JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

שיטות שונות רבות קיימות למדידה של שלפוחית ​​תאית (EVS) באמצעות cytometry זרימה (FCM). כמה היבטים יש לשקול בעת קביעת השיטה המתאימה ביותר לשימוש. שני פרוטוקולים לכלי רכב חשמליים מדידה מוצגים, או באמצעות זיהוי אדם או גישה מבוססת חרוז.

Abstract

תאי שלפוחית ​​(EVS) היא שלפוחית ​​שנמצאה בנוזלי גוף, כי הם מעורבים מאוד בתקשורת בין תאים ומסייעים בויסות מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים קטנה, המופק מקרום. ניתוח של כלי רכב חשמליים באמצעות cytometry זרימה (FCM) כבר קשה לשמצה בשל גודלם הקטן וחוסר אוכלוסיות בדידות חיוביות לסמנים של עניין. שיטות לניתוח EV, תוך שיפור ניכר בעשור האחרון, עדיין בתהליך עבודה. למרבה הצער, אין אף אחד בגודל שמתאים לכל פרוטוקול, וכמה היבטים יש לקחת בחשבון בעת ​​קביעת השיטה המתאימה ביותר לשימוש. מוצג כאן מספר טכניקות שונות לכלי רכב חשמליים עיבוד ושני פרוטוקולים לניתוח כלי רכב חשמליים או באמצעות זיהוי אדם או גישה מבוססת חרוז. השיטות שתוארו כאן יסייע בביטול מצרפי הנוגדן נמצאים בדרך כלל בהכנות מסחריות, יחס אות לרעש גובר, ושערים הגדרה בf רציונליםashion שממזער גילוי של הקרינה רקע. הפרוטוקול הראשון משתמש בשיטת זיהוי אישית שמתאים במיוחד לניתוח נפח גבוה של דגימות קליניות, בעוד שהפרוטוקול השני משתמש בגישה מבוססת חרוז כדי ללכוד ולזהות כלי רכב חשמליים וexosomes קטנים יותר.

Introduction

תאי שלפוחית ​​(EVS) היא שלפוחית ​​שנמצאה בנוזלי גוף, כי הם מעורבים מאוד בתקשורת בין תאים ומסייעים בויסות מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים קטנה, המופק מקרום. ניתוח של כלי רכב חשמליים באמצעות cytometry זרימה (FCM) כבר קשה לשמצה בשל גודלם הקטן וחוסר אוכלוסיות בדידות חיוביות לסמנים של עניין. שיטות לניתוח EV, תוך שיפור ניכר בעשור האחרון, עדיין בתהליך עבודה. למרבה הצער, אין אף אחד בגודל שמתאים לכל פרוטוקול, וכמה היבטים יש לקחת בחשבון בעת ​​קביעת השיטה המתאימה ביותר לשימוש. מוצג כאן מספר טכניקות שונות לכלי רכב חשמליים עיבוד ושני פרוטוקולים לניתוח כלי רכב חשמליים או באמצעות זיהוי אדם או גישה מבוססת חרוז. השיטות שתוארו כאן יסייע בביטול מצרפי הנוגדן נמצאים בדרך כלל בהכנות מסחריות, יחס אות לרעש גובר, ושערים הגדרה בf רציונליםashion שממזער גילוי של הקרינה רקע. הפרוטוקול הראשון משתמש בשיטת זיהוי אישית שמתאים במיוחד לניתוח נפח גבוה של דגימות קליניות, בעוד שהפרוטוקול השני משתמש בגישה מבוססת חרוז כדי ללכוד ולזהות כלי רכב חשמליים וexosomes קטנים יותר.

כלי רכב חשמליים, הידוע גם בmicroparticles, הם שלפוחית ​​שנמצאה בנוזלי גוף שמעורבים בתקשורת בין תאים ומסייעים בויסות מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים 1 קטנה, המופק מקרום. דרך ביטוי של סמנים שונים משטח ו / או העברה ישירה של חומר ביולוגי, כלי רכב חשמליים יכולים לשנות את התפקוד של תאי נמען לשחק או הפעלה או דיכוי תפקידים בתקשורת בין תאית 2-4. כלי רכב חשמליים מבחינה קלינית, platelet-derived ידועים יש פעילות נוגדת קרישה חזקה 5, בעוד שאחרים כבר הוכיחו לתרום למגוון רחב של מצבים, מקידום metasta גידולsis 6 להגנה מפני מחלות 7. כלי רכב חשמליים יכול להיות מסווג לקטגוריות קטנות יותר של שלפוחית ​​שמקורן בתאים כגון exosomes וmicrovesicles (MVS), תלוי בגודל ובמנגנון של דור 8 שלהם. המינוח של תת-אוכלוסיות שלפוחית ​​שמקורן בתאים ממשיך להיות נושא לויכוח מתמשך 8,9, לעומת זאת, exosomes בדרך כלל מתואר כקטנים, 40 עד 100 חלקיקי ננומטר נגזרים מהיתוך endosomal עם קרום הפלזמה, בעוד MVS גדול יותר 100 עד 1,000 חלקיקי ננומטר נוצרו על ידי שפיכה של קרום הפלזמה 10. כאן, המונח הכללי "הרכב החשמלי" ישמש כדי להתייחס לכל הסוגים של שלפוחית ​​ביולוגית תאית שפורסמו על ידי תאים.

בידוד של כלי רכב חשמליים מכל הדם הוא הליך רב-שלבים ומשתני עיבוד רבים ושונים הוכחו משפיעים על תוכן EV, כוללים טמפרטורת אחסון ומשך 11,12, נוגד קרישה / חומר משמר המשמש 13 ושיטת צנטריפוגה משמשת 14. צורך בסטנדרטיזציה של המשתנים הללו הוביל להמלצות על ידי האגודה הבינלאומית על פקקת ותהליכי עיבוד דם ובידוד EV haemostasis מדעיים ותקינת הוועדה (ISTH SSC) לנכון 15,16, עדיין לא קיים הסכמה בין חוקרים על הפרוטוקול האופטימלי להשתמש 12. רובם מסכימים, עם זאת, כי משתנים מראש אנליטיים פיקוח הדוק הם חיוניים לנתונים מדויקים ושחזור.

על מנת לנתח את המכוניות חשמליות, חוקרים נצלו את שיטות שונות, ובכלל זה במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים 17, מיקרוסקופ אלקטרונים סורק 18,19, במיקרוסקופ כוח אטומי, אור דינמי פיזור 20,21 ומערבי סופג 22,23. בעוד FCM הוא שיטת בחירה של חוקרים רבים 9,24 - 26 בשל יכולות התפוקה הגבוהה שלה, ניתוח של כלי רכב חשמליים באמצעות FCM היהקשה לשמצה בשל הגודל וחוסר אוכלוסיות חיוביות בדידות 27 - 32. בהשוואה לניתוח של תאים, גודלו הקטן של כלי הרכב החשמליים בתוצאות 1) הקרינה הנפלטת פחות בשל המספר קטן יותר של אנטיגנים לכל חלקיק ו- 2) ההיתכנות מוגבלת של שטיפת הודעה כתם-, שיש צורך להפחית את קרינת רקע. אתגרים משותפים בין חוקרים כוללים אותות הנובעים מאגרגטים אימונוגלובולין 27,28 וצבירה עצמית של נוגדנים 29. יתר על כן, פעמים העיבוד הארוכות ונהלי כביסה / בידוד ממושכים בשימוש על ידי רב של הפרוטוקולים הנוכחיים 33,34 דורשים התחייבויות זמן רב היום לנתח מספר קטן של דוגמאות, שהופך אותם פחות אידיאלי עבור יישומי תפוקה גבוהים. חלק מהחוקרים לוותר שלב לשטוף לגמרי, טיוח בקרות שליליות FCM משמשים באופן מסורתי כמו מינוס הקרינה אחד (FMO) וisotypes נוגדן חסר תועלת עבור במדויק הערכת Bacהקרינה kground 30.

הפרוטוקולים שלנו מטפל בשלוש בעיות נפוצות שיכול לעכב ניתוח FCM נאות של כלי רכב חשמליים: אותות הנובעים מאגרגטים נוגדן ולא שלפוחית ​​אחרת, קושי בהסרת נוגדן מאוגד, וחוסר אוכלוסיות חיוביות ניכרו. הטכניקות המתוארות כאן יסייעו בביטול מצרפי הנוגדן נמצאים בדרך כלל בהכנות מסחריות, הגדלת יחס אות לרעש, וקביעת שערים בצורה רציונלית שממזערת גילוי של הקרינה רקע. שתי שיטות זיהוי שונות מוצגות כאן: הפרוטוקול הראשון משתמש בשיטת זיהוי אישית שמתאים במיוחד לניתוח נפח גבוה של דגימות קליניות, בעוד שהפרוטוקול השני משתמש בגישה מבוססת חרוזים כדי ללכוד ולזהות כלי רכב חשמליים וexosomes קטנים יותר.

Protocol

הערה: הפרוטוקולים הבאים בוצעו בהתאם לכל הנחיות מוסדיות, לאומיות ובינלאומיות לרווחת אדם. כל דגימות הסובייקט האנושיות נבדקו תחת לוח מוסדי סקירה (IRB) פרוטוקול -approved ועם הסכמה מדעת של הנושאים.

1. שיטה: פרט איתור שיטה

1.1) עיבוד לדוגמא / בידוד דם של כלי רכב חשמליים

  1. להקיז דם מתורם / מטופל לשני 10 מיליליטר צינורות זכוכית המכילים 1.5 מיליליטר של ACD-פתרון או נוגד קרישה מתאימה ותהליך מייד אחרות (תוך 30 מקסימום דקות) באמצעות פרוטוקול צנטריפוגה ההפרש 2-הצעד הבא.
    הערה: פרוטוקול זה יניב כ -10 מיליליטר של פלזמה עניה טסיות דם (PPP) מ~ 17 מיליליטר בשילוב של דם נמשך. אם יש צורך בפחות או יותר PPP, מספר הצינורות של דם שנאסף עשוי להיות בהתאם.
  2. צנטריפוגה דגימות ב1,500 XG במשך 10 דקות ב RTכדי להפריד את הפלזמה מהמעייל באפי ותאים אדומים. העבר 1.2 מיליליטר aliquots של supernatant הפלזמה לצינורות 1.5 מיליליטר צנטריפוגות, נזהר שלא להפריע את השכבות התחתונה המכילות את המעיל באפי ותאים אדומים.
  3. ספין ב13,000 XG במשך 10 דקות ב RT להסיר טסיות דם ושברי תאים גדולים. להעביר בזהירות את PPP, והותיר אחריו 200 μl להימנע להפריע גלולה ולהוסיף PPP לצינור חדש.
  4. בשלב זה, להשתמש PPP מייד לניתוח או להעביר ב1.0 מיליליטר aliquots 1.5 מיליליטר צינורות צנטריפוגות חדשים ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס למשך עד שנתיים לניתוח מאוחר יותר (ראה איור 1 א לסקירה).
  5. אם כלי רכב החשמליים מטוהרים יש צורך בניסויים פונקציונליים, העברה 6 מיליליטר של PPP לצינור ultracentrifuge ולהוסיף 28 מיליליטר של 0.2 ופר פוספט מיקרומטר המסונן (PBS). ספין במשך 60 דקות ב 100,000 XG ב RT באמצעות ultracentrifuge מצויד בהרוטור דלי מתנדנד. לשאוב supernatant וpel EV resuspendבוא ב 1.5 מיליליטר תקשורת.
    הערה: לשחזור הגבוה ביותר, צריכים להיות מעובד דגימות דם באופן עקבי ככל האפשר מתורם לתורם. כל וריאציה בשיטת בידוד EV באופן משמעותי יכולה להשפיע על המספר והסוג של כלי רכב חשמליים שזוהו.

1.2) הכנת דוגמאות לניתוח

הערה: מנקודה זו ואילך, הצעדים להסביר פרוטוקול תפוקה גבוהה לניתוח 12 דגימות במשך 14 סמנים ב 3 לוחות. עם זאת, שילובים אחרים של נוגדנים יכולים לשמש כאן; הפרוטוקול ניתן להתאים ללמוד אוכלוסיות EV אחרות על ידי החלפת הסמנים הציעו לאלה של עניין.

  1. הסר 12 דגימות ממקפיא (אם מאוחסן ב -80 ° C) והפשרה על 37 מעלות צלזיוס.
  2. תוכן פיפטה מעלה ומטה מספר פעמים כדי לערבב. הסר 320 μl מכל מדגם ולהוסיף לשורה העליונה של צלחת גם 96.
    הערה: pipet רב גם רוחב מתכוונן הוא מאוד מועיל לזה וצעדים רבים אחרים ברחבי התחתאיי, במיוחד בעת ניתוח דגימות מרובות בבת אחת.

1.3) דוגמאות מכתים EV

  1. לפני מכתים, לסנן את כל הנוגדנים (שרירי בטן) כדי להסיר אגרגטים, אשר יכול לגרום לאותות חיוביים.
    1. נוגדנים לשלב לשימוש בכל אחד מהפנלים 3 ל0.22 מיקרומטר צינורות נפרדים צנטריפוגלי מסנן צנטריפוגות באמצעות צנטריפוגות זווית קבועה יחידה מהירות (~ 750 XG) ב RT במשך 2 דקות, או עד שכל תערובת Ab עבר דרך המסנן ולא נוזלי נוגדנים נשאר על פני השטח של המסנן. קוקטיילים חנות Ab במקרר לתקופה של עד שבועיים, אך מחדש מסנן בכל פעם לפני השימוש.
  2. הוסף את הכמות המתאימה של תערובת Ab מסוננת היטב כל אחד בשורה 2 (לדוגמא, דגימות בלוח אני מגואלות 2 μl של כל Ab, כך כוללת של 12 μl של קוקטייל Ab המסונן מתווספת לכל גם לשורה 2). עיין באיור 1 ב 'למתווה של מפת הצלחת שהציע. חזור בנוסף אלהים לשורות מתחת אם יותר פנלים מנוהלים (כאן, להוסיף 8 μl / טוב של קוקטייל הלוח השני לחתור 3 ו -11 μl / טוב של קוקטייל הלוח III לחתור 4; מתייחס לחומרי רשימה לקבלת מידע לוח ספציפי).
  3. באמצעות pipet רב ערוצית, לערבב את דגימות PPP בשורת 1 למעלה ולמטה ולהעביר 100 μl מהבארות בשורה 1 לבארות בשורה 2. מערבבים למעלה ולמטה. טיפים שינוי וחוזר, העברת 100 μl מהשורה 1 לשורות 3 ו -4 דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

1.4) דוגמאות MV כביסה

  1. הסר את צלחת 96-היטב מ4 ° C והעברה לארון בטיחות ביולוגי. בעזרת פיפטה רבה, להוסיף 220 μl של PBS / גם לשורות 6-8 (שישמש לשטיפה / שטיפת הבארות המכילות PPP צבעוני).
  2. העבר את התוכן של כל אחד גם לצינורות מסנן צנטריפוגלי שכותרתו מראש באמצעות pipet רב ערוצית רוחב מתכוונן (במשך 12 דגימות, עם 3 פנלים של נוגדנים, 12 x 3 = 36 צינורות מסנןיהיה צורך). השימוש באותה הטיפים, להסיר 200 μl של PBS מהשורות לשטוף ולהוסיף לבארות המקבילות שממנו PPP רק הוסר.
  3. מערבבים למעלה ולמטה כדי לשטוף את הבארות ולהעביר את פתרון השטיפה לאותו מסננים כדי שPPP נוספו בעבר. צמרות קרובות של מסנני צנטריפוגלי. טיפים שינוי.
  4. חזור על תהליך זה עם הדגימות מוכתמות שנותרו עד שכל דגימות PPP המוכתמות הועברו יחד עם פתרונות שטיפתם למסנני צנטריפוגלי.
  5. העבר את מסנני צנטריפוגלי לצנטריפוגות הרוטור קבוע וספין ב 850 XG במשך 3 דקות ב RT.
    הערה: ודא שאין נוזל נשאר על צמרות המסנן. לאחר צנטריפוגה, המסנן צריך להיראות "יבש" ללא שכבת נוזל גלויה שנותרה על גבי. בעוד סביר, דגימות PPP מסוימות עשויות לדרוש זמן צנטריפוגה יותר לנוע ביעילות דרך המסנן.
  6. הסר את צינורות מסנן צנטריפוגלי ולחזור לארון הבטיחות הביולוגי.באמצעות pipet רב ערוצית, resuspend צמרות המסננים ב300 μl של PBS. העבר את תוכן resuspended מראש שכותרתו צינורות לניתוח FCM מיידי.
    הערה: זה מאוד חשוב לשמור על הכוח ומספר שקעי בוכנת פיפטה עקביים בין דגימות כדי למנוע וריאציה מדגם למדגם. זה אידיאלי צריך להיעשות באמצעות pipet אלקטרוני שכבר מתוכנת לpipet למעלה ולמטה נפח מסוים (לדוגמא, 280 μl) מספר פעמים (לדוגמא, 8 פעמים) עבור כל דגימה מדויקת.

1.5) התקנת Cytometer

  1. פתח את תוכנת FCM. לפני ניסוי התקנה, לבצע כיול מכשיר יומי והתקנה באמצעות חרוזים התקנת מכשיר (להלן הוראות יצרן).
  2. אם דגימות EV כבר מוכתמות נוגדן אחד או יותר וfluorochromes מרובים למדוד אותם בפעם אחת, לחשב ערכי פיצוי כדלקמן:
    1. הוסף 2 טיפות של חרוזים פיצוי מראשצינורות שכותרתו (צינור 1 עבור כל נוגדן fluorochrome מצומדות) ולהוסיף את הכמות המומלצת של נוגדן. הוסף 2 טיפות של חרוזים פיצוי שליליים לצינור אחר שישמשו כפיצוי השליטה בלא כתם.
    2. דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, לשטוף עם PBS וגלול ב400 μl של PBS.
    3. באמצעות cytometer הזרימה בתוכנות כלולות במכשיר, להפעיל את צינור כל פיצוי ולהתאים מתחי ניאון כדי למקם כל שיא בכ -10 4 בקנה מידת יומן 5 עשורים. ודא ששיא הקרינה הוא הגבוה ביותר (מבריק) בערוץ הניאון שלה בהשוואה לכל ערוצים האחרים, ולהתאים את המתחים של פרמטרים ניאון שוב במידת צורך. הפעל כל צינור comp בנפרד מוכתם וללכוד לפחות 5,000 אירועים לכל צינור.
    4. בחר את "הניסוי", ולאחר מכן בחר בכרטיסייה "פיצוי", ולאחר מכן בחר "חישוב פיצויים" כדי להחיל את ערכי פיצוי לכל הדגימות.
  3. הגדר את הפיזור קדימה (FSC) ופרמטרי צד פיזור (SSC) מתח כדי להיכנס בקנה מידה ובחר את הסף הנמוך ביותר המוותר בcytometer (FSC = 200 וSSC = 200) לכל אחד.
  4. תוך כדי ריצת שפופרת של PBS 0.22 מיקרומטר מסונן, להתאים את מתחי FSC וSSC לערכים הגבוהים ביותר שלא לכלול את רוב רעש רקע (כלומר, ממש מתחת לסף המתח שבקצב אירוע עולה 5 אירועים / sec).
  5. בשלב הבא, לרוץ צינור המכיל 0.2 מיקרומטר - 1.0 מיקרומטר חרוזים, בדילול מלא PBS במידת צורך. בFCS לעומת SSC עלילה, לצייר שער סביב אוכלוסיית חרוז ללכוד אירועים בין 0.2 מיקרומטר ו1.0 מיקרומטר. לחלופין, בהיסטוגרמה SSC-H, לצייר שער שיכלול את כל האירועים קטנים יותר מאשר 1.0 מיקרומטר חרוזים.
  6. להגדיר קצב הזרימה של cytometer ל" Lo "(כ 8-12 μl / min). שימוש בצינור חרוזים (או צינור אחר המכיל ריכוז ידוע של חרוזים) להתאים את קצב זרימה בחיוג על cytometer עד ערבשיעור NT מגיע לכ -200 אירועים / sec. קרא את כל צינורות המדגם באותו קצב הזרימה ולהשתמש באותו ריכוז חרוז בניסויים עתידיים על מנת להבטיח כי הספיקות להישאר עקביות בין ריצות.
  7. הפעל צינור של חלקיקי ניאון קשת מדולל PBS. לרכוש 5,000 אירועים. רשום את ערכי עוצמה הממוצעים לFSC, SSC, וכל ערוץ צבע. להשתמש בערכים אלה כדי להתאים את המתחים בניסויים עתידיים, כדי להבטיח שעוצמות הקרינה להישאר עקביות בין ניסויים.

1.6) קריאה לדוגמא

  1. להגדיר קצב הזרימה של cytometer ל" Lo "(כ 8-12 μl / min) ולהפעיל כל דגימה בדיוק 1 או 2 דקות.
  2. לאחר הקריאה הראשונה, להוסיף 20 μl של 10% NP-40 מדגם זה, פיפטה מעלה ומטה, ולקרוא מחדש לאותה הכמות של זמן (או דקות 1 או 2), כדי לאפשר לחיסור של אירועים חיוביים שזוהו ב מדגם lysed על מסגרת זמן שווה.
    הערה: זה מאוד שדortant כי דגימות להיות מעורבות באמצעות pipet ולא מערבולת. מניסיוננו, vortexing יכול לגרום צבירה עצמית של נוגדנים מסוימים, שהוביל לאירועים חיוביים מחקה-EV.
  3. ברגע שכל הדגימות אשר נקראו, יצוא כל קבצי .fcs לקובץ נפרד שישמשו לניתוח נוסף באמצעות תוכנת ניתוח FCM.

1.7) ניתוח נתונים

  1. פתח את תוכנת ניתוח FCM. לייבא את כל קבצי .fcs לתוך קובץ ניסוי חדש.
  2. פתח את חרוזים רק צינור. בFSC-מול SSC-עלילה, לצייר שער סביב כל חרוזים בגודל בין 0.2 מיקרומטר ו1.0 מיקרומטר. זהו שער EV. גרור כדי להוסיף לכל הדגימות.
  3. שימוש בדגימות lysed כפקדים שליליים, לצייר שערים בקצה של הקרינה רקע בכל ערוץ הקרינה בשימוש. גרור שערי ניאון לתוך שער EV של כל דגימה-lysed שאינו מתאים.
    הערה: בשלב זה הוא גם שימושי לבחון מגרשים דו-פרמטר ניאון כפול. צורות רקטות בברבע הכפול חיובי (ראה איור 8), במיוחד אם הסמנים ידועים מתגוררים בסוגים שאינם קשורים תא, עשויה להצביע על חפץ מצבירה או אירועי מחקי שלפוחית ​​אחרים.
  4. לכל סמן ניאון, להפחית את מספר האירועים במדגם lysed ממספר האירועים במדגם-lysed שאינו. לחלופין, לחלק את המספר הזה במספר הכולל של כלי רכב חשמליים בשער EV-lysed לא לקבל ערכים חיוביים%.

2. שיטה ב ': חרוזים שיטה

2.1) עיבוד לדוגמא / בידוד דם של כלי רכב חשמליים

  1. עיין בשיטת עיבוד דם מתואר בשיטה (סעיף 1.1).

2.2) הכנת דוגמאות לניתוח

  1. אם תרצה, fractionate PPP או מכוניות חשמליות ultracentrifuged לexosomes וmicrovesicles. הוסף 250 μl של PPP או מכוניות חשמליות ultracentrifuged ל0.22 מיקרומטר מסנני צנטריפוגלי ולהעביר לצנטריפוגות קבועה הרוטור וספין ב 750 xז 2 דקות בRT.
    הערה: ודא שאין נוזל נשאר על צמרות המסנן. לאחר צנטריפוגה, המסנן צריך להיראות "יבש" ללא שכבת נוזל גלויה שנותרה על גבי. בעוד סביר, דגימות מסוימות עשויות לדרוש זמן צנטריפוגה מעט יותר לנוזל לנוע ביעילות דרך המסנן.
  2. לשטוף ללא ציפוי 6 מיקרומטר חרוזי פוליסטירן (למשל, חרוזים ABC שליליים) 2x עם תקשורת RPMI, וresuspend ב 2 מיליליטר. להוסיף 6,000 חרוזים לכל צינור FACS. לצינור הבקרה השלילי, להוסיף 400 μl של תקשורת RPMI לבד לחרוזים. לכל צינורות האחרים, להוסיף 200 μl של PPP או מכוניות חשמליות ultracentrifuged (או שברים שלהם) ו -200 μl של תקשורת RPMI.
  3. התאם את הנפח הסופי של כל הצינורות 400 μl עם תקשורת ודגירת הלילה בשעה 4 ° C על שייקר.
  4. למחרת בבוקר, לשטוף החרוזים עם 2 מיליליטר של תקשורת. לשאוב את supernatant.
  5. לחסום עם 5% אלבומין בסרום שור (BSA) בתקשורת (400 μl) במשך 3 שעות ב 4 ו176 #; C על שייקר.
  6. לשטוף חרוזים עם 2 מיליליטר של תקשורת. גלולה לשאוב וגלול במדיום של 100 μl.

2.3) דוגמאות מכתים EV

  1. לסנן את כל הנוגדנים. השתמש באותו לוחות נוגדן המשמשים בשיטה, או אם תרצה בכך, ליצור שילוב של נוגדנים שונים, כל עוד fluorochromes עולה בקנה אחד זו עם זו.
  2. מערבבים את כל הנוגדנים לשימוש בפנל אחד לתוך צינור מסנן צנטריפוגלי 0.22 מיקרומטר. צנטריפוגה באמצעות צנטריפוגות מהירות יחידה זווית קבועה למשך 2 דקות או עד שכל תערובת Ab עברה דרך המסנן ולא נוזלי נוגדנים נשאר על פני השטח של המסנן.
  3. הוספת נפח מתאים של קוקטייל נוגדנים מסוננים לכל צינורות דגירה במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  4. לשטוף חרוזים עם 2 מיליליטר של תקשורת, גלול ב400 μl של תקשורת ולהפעיל באופן מיידי (או באותו היום) על cytometer זרימה.

2.4) Cytometer קריאת התקנה והדוגמא

  1. פתח את תוכנת FCM. לפני ניסוי התקנה, לבצע כיול מכשיר יומי והתקנה באמצעות חרוזים התקנת מכשיר (להלן הוראות יצרן).
  2. אם דגימות EV כבר מוכתמות נוגדן אחד או יותר וfluorochromes מרובים למדוד אותם בפעם אחת, לחשב ערכי פיצוי כדלקמן:
    1. הוסף 2 טיפות של חרוזים פיצוי מראש שכותרתו צינורות (צינור 1 עבור כל נוגדן fluorochrome מצומדות) ולהוסיף את הכמות המומלצת של נוגדן. הוסף 2 טיפות של חרוזים פיצוי שליליים לצינור אחר שישמשו כפיצוי השליטה בלא כתם. דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, לשטוף עם PBS וגלול ב400 μl של PBS.
    2. השימוש בתוכנת FCM, לרוץ צינור כל פיצוי ולהתאים מתחי ניאון כדי למקם כל שיא בכ -10 4 בקנה מידת יומן 5 עשורים. ודא ששיא הקרינה הוא הגבוה ביותר (מבריק) בערוץ הניאון שלה בהשוואה לכל ערוצים האחרים, ולהתאים מתחים של פרמטרים ניאון שוב במידת צורך. הפעל כל צינור comp בנפרד מוכתם וללכוד לפחות 5,000 אירועים לכל צינור.
    3. בחר בכרטיסייה "הניסוי" ואז "פיצוי" ואז "חישוב פיצויים" כדי להחיל את ערכי פיצוי לכל הדגימות.
  3. לשנות את FSC ופרמטרי מתח SSC להיכנס קנה מידה ובחר את הסף הנמוך ביותר המוותר בcytometer (FSC = 200 וSSC = 200) לכל אחד.
  4. דגימות לרוץ, שער על אוכלוסיית חרוזים גופייה ולרכוש 2,000 אירועים בשער הזה. קבצי .fcs יצוא.
  5. השתמש בתוכנת ניתוח FCM לנתח .fcs קבצים. שער בחרוזי גופייה. לחשב את עוצמת הגיאומטרית הממוצעת ניאון (MFI) עבור כל fluorochrome ולהשוות עם MFI של הביקורת השלילית.

תוצאות

איור 1 מתאר את התכנית הכוללת לעיבוד הבידוד וזיהוי של כלי רכב חשמליים או באמצעות השיטה המבוססת על חרוז או שיטת זיהוי אישית. זיהוי אישי של כלי רכב חשמליים באמצעות FCM עובד היטב לניתוח רכב חשמלי גדול יותר אבל רוב cytometers אינו מסוגל בנפרד גילוי חלקיקים קטנים כמו e...

Discussion

שני פרוטוקולים שונים לבידוד, הטיפול והניתוח של כלי רכב חשמליים הוצגו, תוך שימוש בזיהוי אדם או גישה מבוססת חרוז. בחירה בשיטה המתאימה ביותר לשימוש היא לא תמיד פשוטה ודורש הבנה של המדגם נבדק, כמו גם תת-האוכלוסיות בודדות של עניין. יתר על כן, את הרגישות של cytometer שימש לרכישה ?...

Disclosures

אי לנו ניגוד עניינים לחשוף.

Acknowledgements

המחברים מבקשים להודות לדייל הירשקורן מהדם מערכות מכון מחקר על עזרתו עם cytometer זרימת הגדרות מכשיר. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקי HL095470 וHL072268 U01 וחוזי DoD W81XWH-10-1-0023 וW81XWH-2-0028.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
LSR II benchtop flow cytometerBD Biosciences3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633 nm red)
FACS Diva software BD BiosciencesPC version 6.0
FlowJo software Treestar USMac version 9.6.1 or PC version 7.6.5
Sphero Rainbow fluorescent particlesBD Biosciences556298used to adjust all channel voltages to maintain fluorescence intensity consistency 
Ultra Rainbow fluorescent particles SpherotechURFP-10-5used in addition to Megamix-Plus SSC beads to ensure EV gating consistency from batch to batch
Megmix-Plus SSC beadsBiocytex7803used to adjust FSC and SSC  voltages to maintain  consistency  between runs. Can also used to monitor flow rate and ajust flow rate dial in order to ensure that same flow rate is used in all runs
AbC Anti-Mouse Bead KitLife TechnologiesA-10344used for compensation controls & negative AbC beads used for beads-based method
Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9)Santa Cruz sc-281108used in the individual detection method only to lyse samples after initial reading for use as negative controls. Stock may be diluted to 1:10 in PBS and stored in fridge for up to 1 month.
BD TruCOUNT TubesBD Biosciences340334used whenver absolute EV concentrations are needed
Ultrafree-MC, GV 0.22 µm Centrifugal Filter UnitsMillipore UFC30GVNBused to post-stain wash Evs and/or fractionate EVs based on size
Vacutainer glass whole blood tubes ACD-ABD Biosciences364606
Facs tubes 12x75 polystreneBD Biosciences352058
50 ml Reservoirs individually wrapped PhenixRR-50-1s
Green-Pak pipet tips - 10 µlRaininGP-L10S
Green-Pak pipet tips -200 µl RaininGP-L250S
Green -Pak pipet tips - 1,000 µl RaininGP-L1000S
Stable Stack L300 tips presterilizedRaininSS-L300S
Pipet-Lite XLS 8 Channel LTS Adjustable Spacer RaininLA8-300XLS
96 well tissue culture platesE&K ScientificEK-20180
RPMI 1640 Media (without Hepes)UCSF Cell Culture FacilityCCFAE001media used for bead-based detection method
Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2 µm filteredUCSF Cell Culture FacilityCCFAL003
Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-ClearBECKMAN COULTER INC344058
PANEL I
CD3 PerCP-Cy5.5Biolegend3448082 µl
CD14 APC-Cy7Biolegend3018202 µl
CD16 V450BD Biosciences5604742 µl
CD28 FITCbiolegend3029062 µl
CD152 APCBD Biosciences5558552 µl
CD19 A700Biolegend3022262 µl
PANEL II
CD41a PerCP-Cy5.5BD Biosciences3409302 µl
CD62L APCBiolegend3048102 µl
CD108 PE BD Biosciences5528302 µl
CD235a FITCbiolegend3491042 µl
PANEL III
CD11b PE-Cy7Biolegend3013222 µl
CD62p APCBiolegend3049102 µl
CD66b PE Biolegend3051062 µl
CD15 FITCexalphaX1496M5 µl
CD9 PEBiolegend555372
CD63 APCBiolegend353008
APC-Cy7 Ms IgG2a, κBiolegend400230

References

  1. Andaloussi, S., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
  2. Sugawara, A., Nollet, K. E., Yajima, K., Saito, S., Ohto, H. Preventing platelet-derived microparticle formation--and possible side effects-with prestorage leukofiltration of whole blood. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 134 (5), 771-775 (2010).
  3. Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature Reviews Immunology. 9 (8), 581-593 (2009).
  4. Mause, S. F., Weber, C. Microparticles Protagonists of a Novel Communication Network for Intercellular Information Exchange. Circulation Research. 107 (9), 1047-1057 (2010).
  5. Bouvy, C., Gheldof, D., Chatelain, C., Mullier, F., Dogne, J. -. M. Contributing role of extracellular vesicles on vascular endothelium haemostatic balance in cancer. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
  6. Hood, J. L., San, R. S., Wickline, S. A. Exosomes Released by Melanoma Cells Prepare Sentinel Lymph Nodes for Tumor Metastasis. Cancer Research. 71 (11), 3792-3801 (2011).
  7. Gatti, S., Bruno, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (5), 1474-1483 (2011).
  8. Barteneva, N. S., Fasler-Kan, E., et al. Circulating microparticles: square the circle. BMC Cell Biology. 14 (1), 23 (2013).
  9. Van der Pol, E., Böing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. Classification functions, and clinical relevance of extracellular vesicles. Pharmacological Reviews. 64 (3), 676-705 (2012).
  10. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  11. Dinkla, S., Brock, R., Joosten, I., Bosman, G. J. C. G. M. Gateway to understanding microparticles: standardized isolation and identification of plasma membrane-derived vesicles. Nanomedicine (London, England). 8 (10), (2013).
  12. Witwer, K. W., Buzas, E. I., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
  13. Shah, M. D., Bergeron, A. L., Dong, J. -. F., López, J. A. Flow cytometric measurement of microparticles: Pitfalls and protocol modifications. Platelets. 19 (5), 365-372 (2008).
  14. Dey-Hazra, E., Hertel, B., et al. Detection of circulating microparticles by flow cytometry: influence of centrifugation, filtration of buffer, and freezing. Vascular Health and Risk Management. 6, 1125-1133 (2010).
  15. Lacroix, R., Judicone, C., et al. Standardization of pre-analytical variables in plasma microparticle determination: results of the International Society on Thrombosis and Haemostasis SSC Collaborative workshop. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (6), 1190-1193 (2013).
  16. Mullier, F., Bailly, N., Chatelain, C., Chatelain, B., Dogné, J. -. M. Pre-analytical issues in the measurement of circulating microparticles: current recommendations and pending questions. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 693-696 (2013).
  17. Peramo, P., et al. Physical Characterization of Mouse Deep Vein Thrombosis Derived Microparticles by Differential Filtration with Nanopore Filters. Membranes. 2 (1), 1-15 (2012).
  18. Tilley, R. E., Holscher, T., Belani, R., Nieva, J., Mackman, N. Tissue Factor Activity is Increased in a Combined Platelet and Microparticle Sample from Cancer Patients. Thrombosis research. 122 (5), 604-609 (2008).
  19. Rood, I. M., Deegens, J. K. J., et al. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney international. 78 (8), 810-816 (2010).
  20. Van der Pol, E., Hoekstra, A. G., Sturk, A., Otto, C., van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R. Optical and non-optical methods for detection and characterization of microparticles and exosomes. Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 8 (12), 2596-2607 (2010).
  21. György, B., Szabó, T. G., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
  22. Miguet, L., Béchade, G., et al. Proteomic Analysis of Malignant B-Cell Derived Microparticles Reveals CD148 as a Potentially Useful Antigenic Biomarker for Mantle Cell Lymphoma Diagnosis. Journal of Proteome Research. 8 (7), 3346-3354 (2009).
  23. Smalley, D. M., Root, K. E., Cho, H., Ross, M. M., Ley, K. Proteomic discovery of 21 proteins expressed in human plasma-derived but not platelet-derived microparticles. Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 67-80 (2007).
  24. Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. Overcoming Limitations of Microparticle Measurement by Flow Cytometry. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 36 (08), 807-818 (2010).
  25. Mobarrez, F., Antovic, J., et al. A multicolor flow cytometric assay for measurement of platelet-derived microparticles. Thrombosis Research. 125 (3), e110-e116 (2010).
  26. Van der Pol, E., van Gemert, M. J. C., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry. Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 10 (5), 919-930 (2012).
  27. György, B., Szabó, T. G., et al. Improved Flow Cytometric Assessment Reveals Distinct Microvesicle (Cell-Derived Microparticle) Signatures in Joint Diseases. PLoS ONE. 7 (11), e49726 (2012).
  28. György, B., Módos, K., et al. Detection and isolation of cell-derived microparticles are compromised by protein complexes resulting from shared biophysical parameters. Blood. 117 (4), e39-e48 (2011).
  29. György, B., Pasztoi, M., Buzas, E. I. Response: systematic use of Triton lysis as a control for microvesicle labeling. Blood. 119 (9), 2175-2176 (2012).
  30. Trummer, A., De Rop, C., Tiede, A., Ganser, A., Eisert, R. Isotype controls in phenotyping and quantification of microparticles: a major source of error and how to evade it. Thrombosis Research. 122 (5), 691-700 (2008).
  31. Shet, A. S., Aras, O., et al. Sickle blood contains tissue factor-positive microparticles derived from endothelial cells and monocytes. Blood. 102 (7), 2678-2683 (2003).
  32. Connor, D. E., Exner, T., Ma, D. D. F., Joseph, J. E. The majority of circulating platelet-derived microparticles fail to bind annexin V, lack phospholipid-dependent procoagulant activity and demonstrate greater expression of glycoprotein Ib. Thrombosis and Haemostasis. 103 (5), 1044-1052 (2010).
  33. Nolte-’t Hoen, E. N. M., van der Vlist, E. J., et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, And Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
  34. Van der Vlist, E. J., Nolte-’t Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
  35. Orozco, A. F., Lewis, D. E. Flow cytometric analysis of circulating microparticles in plasma. Cytometry Part A. 77 A. 77A (6), 502-514 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

97microvesiclescytometryexosomesmicroparticles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved