ניתוח ההשפעות של תאי סטרומה על הגיוס של לויקוציטים מתזרים

Summary

היכולת של האנדותל מודלק לגייס leukocytes מזרימה מוסדרת על ידי תאי סטרומה mesenchymal. אנו מתארים שני מודלים במבחנה בשילוב תאים אנושיים עיקריים שיכול לשמש כדי להעריך גיוס נויטרופילים מזרימה ולבחון את התפקיד שתאי סטרומה mesenchymal לשחק בויסות התהליך הזה.

Abstract

תאי סטרומה להסדיר את הגיוס במחזור leukocytes במהלך דלקת דרך הצטלבות עם תאי האנדותל שכנים. כאן אנו מתארים שני מודלים במבחנה "כלי דם" ללימוד הגיוס של מחזורי נויטרופילים מזרימה על ידי תאי האנדותל מודלקים. יתרון עיקרי של מודלים אלה הוא היכולת לנתח כל צעד במפל ההידבקות לויקוציטים במטרה, כפי שהיה קורה בvivo. אנו גם מתארים כיצד ניתן להתאים את שני המודלים כדי ללמוד את התפקיד של תאי סטרומה, בתאי גזע mesenchymal זה מקרה (MSC), בויסות גיוס לויקוציטים.

תאי האנדותל עיקריים היו בתרבית לבד או יחד עם MSC אדם במגע ישיר על microslides Ibidi או בצדדים מנוגדים של מסנן Transwell למשך 24 שעות. תרבויות היו מגורה עם אלפא גורם נמק גידול (TNFα) למשך 4 שעות ושולבו assay הידבקות מבוסס זרימה. בולוס של נויטרופילים היה perfusedעל האנדותל למשך 4 דקות. לכידתו של זורם נויטרופילים ויחסי הגומלין שלהם עם האנדותל הייתה דמיינה ידי מיקרוסקופ שלב ניגודיות.

בשני המודלים, ציטוקינים גירוי מוגבר גיוס האנדותל של נויטרופילים זורמים באופן תלוי מינון. ניתוח של ההתנהגות של נויטרופילים גויסו הראה ירידה תלויה-מינון בגלגול ועלייה תלוי-מינון בגלגול דרך האנדותל. בשיתוף התרבות, MSC מודחק הידבקות נויטרופילים להאנדותל מגורה TNFα.

המודלים המבוססת על הידבקות הזרימה שלנו לחקות את השלבים הראשונים של גיוס לויקוציטים מהמחזור. בנוסף לויקוציטים, הם יכולים לשמש כדי לבחון את הגיוס של סוגי תאים אחרים, כגון תאים סרטניים MSC או מחזור מנוהלים טיפולי. דגמי שיתוף התרבות רב-שכבתי שלנו הראו כי MSC לתקשר עם האנדותל לשנות את תגובתם לציטוקינים פרו-דלקתיים, altering הגיוס של נויטרופילים. מחקר נוסף תוך שימוש במודלים אלה נדרש כדי להבין איך תאי סטרומה מרקמות שונות ותנאים (מחלות דלקתיות או סרטן) להשפיע על הגיוס של לויקוציטים במהלך דלקת.

Introduction

דלקת היא תגובה הגנתית לזיהום חיידקים או פגיעה ברקמות שדורשת רגולציה הדוקה של כניסה לויקוציטים וליציאה מהרקמה הדלקתית לאפשר ^1,2 רזולוציה. צלב-שיחה בין תאי האנדותל (EC) שכלי דם קו, כדוריות דם לבנות במחזור ותאי סטרומה רקמות תושב חיונית לתיאום תהליך זה ^3. עם זאת, גיוס בלתי מבוקר של כדוריות דם לבנות והפינוי יעיל שלהם לחזק את התפתחותן של מחלות דלקתיות כרוניות ^4. ההבנה הנוכחית שלנו של גיוס לויקוציטים בבריאות ובמחלה אינה שלמה ויש צורך במודלים חזקים יותר כדי לנתח את התהליך הזה.

המנגנונים התומכים בגיוס של לויקוציטים מהדם דרך כלי דם בEC venules פוסט-נימים תוארו גם ^1,2,5. כדוריות דם לבנות במחזור נלכדים על ידי קולטנים מיוחדים (למשל, VCAM-1, E-selectin, P-selectin) שהם מוסדרים על האנדותל מודלק. אינטראקציות חולפות אלה מאפשרים לויקוציטים לאינטראקציה עם כמוקינים משטח מחויב ומתווכים הנגזרים שומנים (או אנדותל או סטרומה במקור) המפעילים integrins לידי ביטוי על ידי כדוריות דם לבנות ^{6 11.} זה בתורו מייצב הגירת הידבקות וכוננים על פני האנדותל ולתוך הרקמה ^{12 15.} בתוך רקמה, גויס לויקוציטים נתונים לסוכנים הנגזר סטרומה המשפיעים על תנועתיות, תפקוד והישרדות ^16,17. ראיות הולכות ומצטברים מצביעות בבירור על אותות המתקבלים בכל שלב של לויקוציטים תנאי תהליך הגיוס למשנו. עם זאת, ההבנה של גיוס לויקוציטים שלנו נשארת שלמה ומעט מאוד ידוע על תנועת ויקוציטים עיצוב רכיבים בתוך רקמה.

בברמינגהם פיתחנו כמה מודלים "כלי דם" מבחנה ללמוד הגיוס של לויקוציטים מלזרום ^9,18,19. עכשיו אנו מבינים כי רגולטורים מיידיים כמעשה EC כלי דם של גיוס לויקוציטים בתגובה לשינויים במייקרו-הסביבה המקומית שלהם. באופן ספציפי, תאי סטרומה רקמה-תושב יכולים להסדיר באופן פעיל את התגובה הדלקתית, בחלקו על ידי שיחה עם EC כלי הדם השכן להשפיע תפקידם בגיוס ^3. הראינו בעבר כי תאי סטרומה שונים לווסת את היכולת של EC לתמוך הידבקות והגירה של לויקוציטים באופן רקמות ספציפיות, וכי ההשפעות אלה הופכים שינו במחלות כרוניות ^13,16,20,21. כך, תאי סטרומה להקים רקמה 'כתובת קודים "המגדירים את ההקשר של כל תגובה דלקתית ^22. לאחרונה, יש לנו הפגנו שMSC מח עצם נגזר (BMMSC) מטה-להסדיר בעצמת התגובה של EC לציטוקינים, שהביא לירידה בגיוס של שני נויטרופילים וימפוציטים ^23.

מנגנוני גובגיוס erning הובהר במבחנה השתמש בעיקר מבחני שילוב סוג תא בודד (למשל, EC) או חלבון בבידוד. עם זאת, מחקרים אלה לא לוקחים בחשבון את ההשפעות של סביבת הרקמות המקומית (כלומר, הנוכחות של תאי סטרומה) ​​על גיוס של לויקוציטים וההגירה הבאה שלהם לתוך הרקמה. כאן אנו מתארים שתי שיטות המבוססת על זרימה שבו תאי סטרומה, במיוחד mesenchymal תאי גזע (MSC), הם שיתוף תרבותי עם EC ^23. מודלים כאלה מאפשרים לנו לבחון את ההשפעה של תא סטרומה על תגובות אנדותל, ביכולת שלהם בפרט לתמוך גיוס לויקוציטים מזרימה.

Protocol

1. בידוד והתרבות של תאי האנדותל האדם יסודיים ותאי גזע mesenchymal

1. תאי בידוד והתרבות של אדם טבור אנדותל הווריד (HUVEC):
   1. שים חבל טבור על מגש עם נייר סופג ולרסס עם אתנול 70%. מניחים בברדס בתרבית רקמה. זהה את הווריד וcannulate בשני קצותיו. מניחים עניבת כבל סביב סוף cannulated כדי לאבטח אותו.
   2. לשטוף את דם ורידים עם PBS באמצעות מזרק. מלא מזרק עם אוויר ועובר דרך הווריד כדי להסיר ולהשליך את PBS השייר.
   3. הפשירי 10 מ"ג / מיליליטר collagenase סוג Ia ולדלל 1:10 ב PBS (סידן ומגנזיום כלורי) לריכוז סופי של 1 מ"ג / מיליליטר. לעבור פתרון collagenase לווריד עד ששני cannulae מלא. סגור את מהדק על cannulae בשני קצותיו.
   4. מכסה את המגש עם רקמה ולרסס עם אתנול 70%. הנח את הכבל לחממה עבור 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
   5. קח את הכבל החוצהשל החממה ולהדק קשרי כבל. לעסות בעדינות את כבל דקות 1. לשטוף את ההשעיה התא עם 10 מיליליטר PBS ולאסוף בצינור צנטריפוגות 50 מיליליטר.
   6. מלא מזרק עם אוויר ועובר דרך הווריד כדי להסיר כל PBS שייר פעמיים, איסוף PBS בצינור צנטריפוגות 50 מיליליטר המשמש בשלב 1.1.5. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות בRT.
   7. לשאוב supernatant וגלול resuspend ב 1 מיליליטר בינוני EC מלא. בינוני EC מורכב מM199 בתוספת 35 מיקרוגרם / מיליליטר סולפט גנטמיצין, 10 ng / גורם גדילה באפידרמיס אנושי מיליליטר, 1 מיקרוגרם / מיליליטר הידרוקורטיזון, 2.5 מיקרוגרם / B amphotericin מיליליטר, ו- 20% בסרום עגל עוברי.
   8. הוסף 4 מיליליטר של מדיום EC והשעית EC בבקבוק ² 25 סנטימטר. לשנות את המדיום ביום הבא ולאחר מכן כל 2 ימים.
   9. EC תערוכת מורפולוגיה כמו מרוצפת (איור 1Ai). עבור מבחני הידבקות, EC בדרך כלל זרע כאשר הם מגיעים למפגש 100% (ראה סעיף 1.4 ).
2. בידוד של תאי הגזע של וורטון mesenchymal הג'לי (WJMSC) מחבלי טבור אנושיים:
   1. לבודד MSC-נגזר ג'ל וורטון (WJMSC) מחבלי טבור טריים או מכבלים שכבר משמשים כדי לבודד EC. חתך את חבל טבור ל -5 סנטימטרים חתיכות ארוכות. חותך כל פיסה longitudinally לחשוף את כלי דם (עורקי 2 [לבן, נוקשה] ווריד 1 [צהוב, נפוח]).
   2. בעזרת מספריים ומלקחיים סטרילית להסיר את כלי הדם וזורקים. לחתוך את כל הרקמה לתוך 2 - 3 מ"מ ³ חתיכות. שימוש במלקחי מקום 2 - 3 מ"מ ³ חתיכות לתוך צינור צנטריפוגות 50 מיליליטר.
   3. להפשיר 100 מ"ג / מיליליטר סוג collagenase המניה השנייה ולדלל 1: 100 ב 10 מיליליטר PBS לריכוז סופי של 1 מ"ג / מיליליטר. להפשיר 20,000 U / hyaluronidase מניית מיליליטר ולדלל 1: 400 לריכוז סופי של 50 U / ml בפתרון collagenase.
   4. הוסף קוקטייל האנזימטית לצינור צנטריפוגות המכיל שברי הרקמה. דגירה fragmen הרקמהts במשך 5 שעות על 37 מעלות צלזיוס על הכתף איטי.
   5. לדלל את ההשעיה תא 1: 5 בPBS. מקום מסנן מיקרומטר נקבובית 100 לתוך צינור צנטריפוגות 50 מיליליטר חדש. יוצקים את ההשעיה התא על המסנן הנקבובית 100 מיקרומטר.
      הערה: נותרה שברי רקמה תישמר על המסנן ותאים ייאספו בצינור צנטריפוגות 50 מ"ל.
   6. מחק את המסנן. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 400 XG במשך 10 דקות ב RT. לשאוב supernatant וגלול WJMSC resuspend ב 12 מיליליטר מדיום תרבות WJMSC מלא (גלוקוז DMEM הנמוך, FCS 10% ו 100 U / פניצילין + 100 מיקרוגרם / מיליליטר תערובת סטרפטומיצין מיליליטר).
   7. זרע כל התאים בבקבוק תרבות ² רקמה 75 סנטימטרים. לשנות את המדיום לאחר שעות 24 עם 12 מיליליטר מדיום תרבות WJMSC מלא. החלף בינוני כל 2-3 ימים. תאים צריכים להגיע 70 - מפגש 80% בתוך 2 שבועות. מעבר כאשר WJMSC להגיע 70-80 מפגש% (ראה סעיף 1.4).
3. הרחבת MSC העצם נגזר מח (BMMSC):
   1. לבודד MSC האדם נגזר מח עצם (BMMSC) כפי שתואר קודם לכן ^24. הוסף 10 מיליליטר מדיום גידול MSC המחומם מראש (MSCGM) לתוך צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר.
   2. להפשיר בקבוקון של p2 BMMSC על ידי הנחת באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. מוסיף את ההשעיה BMMSC לצינור צנטריפוגות מכיל MSCGM. מערבבים היטב על ידי pipetting.
   3. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות בRT. לשאוב supernatant לחלוטין.
   4. תאי Resuspend ב 1 מיליליטר MSCGM ולספור את התאים באמצעות haemocytometer או דלפק תא דיגיטלי כגון cellometer.
   5. תאי זרע לתוך 75 סנטימטר ² צלוחיות תרבות בצפיפות של 5,000 - 6,000 תאים לכל ² סנטימטר ב- 12 מיליליטר MSCGM. לשנות את המדיום לאחר שעות 24 עם 12 מיליליטר MSCGM. תאי הזנה עם 12 מיליליטר MSCGM כל 2-3 ימים.
   6. מעבר כאשר BMMSC להגיע 70-80 מפגש% (ראה סעיף 1.4). תאים להציג מורפולוגיה fibroblastic (איור 1Aii).
4. ניתוק של EC ו- MSC:
   1. בינוני לשאוב מ -25 סנטימטר ² צלוחיות תרבות. הוסף 2 מיליליטר של EDTA 0.02% לכ -2 דקות. לשאוב EDTA ולהוסיף 2 מיליליטר טריפסין (2.5 מ"ג / מיליליטר). צפה במתחת למיקרוסקופ עד שהתאים הופכים עגולים.
   2. הקש על הבקבוק כדי לנתק את התאים. להשבית טריפסין ידי הוספת תרבות בינונית 8 מיליליטר (תלוי בסוג התא; בינוני EC לHUVEC, DMEM LG לWJMSC וMSCGM לBMMSC) לבקבוק התרבות והשעית העברת צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר.
   3. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות בRT. supernatant ולשאוב resuspend גלולה כפי שיתואר להלן.
      1. לpassaging של MSC, גלולה גלולה במדיום תרבות 3 מיליליטר. הוסף בינוני תרבות 11 מיליליטר לשלוש צלוחיות תרבות נפרדות 75 סנטימטר ^2. הוסף השעיה תא 1 מיליליטר לכל בקבוק תרבות (1: 3 מפוצל). WJMSC המעבר וBMMSC 3 פעמים (P3) לפני השימוש במבחני התרבות משותפת.
      2. לזריעת EC או MSC במבחני הידבקות - ראו סעיפים 2 ו -3.
5. MSC הקפאה:
   1. במעבר 3 MSC ניתוק כאמור בסעיף 1.4. לשאוב supernatant ו resuspend ב 3 מיליליטר CryoSFM קר כקרח. פיפטה 1 aliquots מיליליטר של השעיה תא לתוך 1.5 מיליליטר cryovials קר כקרח. שים cryovials במכל הקפאה.
   2. אחסן את המכל ב -80 CO ° / N. העברה לחנקן נוזלי. בקבוקון הפשרה של MSC (בצענה את פעולות 1.3.1 - 1.3.6). Resuspend MSC ב5 מדיום תרבות מיליליטר (לבחור בינוני מתאימים לWJMSC או BMMSC) וזרע לתוך בקבוק ² 25 סנטימטר.

2. הקמת Co-תרבויות תאי גזע האנדותל-mesenchymal על Ibidi Microslides

1. Trypsinize ומחוברות 25 סנטימטר ² בקבוק של EC (~ 1.5 x 10 ⁶ תאים; כסעיף 1.4). Resuspend בר ב380 μl MSCGM (1 x 25 סנטימטר ² בקבוק יהיה זרע שתי microslides 6 ערוצי Ibidi (~ 1.25 x 10 ⁵ / ערוץ), עבור מבחני הידבקות כל ty התאPES בתרבית MSCGM). הוסף 30 μl של ההשעיה EC לכל ערוץ (זה יכסה את אזור הצמיחה באמצעות פעולת נימים). דגירה microslide Ibidi על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ עבור שעה 1.
2. להוסיף 140 μl MSCGM לכל ערוץ ולאחר מכן לשאוב אותו. חזור פעמיים בסכום כולל של 3 שוטף. להוסיף 140 μl MSCGM ומקום בחממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ למשך 24 שעות.
3. לשיתוף תרבויות לנתק MSC (סעיף 1.4). לבצע ספירת תאים באמצעות haemocytometer או cellometer. התאם את הריכוז של MSC 1.5 x 10 ⁵ תאים / מיליליטר.
4. בינוני עודף לשאוב מערוצי Ibidi (שעזבו את אזור הגידול היחיד של הערוץ במדיום). להוסיף 30μl השעיה MSC לערוצי Ibidi. לשאוב את המדיום שנפלט מאזור הגידול של הערוץ ולהוסיף 30 μl אחר של ההשעיה MSC. חזור פעם נוספת ולאחר מכן למקם את microslide Ibidi בחממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _{2 <}/ Sub> עבור שעה 1.
5. להוסיף 140 μl MSCGM לכל ערוץ ולאחר מכן לשאוב אותו. חזור פעמיים בסכום כולל של 3 שוטף. הוספת נפח סופי של 140 μl MSCGM לכל ערוץ ומקום בחממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ למשך 24 שעות.
6. להפשיר 1 x 10 ⁵ U / ml מניית TNFα ולדלל 1: 1,000 בMSCGM לריכוז סופי של 100 U / ml (שווה ערך ל ~ 10 ng / ml). לבצע דילול סדרתי על ידי דילול 100 U / ml TNFα ידי 1:10 ב MSCGM להשיג 10 U / ml. לדלל 10 U / ml TNFα ידי 1:10 ב MSCGM להשיג 1 U / ml.
7. פנק את הערוצים עם TNFα על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות לפני assay. תנודות טמפרטורה במהלך טיפול ציטוקינים ישנו את דפוסי גיוס נויטרופילים נצפו. להוסיף MSCGM הטרי לערוצים שלא טופלו.

3. הקמת האנדותל-mesenchymal לתאי גזע Co-תרבויות במסננים

1. לנתק WJ או BMMSC כמתואר בסעיף 1.4. Resuspend גלולהב 1 מיליליטר MSCGM. לבצע ספירת תאי תאים באמצעות haemocytometer או cellometer.
2. להתאים את עוצמת קול, כך שהריכוז הסופי הוא 5 x 10 ⁵ MSC ב 500 μl של MSCGM.
3. מלקחיים סטריליים באמצעות היפוך 6-גם, 0.4 מיקרומטר מסנני PET Transwell ומקום בתיבת סטרילי.
4. זרע 5 x 10 ⁵ MSC על פני השטח החיצוניים של המסננים. דגירה מסננים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ עבור שעה 1.
5. לאסוף מדיה מהמשטח החיצוני של המסנן. לספור את מספר MSC שאינו חסיד בתקשורת. מסננים מחדש הפוך באמצעות מלקחיים ומקום סטרילי בצלחת 6-גם התאמה המכילה 3 מיליליטר MSCGM.
6. הוסף 2 מיליליטר של MSCGM על המשטח הפנימי של המסנן (איור 1). מניחים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ למשך 24 שעות. Trypsinize ומחוברות 25 סנטימטר ² בקבוק של EC (איור 1Ai; כסעיף 1.4).
7. Resuspend EC ב 8 מיליליטר MSCGM (1 x 25 הסנטימטר wi ² בקבוקזרע ll ארבעה מסננים 6-גם; ~ 5 x 10 ⁵ EC / מסנן). בינוני לשאוב מהחלק העליון והתחתון של המסננים נקבוביים. להוסיף MSCGM 3 מיליליטר טרי לתוך התא התחתון (מתחת למסנן). הוסף 2 מיליליטר השעיה EC אל פני השטח הפנימיים של כל מסנן. דגירה עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
8. הבינוני לשאוב כדי לשטוף את EC לא חסיד ולהחליף עם MSCGM הטרי. הגדר את המסננים חד-תרבות מקבילות EC על ידי זריעת תאים על המשטח הפנימי ללא MSC הזריעה הראשון. דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
9. בדוק שmonolayer EC הוא מחוברות ולא מכיל פערים. monolayers תת-מחוברות לא ניתן להשתמש עבור מבחני הידבקות (איור 1).
10. פנק את התאים העליונים ותחתונים של המסננים עם 1, 10, או 100 U / ml TNFα (שווה ערך ל ~ 10 ng / ml) על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות לפני assay (שתואר בסעיף 2).

4. בידוד של לויקוציטים

1. קח ורידיםדם ממתנדבים וaliquot בריאים מייד לתוך צינורות EDTA. צינורות היפוך בעדינות לתערובת.
2. שכבת מיליליטר Histopaque 1,077 2.5 על 2.5 מיליליטר Histopaque -1119 בסיבוב 10 מיליליטר תחתית צינור. 5 מיליליטר שכבת דם כל על שיפוע Histopaque. צנטריפוגה ב 800 XG במשך 40 דקות ב RT.
3. נויטרופילים קציר היקפיים polymorphonuclear (PMN) בממשק של Histopaque 1,077 1,119 ו( מעל השכבה כדורית אדומה). מניחים בתחתית עגולה 10 מיליליטר צינור ולעשות עד 10 מיליליטר עם PBSA. בעדינות להפוך צינור ו צנטריפוגות ב 400 XG במשך 5 דקות בRT.
4. לדלל 7.5% פתרון BSA 01:50 ל -100 מיליליטר PBS (סידן ומגנזיום כלורי) לריכוז סופי של 0.15% (w / v; PBSA). לשאוב supernatant וגלול ב 10 מיליליטר PBSA. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות בRT.
5. Resuspend ב 1 מיליליטר PBSA. קח aliquot 20 μl של ההשעיה התא ולהוסיף 380 PBSA μl (01:20 דילול). ספירת תאים באמצעות haemocytometer או cellometer. לדלל את conce הנדרשntration (1 x 10 ⁶ / ml עבור מסנני Transwell וmicroslide Ibidi) בPBSA. לשמור על ההשעיה נויטרופילים ב RT עד assay.

5. הרכבת מערכת הזרימה

1. הגדר את מערכת הזרימה כפי שמוצג באיור 1 ג. הפעל את התנור ומוגדר 37 מעלות צלזיוס. צרף מזרק 20 מיליליטר (להסיר את הבוכנה) ומזרק 5 מיליליטר לברז 3-בדרך. צרף את הברז לתא פרספקס באמצעות קלטת micropore.
2. למדוד ולחתוך חתיכת סיליקון 2/4 מ"מ הצינור (עבה) שהוא כ המרחק בין השסתום וברז 3-בדרך ארוכה. חותך 8 - חתיכה באורך 10 מ"מ של 1/3 מ"מ צינורות (דקים) ולהכניס לתוך קצה אחד של הצינור העבה. צרף את צד צינורות העבה אל ברז 3-בדרך.
3. חבר את קצה צינור הדק על נמל microvalve 3-בדרך האלקטרונית. זהו "המאגר לשטוף". חותך 6 - חתיכה ארוכה 8 מ"מ של צינורות עבים ודקים.
4. הכנס את צינורות הדקים לקצה אחד של הצינור העבה. עו"דACH צינורות העבים בסופו על מזרק 2 מיליליטר (להסיר את הבוכנה).
5. חבר את קצה צינור הדק של מזרק 2 מיליליטר על יציאה בmicrovalve האלקטרונית כדי להפוך את "מאגר המדגם". חבר את השסתום לתא זרימת המסנן על ידי מדידה וחיתוך חתיכה ארוכה של צינורות דקים שהיא המרחק בין microvalve ומרכז הבמה מיקרוסקופ.
6. למודל microslide, לצרף 8 - חתיכת מ"מ 10 של צינורות עבים לסוף בצינור הדק. הנח L צורת מחבר לסוף הצינור העבה. זה יהיה להתחבר לmicroslide. למודל המסנן, לצרף 8 - חתיכת מ"מ 10 של מד לחץ קו הכחול Portex חיבור צינורות לסוף בצינור הדק.
7. מניחים את קצה צינור הדק על microvalve. זהו הפלט המשותף למאגרים לשטוף ומדגם. מלא מאגרים עם PBSA. צינורות ראש על ידי זורם PBSA דרכם כדי להסיר בועות אוויר.
8. צרף צינורות מד לחץ ל-29 מ"מ (50 מיליליטר) של זכוכיתyringe. ראש המזרק על ידי מילוי עם 10 מיליליטר PBSA. הפוך את המזרק כך שהסוף היה מחובר לצינור פונה כלפי מעלה ודוחף החוצה את כל בועות האוויר. למלא עם 5 מיליליטר PBSA.
9. למודל microslide רק, לצרף 10 - חתיכת הצינור עבה 12 מ"מ לסוף צינור מד הלחץ המוביל למזרק הזכוכית. הנח L צורת מחבר על הסוף של הצינור העבה. מניחים את מזרק הזכוכית לתוך משאבת מזרק עירוי / נסיגה.
10. לחשב את זרימת מילוי השיעור (Q) נדרש כדי ליצור את לחץ גזירת קיר הרצוי (τ _w בפסקל, אבא) של 0.1 (מסנני Transwell) אבא או 0.05 (microslides Ibidi) Pa תוך שימוש בנוסחות הבאות:
    γ _w = (6.Q) / (ש"ש ²⁾
    τ = n.γ
    איפה רוחב w = הפנימי וh = עומק הפנימי של ערוץ הזרימה. n = צמיגות של הפתרון זורם; PBSA הוא n = 0.7 mPa.s. לתא זרימת מסנן צלחת המקביל, הרוחב (w) הוא 4 מ"מ והעומק (ח) הוא .133 מ"מ. דepth של החדר יכול להשתנות מעט בשל הבדלים בעובי של אטם Parafilm בשימוש. לmicroslide Ibidi, הרוחב הוא 3.8 מ"מ והעומק הוא 0.4 מ"מ.
    הערה: בשל הבדלים בממדים של ערוץ הזרימה, ודינמיקת לכידה אנו משתמשים לחצי גזירה שונים למודל microslide בהשוואה למודל המסנן ^6.

6. הגדרת פלייט המקביל תזרים לשכת שילוב מסננים

1. חותכי פיסת Parafilm (באותו הגודל כמו coverslip הזכוכית) באמצעות תבנית מתכת. לגזור חריץ 20 x 4 מ"מ בParafilm (כדי ליצור את ערוץ הזרימה) באמצעות תבנית מתכת. השתמש באטם לציון ערוץ הזרימה על coverslip הזכוכית.
2. יישר את הקצוות של מסנן 6-גם על coverslip הזכוכית. ודא שהמסנן מכסה את סימוני ערוץ זרימה. בזהירות לחתוך את המסנן באמצעות אזמל 10A הסוג.
3. לכסות בזהירות את המסנן עם אטם Parafilm, על מנת להבטיח כי ערוץ הזרימהחריץ הוא באמצע של המסנן (1D איור). השתמש בפיסת רקמה נקייה ולדחוף את כל בועות.
4. מניחים את coverslip בהפסקה של הצלחת התחתונה של חדר זרימת פרספקס. מקם את צלחת פרספקס העליונה מעל האטם ובורג הצלחות יחד (1D איור).
5. הפעל את ברז 3-בדרך, כדי לאפשר חיץ לשטוף (PBSA) לזרום דרך השסתום. חיבור צינורות מד לחץ ליציאת הכניסה של צלחת Persex העליונה. הפעל PBSA דרך ערוץ הזרימה לאפשר בועות כדי לעבור.
6. חבר את צינור מד לחץ ממשאבת המזרק לתוך פתח היציאה של צלחת פרספקס. הגדר את משאבת המזרק כדי למלא ולהפעיל לחץ. נקה כל PBSA שטפטף על הצלחת העליונה של החדר.
7. מניחים את החדר על הבמה של מיקרוסקופ שלב בניגוד הפוך. להתאים את המיקוד כדי להמחיש את EC מעל המסננים (איור 1).

7. הגדרת Microslides לזרימה

1. הנח את microslide על הבמה של מיקרוסקופ לעומת שלב היפוך. חבר את מחבר L בצורה ליציאת הכניסה של ערוץ. הפעל PBSA דרך ערוץ הזרימה.
2. הנח את L בצורת מחבר ממשאבת המזרק לתוך פתח היציאה של הערוץ. הגדר את משאבת המזרק כדי למלא ולהפעיל לחץ. נקה כל PBSA שנטף על microslide. להתאים את המיקוד כדי להמחיש את monolayer EC.

8. זלוף של תאי האנדותל במהלך Leukocytes

1. שים 2 מיליליטר של נויטרופילים המטוהרים למאגר המדגם ולהשאיר לחמם למשך 2 דקות. שטוף את האנדותל עם PBSA למשך 2 דקות.
2. הפעל את השסתום ON לינקב נויטרופילים מעל האנדותל. לספק בולוס נויטרופילים למשך 4 דקות. כבה את ה- השסתום ותנקב PBSA מהמאגר לשטוף לשארית הניסוי.
3. לוודא שאוויר בועות אינן עוברים דרך ערוץ הזרימה בכל נקודה במהלך assay כמו זה ישבש את monolay ECאה וניתוק סיבה של נויטרופילים חסיד.

לכידת 9. ההקלטה נויטרופילים והתנהגות

1. גיוס שיא נויטרופילים או במהלך זרימת נויטרופילים או פוסט-זלוף.
2. הפוך את כל ההקלטות הדיגיטליות של לפחות 5 - 10 שדות במרכז ערוץ הזרימה. זהה את מרכזו של הערוץ על ידי הזזת האובייקטיבית לקצה של הערוץ בנמל הכניסה וזיהוי אמצע הנמל.
   1. להקלטה בזמן זרימת נויטרופילים, לקחת תמונות של שדה אחד בכל 10 שניות 1 דקות. לנוע לאורך הערוץ ולהקליט שדה אחר דקות 1. חזור על פעולה עבור משך זמן של בולוס.
   2. להקלטת ההודעה זלוף-, לעשות 10 שניות הקלטה של ​​5 - 10 שדות למטה במרכז של ערוץ הזרימה להערכת ויקוציטים התנהגות (בדרך כלל 2 דקות לאחר תום בולוס נויטרופילים). קח תמונות בכל שנייה במרווח של 10 שניות. זה מאפשר מספיק זמן ללכידה מזרימה וההתנהגות של neutro חסידPhils להיות מנותח.
   3. להקליט שדה יחיד המכיל לפחות 10 נויטרופילים transmigrated במשך 5 דקות, לקחת תמונות כל 30 שניות. זה יכול לשמש כדי לחשב את המהירות של תאים נדדו (מעל או מתחת לאנדותל).
   4. להקליט עוד סדרה של 10 שדות לשנייה (בדרך כלל 9 דקות שלאחר זלוף-). זה מאפשר זמן נויטרופילים להעביר דרך monolayer האנדותל.
   5. עצור את משאבת המזרק ולהסיר את הצינור. לפרק את תא הזרימה ולשטוף את מאגר המדגם וצינורות. חזור על פעולה עבור מסננים / ערוצי microslide שלאחר מכן.

ניתוח 10. של יקוציט גיוס והתנהגות

1. לספור את מספר הנויטרופילים בכל תחום במהלך הקלטות שניות 10 בנקודת הזמן 2 דקות. כל התאים חייבים להיות נוכחים בשדה השני הראשון כדי לספור. תאים שבאופן חלקי בתחום על 2 צדדים (לדוגמא, ראש / יד גבול ימני) של שדה הראייה כלולים בהספירה, כל עוד הם נשארים בתחום למלא 10 שניות.
2. לחשב את המספר הממוצע של נויטרופילים חסיד לכל שדה. מדוד את האורך ורוחב של השדה שנרשם. לחשב את השטח של השדה. לחשב כמה שדות יש ב1 מ"מ ^2. הכפל את ספירת נויטרופילים הממוצעת במספר תחומים ב1 מ"מ ^2.
3. לחשב את המספר הכולל של נויטרופילים perfused על ידי הכפלת הסכום של נויטרופילים perfused (למשל, 2 x 10 ⁶ / ml Q * [למשל, .0999 מיליליטר / דקה לתא זרימת צלחת מקבילה]) על ידי משך בולוס (למשל, 4 דקות ).
4. מחלקים את הספירה / מ"מ נויטרופילים ² במספר הכולל של נויטרופילים perfused כדי לקבוע את המספר הכולל של תאים שדבקו (תאים / מ"מ חסיד ^{2/10 6} perfused).
5. להעריך אם נויטרופילים חסיד מתגלגלים, חסיד או transmigrated (וידאו משלים 1 ו -2) בתוקף.
   1. מתגלגל נויטרופילים הוא שלב בהיר ויעבור לאט לאורך monolayer האנדותל (1 - 10 מיקרומטר / sec; משלים וידאו 1).
   2. תאים היטב חסיד הם שלב בהיר וכבול אל פני השטח EC, או שנותרו נייח (כלומר, לא זז בעת הקלטה) או שעבר שינוי צורה והם נודדים על פני EC (איור 1Ei).
   3. נויטרופילים transmigrated הוא השלב כהה ומתחת לשכבת EC (איור 1Eii).
6. לחשב את אחוז התאים חסיד שמתגלגלים, נייח וtransmigrated. לחלופין, התנהגות נויטרופילים יכול לבוא לידי ביטוי במספרים סלולריים כולל שמפגינים התנהגויות השונות על ידי החלת באותה הנוסחה המשמשת לחישוב הידבקות מוחלטת (כפי שמתואר בצעדים 10.6-10.7).
   1. סמן את הקצה המוביל של נויטרופילים מתגלגלים. סמן את הקצה המוביל של אותו התא בסוף רצף 10 שניות. לצייר קו הימורWeen 2 נקודות ולמדוד את המרחק שהתאים נסע.
   2. לחלק ערך זה על ידי משך ההקלטה שבתא הוא גלגול (כלומר, 10 שניות). נסה ובחר נויטרופילים שנמצאים בתחום כבר 10 שניות המרווח כולו.
7. כדי לחשב את המהירות של נויטרופילים הנודדים מעל פני השטח (בהיר שלב שהשתנה בצורה) או מתחת לאנדותל (כהה שלב) להשתמש 5 דקות הקלטה (וידאו משלים 2).
   1. לצייר קווי המתאר של תאים נדדו בתחילת הרצף ולעקוב אחר תנועותיהם לאורך הרצף. רשמו את עמדות X ו- Y של centroid בכל מרווח דקות 1 לכל תא. לחסר ערכים של X ו- Y עמדה מהתמונה הראשונה של הרצף מהערכים בתמונה השנייה. זה מבוסס על משפט פיתגורס.
   2. הפחת את הערכים מהתמונה השנייה מהתמונה השלישית. לעשות את זה עבור כל התמונות ברצף. t כיכרהוא X וערכי Y ולהוסיף אותם יחד.
   3. שורש הריבועי ערך וכתוצאה מכך. לחשב את המהירות עבור כל תא על ידי חישוב ממוצע המהירויות יחושבו לכל מרווח דקות. מסלול 10 היגר נויטרופילים ולחשב את ממוצע המהירות.

תוצאות

בתחילה, נתחנו את ההשפעה של גירוי EC עם TNFα על הגיוס של נויטרופילים מזרימה באמצעות מודל Ibidi microslide (סעיף 7 - 9). בהעדר TNFα, מעט אם בכלל נויטרופילים דבקו monolayer האנדותל (איור 2 א). זה היה צפוי, שכלא טופל / המנוחה EC אינו מבטא את המולקולות הדרושות הידבקות (selectins) או כ...

Discussion

כאן אנו מתארים שני מודלים במבחנה "כלי דם" ללימוד הגיוס של מחזורי נויטרופילים ידי האנדותל מודלק. יתרון עיקרי של מודלים אלה הוא היכולת לנתח כל צעד במפל ההידבקות לויקוציטים במטרה, כפי שהיה קורה בvivo. יש לנו שנצפה קודם לכן עלייה תלויה-מינון בהידבקות נויטרופ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase Type Ia	Sigma	C2674	Dilute in 10 ml PBS to get a final concentration of 10 mg/ml. Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
Dulbecco's PBS	Sigma	D8662	With calcium and magnesium chloride. Keep sterile and store at RT.
1X Medium M199	Gibco	31150-022	Warm in 37 °C water bath before use.
Gentamicin sulphate	Sigma	G1397	Store at 4 °C. Add to M199 500 ml bottle.
Human epidermal growth factor	Sigma	E9644	Store at -20 °C in 10 µl aliquots.
Fetal calf serum (FCS)	Sigma	F9665	FCS must be batch tested to ensure the growth and viability of isolated EC. Heat inactivate at 56 °C. Store in 10 ml aliquots at -20 °C.
Amphotericin B	Gibco	15290-026	Potent and becomes toxic within a week so fresh complete HUVEC medium must be made up every week. Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
Hydrocortisone	Sigma	H0135	Stock is in ethanol. Store at -20 °C in 10 µl aliquots.
Collagenase Type II	Sigma	C6885	Dilute stock in PBS to a final concentration of 100 mg/ml. Store at -20 °C in 100 µl aliquots.
Hyaluronidase	Sigma	H3631	Dilute stock in PBS to a final concentration of 20,000 U/ml. Store at -20 °C in 100 µl aliquots.
100 µm cell strainer for 50 ml centifuge tube	Scientific Lab Supplies (SLS)	352360	Other commercially available cell strainers (e.g. Greiner bio-one) can also be used.
DMEM low glucose	Biosera	LM-D1102/500	Warm in 37 °C water bath before use.
Penicillin/Streptomycin mix	Sigma	P4333	Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
25 cc tissue culture flask	SLS	353109
75 cc tissue culture flask	SLS	353136
Bone marrow mesenchymal stem cells vial	Lonza	PT-2501	Store in liquid nitrogen upon arrival. Cells are at passage 2 upon arrival but are designated passage 0. Exapand to passage 3 and store in liquid nitrogen for later use.
Mesenchymal stem cell growth medium (MSCGM)	Lonza	PT-3001	Warm in 37 °C water bath before use. For Cell Tracker Green staining use medium without FCS.
EDTA (0.02%) solution	Sigma	E8008	Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
Trypsin solution	Sigma	T4424	Store at -20 °C in 2 ml aliquots. Thaw at RT and use immediately.
Cryovials	Greiner bio-one	2019-02	Keep on ice before adding before adding cell suspension.
Mr. Frosty Freezing Container	Nalgene	5100-0001	Store at RT. When adding cryovials with cells store at -80 °C for 24 hr before transfering cells to liquid nitrogen.
Ibidi u-Slide VI (0.4), T/C treated, sterile	Ibidi	IB-80606	Alternative models include glass capillaries, Cellix Biochips (www.cellixltd.com), BioFlux Plates (www.fluxionbio.com/bioflux/) and GlycoTech parallel plate flow chambers (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html).
Cell tracker green dye	Life technologies	C2925	Store in 5 µl aliquots at -20 °C. Dilute in 5 ml prewarmed (at 37 °C) MSCGM.
Cell counting chambers	Nexcelom	SD-100	Alternatively a haemocytometer can be used.
Cellometer auto T4 cell counter	Nexcelom	Auto T4-203-0238
Tumor necrosis factor α (TNFα)	R&D Systems	210-TA-100	Dilute stock in PBS to a final concentration of 100,000 U/ml. Store at -80 °C in 10 µl aliquots.
6-well, 0.4 µm PET Transwell filters	SLS	353090
K2-EDTA in 10ml tubes	Sarstedt		Store at RT.
Histopaque 1119	Sigma	11191	Store at 4 °C. Warm to RT before use.
Histopaque 1077	Sigma	10771	Store at 4 °C. Warm to RT before use.
10 ml round bottomed tube	Appleton Woods	SC211 142 AS
7.5% BSA Fraction V solution	Life technologies	15260-037	Store at 4 °C.
20 ml Plastipak syringes	BD falcon	300613
5 ml Plastipak syringes	BD falcon	302187
2 ml Plastipak syringes	BD falcon	300185
3M hypo-allergenic surgical tape 9 m x 2.5 cm	Micropore	1530-1	Use to secure the syringe tap onto the wall of the perspex chamber.
Silicon rubber tubing, internal diameter/external diameter (ID/OD) of 1/3 mm (thin tubing)	Fisher Scientific	FB68854	Cut silicon tubing to the appropriate size. All tubing leading directly to the electronic microvalve must be thin.
Silicon rubber tubing ID/OD of 2/4 mm (thick tubing)	Fisher Scientific	FB68855
Portex Blue Line Manometer tubing	Smiths	200/495/200	Tubing leading to the syringe pump.
3-way stopcock	BOC Ohmeda AB
Glass 50 ml syringe for pump	Popper Micromate	550962	Must be primed prior to use by removing any air bubbles.
Glass coverslip	Raymond A Lamb		26 x 76 mm coverslips made to order. Lot number 2440980.
Parafilm gasket	American National Can Company		Cut a 26 x 76 mm piece of parafilm using an aluminium template and cut a 20 x 4 mm slot into it using a scalpel 10a. Gasket thickness is approximately 133 µm.
Two perspex parallel plates	Wolfson Applied Technology Laboratory		Specially designed chamber consisting of parallel plates held together by 8 screws. The lower plate has a viewing slot cut out in the middle and a shallow recess milled to allow space for the coverslip, filter and gasket. The upper perspex plate has an inlet and outlet hole positioned over the flow channel.
Electronic 3-way microvalve with min. dead space	Lee Products Ltd.	LFYA1226032H	Electronically connected to a 12 volt DC power supply.
Syringe pump for infusion/withdrawal (PHD2000)	Harvard Apparatus	70-2001	Set the diameter to 29 mm and refill (flow) rate.
L-shaped connector	Labhut	LE876	To attach to the inlet and outlet ports onto the Ibidi microslide channel.
Video camera	Qimaging	01-QIC-F-M-12-C	Connected to a computer which enables digitall videos to be recorded.
Image-Pro Plus 7.0	Media Cybernetics	41N70000-61592	For data analysis. Manually tag cells displaying the different behaviors. Track cells for analysis of rolling and migration velocities.
Refer to product datasheets for details on hazards of using the reagents described here.