
   2. לכל כיול, לאסוף נתונים voltammetric במהלך 5 שניות יישום של חיץ טריס (בסיס) ואחרי 5 שניות של יישום ה- pH או פתרון DA, ואחרי 20 שניותpplication של חיץ טריס (קובץ כולל של 30 שניות). חזור על כל ריצה 3 פעמים עבור כל ריכוז סטנדרטי כיול, כמשקל נגד בין ריכוזים השונים של כל תקן.
   3. לכל אוסף מדגם, למדוד את השיא DA או נוכחי עורר pH. ממוצע נוכחי השיא פני כל ניסוי כדי להשיג ריכוז לעומת מערכת יחסים הנוכחיות לשיא. לקבלת הוראות מפורטות יותר ראו [12] ו [13].

5) ניתוח נתונים

1. באמצעות אימון שנקבע בניתוח מרכיבים עיקרי (PCA)
   הערה: במהלך ניסוי voltammetry, פלט מופק כנוכחי, שהוא התוצאה של חמצון דופאמין והפחתה, משמרות pH, ורעש אלקטרוכימיים. PCA מאפשרת הפרדה של גורמים אלה, כך שניתן לבודד את המרכיבים הרצויים (DA ו- pH) ולהסיר רכיבים נוספים שעשויים לעוות את האותות הרצויים (לתיאור מפורט יותר, ראה ^{15, 16).}
   1. הקצאת גורם כיול התפוקה נוכחית דואר (כ 5-10 Na / מיקרומטר) לאחר PCA כדי לאפשר ערכי ריכוז של analytes שייקבעו.
   2. השתמש בערכת ההדרכה שהושגה במהלך ניסוי ל" רכבת "מודל PCA להפריד את התובע, pH, וגורמים אחרים. PCA לוקחת אימון להגדיר voltammograms המחזורית (שנאסף בסעיף 3.1.8) וקובעת שמאפיינים מהותיים של voltammogram יכולים לשמש כדי לזהות כל אנליטי שנאסף במהלך הקלטות voltammetry in vivo.
   3. כדי לקבוע את מספר המרכיבים העיקריים כדי לשמור, להשתמש מלינובסקי F-מבחן. בדרך כלל, לשמור רק 2 או 3 מרכיבים עיקריים אשר בדרך כלל להסביר על 95-99% מהשונות בנתונים. לדיון נוסף ביישום מלינובסקי F-הבדיקה, לראות ^17.
      הערה: לאחר מספר הרכיבים נקבעים, ניתוח PCA יעילות יהיה פרויקט voltammograms נמדדה מהתובע והכשרת pH קובעת על המרכיבים העיקריים שנשמרו.התוצאה היא סדרת הנתונים שסונן כך שהנתונים רק DA (או pH) נשאר ונתונים השייר שאינו דומה DA או pH מוסר (ראה תוצאות נציג לתוצר צפוי). להסבר מפורט יותר וצעד צעד לפי הוראות לשימוש בPCA עבור ניתוח voltammetric לראות גיליון חומרים ו ^{-16, 17.}

תוצאות

FSCV בשילוב עם השתלת צנתר intraoral שימש לבחון כיצד סוכרוז, tastant תיאבון, מודולציה שחרור DA phasic בליבת NAC. לפני עירוי tastant, גירוי חשמלי (150 מיקרו-אמפר, 60 הרץ, 24 פעימות; שצוין על ידי בר האדום) של VTA מייצר עליות חזקות בשחרור DA phasic בNAC (איור 1) איור 1 מציג עלילת צבע עם פוטנציאל ב. צ?...

Discussion

משלוח tastant intraoral בשילוב עם FSCV מאפשר ניתוח של תגובות DA "בזמן אמת" לflavorants האוראלי. ישנם שלושה שלבים קריטיים בפרוטוקול הנדרשים למדידות DA מוצלחות. ראשית, השתלה תקינה של הצנתר דרך הפה היא קריטית לאספקת flavorants. על מנת להבטיח כי קטטר מוכנס מאחורי טוחנת הראשונה ותקוע במקום...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stimulating electrode	PlasticsOne	MS303/2-A/SPC	when ordering, request a 22 mm cut below pedestal
Cannula for electrode	BioAnalytical Systems	MD-2251
Glass capillary	A-M systems	624503
Carbon fiber	Thornel	T650
Electrode puller	Narishige International	PE-22
Neurolog stimulus isolator	Digitimer Ltd.	DS4
Heat shrink	3M	FP-301
Insulated wires for electrodes	Squires electronics	Custom	L 3.000 x 1.000s x 1.000s UL1423 30/1 BLU
Micromanipulator	Univ. of Illinois at Chicago, Engineering Machine Shop
Epoxy	ITW Devcon	14250	"5 minute epoxy"
Copolymer of perfluoro-3,6-dioxa-4-methyl-7octene-sulfonic acid and tetrafluoroethylene	Ion Power	LQ-1105	i.e., Nafion
Silver paint	GC Electronics	22-023
Power supply	BK Precision	9110
Tubing for intra-oral catheters	Intramedic	427426	PE 100, I.D. = 0.86 mm; O.D. = 1.52 mm
Tubing for intra-oral infusion	Fischer Scientific	02-587-1A	I.D. 1/32"; O.D. 3/32"
Syringe pump for flow cell	Pump Systems Inc.	NE 1000
Surgical cement	Dentsply Caulk	675571 and 675572
Air actuator	VICI	A60	6 position digital valve interface
Digital valve interface	VICI	DVI	230 VAC
Quad headstage	Univ. of N. Carolina, Electronics Facility
UEI power supply	Univ. of N. Carolina, Electronics Facility
UEI breakout box	Univ. of N. Carolina, Electronics Facility
Power supply for tastant syringe pump	Med Associates	SG-504
Tastant syringe pump	Med Associates	PHM-107
Tungsten microelectrode	MicroProbes	WE30030.5A3
Silver wire reference with AgCl	InVivo Metric	E255A
Sucrose	Sigma	80497
Magnesium chloride	Sigma	M8266
Sodium chlroide	Sigma	S7653
Perchloric acid	Sigma	244252
Hydrochloric acid (4 M)	Sigma	54435
Soidum hydroxide	Sigma	306576
Hydrogen peroxide	Sigma	H1009
Dopamine hydrochloride	Sigma	H8502
TarHeel HDCV Software	University of North Carolina-Chapel Hill		Must request software: click here for link to software request page