מדידות דיוק אבץ איזוטופי גבוהות יישומים לאיברי עכבר

Summary

We present the technique to measure with high precision zinc isotope ratios in mouse organs.

Abstract

אנו מציגים הליך למדידה עם יחס איזוטופ אבץ דיוק גבוה באיברי עכבר. האבץ מורכב 5 איזוטופים יציבים ⁽⁶⁴ Zn, ⁶⁶ Zn, ⁶⁷ Zn, ⁶⁸ Zn ו ^-70 Zn) אשר מופרדים בין איברי עכבר באופן טבעי. אנחנו מראים תחילה כיצד לפזר את האיברים השונים כדי לשחרר את אטומי Zn; צעד זה מתממש על ידי תערובת של HNO ₃ ו- H ₂ O _2. לאחר מכן, אנו מטהרים את אטומי אבץ מכל הגורמים האחרים, בפרט מהפרעות isobaric (למשל, Ni), על ידי כרומטוגרפיה אניון-חליפין בHBr לדלל / HNO בינוני _3. שני שלבים הראשונים אלה מבוצעים במעבדה נקייה באמצעות כימיקלים טוהר גבוהים. לבסוף, יחסי איזוטופ נמדדים באמצעות רב-אספן ההמוני ספקטרומטר אינדוקטיבי מצמידים-פלזמה, ברזולוציה נמוכה. הדגימות מוזרקות באמצעות תא תרסיס וחלוקת איזוטופים הנגרמת על ידי ההמוני ספקטרומטר הוא correcטד על ידי השוואת היחס של הדגימות ליחס של סטנדרטי (טכניקה מדורגת סטנדרטית). הליך טיפוסי מלא זה מייצר יחס איזוטופ עם שחזור 50 עמודים לדקה (2 SD).

Introduction

המדידה של דיוק גבוה הרכב איזוטופ היציב (טוב יותר מ -100 עמודים לדקה / יחידת מסה אטומית) אבץ הייתה אפשרית רק לכ -15 שנים הודות לפיתוח של מסה-ספקטרומטרים פלזמה מקור רב-אספן ומאז בעיקר מיושמת בכדור הארץ ומדעים פלנטריים. היישומים בתחום הרפואי הם רומן ויש לו פוטנציאל חזק כסמנים ביולוגיים למחלות שמשנות את חילוף החומרים של אבץ (למשל, מחלת אלצהיימר). מאמר זה מדווח שיטה למדוד עם דיוק גבוה יחסי איזוטופ יציבים הטבעיים של אבץ באיברים שונים בעכבר. אותו יהיה ישים לדגימות אנושיות. השיטה מורכבת מהפירוק של האיברים, הטיהור הכימית של אבץ משאר האטומים, ולאחר מכן הניתוח של יחס איזוטופ במסה-ספקטרומטר.

האיכות של מדידות איזוטופים Zn תלויה באיכות של הטיהור הכימית (טוהר Zn, comp הריק הנמוךהנגר לסכום של Zn הווה במדגם, תשואה גבוהה כימית לנוהל) ועל השליטה בהטית אינסטרומנטלי. יש צורך בטוהר הגבוה של חלק Zn הסופי להסרת שני הפרעות isobaric והפרעות שאינן isobaric שיוצרות אפקט מטריקס. nuclides Isobaric ליצור הפרעות ישירות (לדוגמא, ⁶⁴ ניקל). הפרעות ללא isobaric ליצור אפקט "מטריקס" שנקרא ולשנות את הדיוק אנליטי של המדידות על ידי שינוי מצבו של היינון בהשוואה לסטנדרטי אבץ הטהור שהדגימות לעומת ^1. ריק (<10 ng) נמוך מצביע על כך שאין זיהום של הדגימות על ידי Zn החיצוני שהיית הטיה ההרכב האיזוטופי נמדד. כפי שניתן מופרדים איזוטופים Zn במהלך חילופי יונים כרומטוגרפיה ^2, האוסף של כל אטומי Zn מבטיח כי אין חלוקה איזוטופים מתרחשת, מה שמרמז כי ההליך הכימי צריך להיות תשואה מלאה. לבסוף, התיקון של חלוקה איזוטופים סייעה במהלך מדידת ספקטרומטר המסה נעשה באמצעות השיטה "מדורגת סטנדרטי".

מדידות מדויקות לכן, הקשיים העיקריים להשגה שולטים בזיהום החיצוני (כלומר, נמוכות ריק), הפקת טיהור כימית תשואה מלאה שהיא נקי מכל אטומים או מולקולות אחרים, ותיקון חלוקה איזוטופים סייעה במסה-ספקטרומטר. במאמר זה נתאר פרוטוקול האנליטיות שלנו להפריד בין Zn מאיברי העכבר, כמו גם מדידות ספקטרומטר המסה.

החילוץ נעשה באמצעות כמות נמוכה של חומצות מדוללים (HBr / HNO ₃ תקשורת) על מיקרו-טורים (0.5 μl 0.1 μl) של שרף אניון-חליפין. יש לה תשואה מלאה ויש לי מדידות שחזור חיצוני טוב יותר מאשר 50 עמודים לדקה על יחס Zn ⁶⁶ Zn / ^64. יתרון נוסף של ספידOD הוא שזה מאוד מהר. השיטה לכן מותאמת היטב למדעי רפואה, שבו יש צורך לנתח מספר גדול של דגימות בהשוואה למדעי כדור ארץ, שבו שיטות אנליטיות אלה פותחו.

Protocol

הערה: נהלים כרוכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) באוניברסיטה של ​​פאריס דידרו.

1. הכנת חומרים

1. תת-רתיחה לזקק 1 ליטר של החומצות ₍₃ HNO, HBr) כדי לטהר אותם מטומאה.
2. נקה את הכוסות ומתאם קצה ב( ~ 100 מעלות צלזיוס) חמה מרוכז HNO ₃ אמבטיה חומצה לפחות יומיים.
3. שטוף את הטיפים פיפטה בN 3 HNO אמבטיה ₃ קרה במשך כמה ימים ולשטוף בנפרד שלוש פעמים במי דה מיונן.

הכנת 2. דוגמא

1. להרדים את העכברים בזריקת intraperitoneal של קטמין ו xylazine. להעריך הרדמה בשיטת צביטת הבוהן.
2. לאסוף את הדם על ידי לנקב לב בנוכחות של הפרין בצינורות 1.5 מיליליטר.
3. הפרד את הפלזמה מתאי דם על ידי צנטריפוגה (10 דקות, 1500 XG) ולהעביר את הפלזמה לפוליפרופילן גבקבוקוני ryogenic באמצעות טיפים פוליפרופילן.
4. הסר את הדם שנותר מאיברים על ידי חיתוך ורידי הכבד והזרקת DPBS דרך הלב. להעריך מותו של העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם.
5. לקצור את האיברים עם מכשירי נירוסטה סטרילי, לשחרר אותם מסביב שומן אם בכלל, וצמד-להקפיא אותם בצלוחיות קריוגני פוליפרופילן.

3. כימי טיהור

1. ראשית, לפזר את הדגימות בתערובת של ~ 1 מיליליטר של (30%) מרוכזים H ₂ O ₂ ו~ 1 מיליליטר של HNO המרוכז (~ 15 M) _3. האם כל הצעדים הללו בתוך מנדף.
   1. מניחים את כל האיבר של עניין לתוך כוס טפלון 15 מיליליטר. לאחר מכן, להוסיף H ₂ O ₂ / HNO ₃ לכוס ^5. שמור את הכוס פתוחה לכמה דקות על מנת למנוע כתמים בשל תגובת חמצון של החומר האורגני והשחרור של CO _2.
   2. לבסוף, לשים את הכוס על צלחת חמה בABOC ° 100 ut לכמה שעות או עד הפתרון הוא ברור לחלוטין.
2. פתח את הכוס ולייבש את הפתרון על צלחת חמה בכ -100 מעלות צלזיוס.
3. לאחר המדגם הוא יבש, להוסיף 1 מיליליטר של 1.5 N HBr לדגימות; לסגור את הכוס ולתת לו לפזר על צלחת חמה ב 100 מעלות צלזיוס במשך כמה שעות.
4. בינתיים מכין את 500 העמודים μl.
   1. הוסף 500 μl של שרף רשת AG1X8 200-400 לעמודה ולשים אותו על מדף הטור עם כוס אשפה מתחתיו. לשטוף את השרף על ידי לסירוגין: 5 מיליליטר של 18.2 MΩ ⋅ מים סנטימטר, 5 מיליליטר של 0.5 N HNO _3, 5 מיליליטר של מים, 5 מיליליטר של 0.5 N HNO _3, ולאחר מכן 5 מיליליטר של מים. להתנות את השרף עם 5 מיליליטר של 1.5 N HBr.
5. הסר את הכוסות מהצלחת החמה ולשים אותם באמבטיה קולית לכ -30 דקות, ולאחר מכן לתת לכוסות להתקרר RT.
6. ברגע שהכוס היא מקוררת והשרף הוא שטף, לפתוח את הכוס. שים את מתאם הקצה לtהוא המזרק, להוסיף טיפ פיפטה; פיפטה 1 מיליליטר של מדגם ולטעון אותו על השרף (מאוד לאט כדי לא להתסיס את השרף).
7. לאחר שכל הנוזל עובר דרך הטור, להוסיף 5 מיליליטר של 1.5 N HBr.
8. ברגע 5 מיליליטר של 1.5 N HBr לעבור הטור, להחליף את כוס האשפה עם כוס 15 מיליליטר נקי.
9. הוסף 5 מיליליטר של 0.5 N HNO ₃ 2.5 מיליליטר בכל פעם. בשלב זה Zn הוא eluted מהשרף.
10. ברגע 5 מיליליטר של HNO ₃ עובר דרך הטור, להסיר את הכוס ומניח אותו על צלחת חמה ב 100 מעלות צלזיוס עד יבשה.
11. הסר את העמודה מבעל הטור; האשפה השרף (להשתמש שרף חדש עבור כל דגימה).
12. לאחר המדגם הוא יבש, לחזור על הפרוטוקול עם אותו הנפח של חומצות על עמודה קטנה יותר (100 μl) ולאחר מכן הנח אותו על צלחת חמה עד יבשה. המדגם מוכן כעת לספקטרומטר מסה.

4. ספקטרומטר מסת מדידה

1. לנתח compo איזוטופים Znsition בספקטרומטר פלזמה המונית בשילוב אספן-אינדוקטיבי רב (MC-ICP-MS).
   1. השתמש בפרמטרי המכונה מסוכמים בטבלה 1.
2. מקם את כוסות פאראדיי לאסוף במסה (m / z) של ⁶² Ni, ⁶³ Cu, Zn ^{64, 65} Cu, Zn ^{66, 67} ו ^-68 Zn Zn.
3. הכן תמיסה המכילה Zn 500 ppb 0.1 M HNO ₃ לניתוח איזוטופי.
4. נתח את פתרון 500 ppb של Zn באמצעות תא תרסיס בשילוב עם 100 μl / nebulizer טפלון דק '. עבור כל דגימה, למדוד 30 סריקות (בלוק 1 של 30 מחזורים) שבזמן האינטגרציה של כל סריקה הוא 8.389 שניות.
5. תקן את הרקע על ידי הפחתת עוצמות אפס על-שיא מפתרון ריק (M HNO הפתרון ₃ 0.1 שימוש מחדש לפזר את הדגימות).
6. בקרה והתערבות נכונה ⁶⁴ אפשריים Ni isobaric על ידי מדידת עוצמת שיא ניקל ^62.תניח ש/ ⁶² יחס ניקל ⁶⁴ Ni הוא טבעי (.2548), נכונים ערך זה מההטיה ההמונית אינסטרומנטלי, ולאחר מכן להסיר ⁶⁴ Ni במסה 64 כ:
   ⁶⁴ = ⁶⁴ Zn Zn _{האמיתי נמדד} - ⁶⁴ Ni = ⁶⁴ Zn _נמדד - ⁽⁶⁴ ניקל / ⁶² Ni) _הטבעי x ⁶² _נמדד ניקל.
7. לתקן את ההטיה ההמונית אינסטרומנטלי ידי bracketing כל אחת מהדגימות עם פתרון 500 ppb סטנדרטי של תקן JMC ליון Zn (או אחר סטנדרטית זמין כגון IRMM-3702). בצע מדורגת הסטנדרטי על ידי חלוקת יחס Zn ⁶⁶ Zn / ⁶⁴ של המדגם בממוצע של יחס Zn ⁶⁶ Zn / ⁶⁴ של שני הסטנדרטים נמדדו לפני ואחרי מדגם מינוס 1 ומוכפלים 1000 (ראה משוואה 1). דיוק חיצוני אופייני על תקן JMC ליון Zn הוא 0.05 permil / האמו (2 סטיית תקן, 2 SD).

תוצאות

ב 1.5 N HBr, המינים העיקריים האבץ (ZnBr3-) צורות מתחמים חזקים מאוד עם שרף אניון-החליפין, בעוד שרוב אלמנטים אחרים לא אינטראקציה עם השרף. האבץ הוא התאושש לאחר מכן על ידי שינוי הבינוני עד HNO המדולל _3, לשנות את התפצלות של Zn לZn ^{2 +} המשתחררת ^מ6,7 השרף.

Discussion

שחזור של המדידות מוערך באמצעות ניתוחים משוכפלים של אותו הדגימות שבוצעו במהלך פגישות אנליטיות שונות. לדוגמא ^6, יש לנו לשכפל את אותו הסלע יבשתי 7 פעמים והשגנו את התוצאות שדווחו בטבלה 2.

כצפוי מהתאוריה של חלוקה איזוטופ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Multi-collection inductively-coupled-plasma mass-spectromter	Thermo-Fisher
Anion-exchange resin AG1 X8 200-400	Bio-Rad	140-1443-MSDS
Teflon beakers	Savillex	200-015-12
In-house-made teflon colunms made with shrinkable teflon