השווה אולטראסאונד הדמיה משופרת להערכה של חוט השדרה זרימת דם בפגיעה בחוט השדרה הניסויית

Summary

Contrast Enhanced Ultrasound imaging is a reliable in-vivo tool for quantifying spinal cord blood flow in an experimental rat spinal cord injury model. This paper contains a comprehensive protocol for application of this technique in association with a contusion model of thoracic spinal cord injury.

Abstract

זרימה מופחתת חוט השדרה דם (SCBF) (כלומר, איסכמיה) ממלאת תפקיד מרכזי בהפתופיזיולוגיה טראומטית פגיעה בחוט השדרה (SCI), והוא בהתאם יעד חשוב לטיפולי נוירו. למרות כמה טכניקות תוארו להעריך SCBF, לכולם יש מגבלות משמעותיות. כדי להתגבר על זה האחרון, אנו מציעים שימוש בהדמיה בזמן אמת אולטרסאונד ניגוד משופר (CEU). כאן אנו מתארים את היישום של טכניקה זו במודל חולדה חבלה של SCI. קטטר הצוואר מושתל ראשון להזרקה החוזרת ונשנית של חומר ניגוד, פתרון נתרן כלורי של microbubbles מארז hexafluoride הגופרית. עמוד השדרה מכן התייצב עם 3D מסגרת מותאמת אישית ומאטר הדורה חוט השדרה הוא נחשף על ידי laminectomy בThIX-ThXII. הבדיקה אולטרסאונד אז הוא מוצב בחלק האחורי של מאטר הדורה (מצופה בג'ל אולטרסאונד). כדי להעריך SCBF בסיס, הזרקה תוך ורידית אחת (400 μl) של קונטרהסוכן רח מוחל להקליט המעבר שלו דרך נימי הדם הזעיר בעמוד השדרה בשלמותה. מכשיר ירידה במשקל משמש לאחר מכן כדי ליצור מודל חבלה ניסיוני לשחזור של SCI. חומר ניגוד מוזרק מחדש 15 דקות הבאות הפציעה להעריך שינויים פוסט-SCI SCBF. CEU מאפשר בזמן אמת וב- vivo הערכה של שינויי SCBF הבאים SCI. בבעלי החיים ללא כל הפגע, הדמיה אולטרסאונד הראתה זרימת דם לא אחידה לאורך חוט השדרה בשלמותה. יתר על כן, 15 דקות לאחר SCI, הייתה איסכמיה קריטית ברמה של המוקד בעוד SCBF נשאר השתמר באזורים המרוחקים יותר ללא פגע. באזורים הסמוכים למוקד הרעש (שני מקורי ואת הזנב), SCBF הופחת באופן משמעותי. זה מתאים לתואר קודם לכן "אזור פנומברה איסכמית". כלי זה הוא עניין גדול להערכת ההשפעות של טיפולים שמטרתן להגביל איסכמיה והנימק של רקמות וכתוצאה מכך לאחר SCI.

Introduction

פגיעה טראומטית בחוט השדרה (SCI) היא מצב הרסני שהוביל לירידת ערך המשמעותית במנוע, חושית ופונקציות אוטונומיות. נכון להיום, אין טיפול הוכיח את יעילותה בחולים. מסיבה כזו, חשוב לזהות טכניקות חדשות שתשפר את ההערכה של טיפולים פוטנציאליים ועוד יכול להבהיר pathiophysiology פציעת ^1.

SCI מחולק לשני שלבים רציפים, התייחס לפציעות ראשוניות ומשניים כ. הפגיעה העיקרית תואמת את העלבון המכני הראשוני. בעוד הקבוצות המשניות פציעת מפל של אירועים ביולוגיים שונים (כגון דלקת, סטרס חמצונים והיפוקסיה) שתורמים עוד יותר להרחבה ההדרגתית של הנגע הראשוני, נזק לרקמות וגירעון ^2,3 לכן נוירולוגיות.

בשלב האקוטי של SCI, טיפולי נוירו אלה נועדו לצמצם את הפתולוגיה פגיעה המשנית וציודולד בהתאם לשפר את תוצאות נוירולוגיות. בין אירועי הפגיעה המשניים הרבים, איסכמיה משחקת תפקיד מכריע ^4,5. ברמה של מוקד SCI, microvessels parenchymal הפגומה לעכב זרימה יעילה השדרה דם טבורי (SCBF). יתר על כן, SCBF גם הקטינה באופן משמעותי באזור המקיף את מוקד פגיעה, אזור ספציפי המכונה "אזור פנומברה איסכמית". אם SCBF לא ניתן לשחזר במהירות באזורים אלה, איסכמיה יכולה להוביל לנימק parenchymal נוסף ונזק לרקמות עצבים נוסף. כאפילו שימור הרקמות הקל יכול להיות השפעות משמעותיות של פונקציה, זה עניין גדול לפיתוח תרופות וטיפולים שיכולים להפחית איסכמיה לאחר SCI. כדי להדגיש את התופעה הזאת, עבודה קודמת הראתה כי שימור של 10% בלבד של אקסונים myelinated היה מספיק כדי לאפשר הליכה בחתולי פוסט-SCI ^6.

למרות כמה טכניקות תוארו להעריך SCBF,יש כל y מגבלות משמעותיות. לדוגמא, השימוש בmicrospheres רדיואקטיבי ^7,8 וC14-iodopyrine autoradiography ⁹ דורש הקרבת בעלי חיים שלאחר מכן ולא ניתן לחזור בזמן מאוחר יותר נקודות. טכניקת שחרור מימן ¹⁰ תלויה בהכנסה של אלקטרודות intraspinal, אשר עשוי לפגוע עוד יותר בעמוד השדרה. בעוד ההדמיה דופלר הלייזר, photoplethysmography ^14,15 וב- vivo מיקרוסקופ אור ¹⁶ יש עומק / שטח מצומצם מאוד של המדידה ^11-13.

צוות שלנו הראה בעבר כי אולטרסאונד הניגוד משופר הדמיה (CEU) ניתן להשתמש כדי להעריך בזמן אמת וב- vivo שינויי SCBF בparenchyma חוט השדרה עכברוש ^17. חשוב לציין כי טכניקה דומה מיושמת על ידי אל הואנג ואח. במודל חזירי של SCI ^18. CEU חל במצב ספציפי של ההדמיה אולטרסאונד המאפשר לשייך im מורפולוגיים בגווני אפורגילים (מתקבלים על ידי B-המצב הקונבנציונלי) עם פריסה המרחבית של זרימת דם ^19. ההדמיה SCBF והכימות מסתמכים על הזרקה תוך-של סוכני הד ניגודיות. חומר הניגוד מורכב מmicrobubbles hexafluoride הגופרית (כלומר קוטר של כ 2.5 מיקרומטר ו -90% בעל קוטר של פחות מ -6 מיקרומטר) התייצב בפוספוליפידים. Microbubbles משקפת את קורה אולטרסאונד הנפלט על ידי הבדיקה ובכך לשפר echogenicity דם וניגוד הולך וגדל של הרקמות על פי זרימת הדם שלהם. לכן ניתן להעריך את זרימת הדם באזור נתון של ריבית בהתאם לעוצמת האות לידי ביטוי. Microbubbles גם בטוחה והם יושמו קליניים בבני אדם. Hexafluoride הגופרית מנוקה במהירות (כלומר מחצית חיים מסוף הוא 12 דקות) ויותר מ -80% מhexafluoride הגופרית מנוהל הוא התאושש באוויר ננשף בתוך 2 דקות לאחר הזרקה. פרוטוקול זה מספק דרך פשוטה לשימוש im CEUהזדקנות להעריך שינויי SCBF בחולדה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הערה: השיטות שתוארו בכתב היד הזה אושרו על ידי הוועדה לביו-האתיקה בבית הספר לרפואה של Lariboisière, פריז, צרפת (CEEALV / 2011/08/01).

1. כלי הכנה

1. להכין ולנקות את המכשירים הבאים להכנסה קטטר: מיקרו-מלקחיים, מיקרו מספריים, מהדק מיקרו-וסקולרית, מספריים גדולים, חוט כירורגי (משי קלוע השחור 4-0) וקטטר 14 G. Heparinize הצנתר עם פתרון הפרין (5000 U / ml).
2. להכין ולנקות את המכשירים לlaminectomy הבאים: מספריים גדולים, אזמל וחותך עצם. בצע laminectomy עם חותך עצם מחוייט שנועד להפחית את הסיכון של פגיעה בחוט השדרה במהלך laminectomy (איור 1).
3. הגדרת מסגרת 3D בשימוש על מיקום וייצוב של החיה. המסגרת המותאמת אישית בנויה עם האלמנטים של הקיבוע חיצוני הופמן 3 בשיתוף עם מלקחיים, which כבר מעוקל כדי להתאים את עמוד השדרה המותני של בעלי החיים.
4. הכן את מכשיר ירידה במשקל (impactor) המשמש לפגיעה ביו-מכאנית בעמוד השדרה.
   הערה: מכשיר impaction מחוייט נועד עם תוכנת 3D ומודפס ב3D.
5. הפעל את המכונה אולטרסאונד.
6. הכן את הערכה לכינון מחדש של חומר הניגוד.
   הערה: הערכה כוללת בקבוקון המכיל 1 25 מ"ג של אבקת Lyophilised, מזרק מלא מראש 1 המכיל 5 מיליליטר מערכת אחת המיני-ספייק העברה (איור 2) כלוריד ונתרן. הצעדים לכינון מחדש של חומר הניגוד מפורטים להלן (בסעיף 5).

2. הצוואר וריד צנתור (איור 3)

1. להרדים את החיה עם isoflurane 4%. מניחים את החיה במצב שכיבה. לאשר הרדמה תקינה על ידי הבטחה כי בעל החיים אינם מגיבים כאשר כפות הם צבטו עם מלקחיים. החל משחה וטרינר בעיניים כדי למנוע יובש ואילו undהרדמה אה.
2. לגלח את הצוואר ולנקות את העור. עושה חתך בקו האמצע של הצוואר. לחזור שריר sternocleidomastoidian כדי למצוא וריד הצוואר הפנימי. להדק מייתר בחלק מקורי של הווריד.
3. החל מהדק כלי דם בווריד, 1 סנטימטר מתחת למייתר. עובר חוט אחר מסביב לווריד, ממש מתחת למהדק עם הקשר מוכן להיות להדק כאשר המהדק הוא שוחרר.
4. פתח את הקיר של הווריד (venotomy) בין המהדק והמייתר מקורי. להציג את צנתר G 14 בלומן של הווריד ולדחוף אותו לכיוון הלב.
5. כשמדובר נגד המהדק, לשחרר את האחרון ולדחוף את הצנתר נוסף. אבטח את הצנתר בווריד, על ידי תוקף הידוק הקשר על הווריד עם קטטר בפנים.
6. להעריך פתיחות של הצנתר על ידי משיכת כמות קטנה של דם ורידים בקטטר ולאחר מכן ולאחר מכן שטיפה זה עם מלוחים heparinized. זה מונע חסימה של גatheter על ידי קריש דם פוטנציאלי.
7. חבר צינור גמיש לקטטר להזרקה נוספת של חומר ניגוד (microbubbles). שמור את זה סגור (סגור) עד מוכן לשימוש.

3. גישה לשדרה, Laminectomy ועכברוש מיקום (ב3D המסגרת)

1. מניחים את החיה במצב אופקי נוטה שטוח. להתגלח ולנקות את הגב (אזור בית חזה) של בעלי החיים.
2. זהה את הצלע האחרונה (XIIIth בחולדה) על ידי מישוש (איור 4). זה מאפשר להעריך את המיקום של החוליה XIIIth החזה (ThXIII).
3. לעשות חתך 4 סנטימטר עור על קו האמצע, במרכז בThXIII. פתח את החתך בעור, כמו גם את הבורסה הבסיסית. שים לב לאלל של שרירי גב, כמו גם הטיפים של תהליכי עמוד השדרה בחוליות.
4. למקם בזהירות את תהליך עמוד השדרה של ThXIII ע"י מישוש צלעות XIIIth.
   הערה: צלעות XIIIth מחוברת לThXIII ולכן מייצגת קלה locaציון דרך אנטומיים te לזיהוי ThXIII. צעד זה מאפשר הלוקליזציה של ThXII לThIX תהליך spinous כמו גם (חוליות ראשונה ושנייה באזור המותניים) L1 ו- L2.
5. חותך את אָלָל השרירים ולנתק את השרירים משני צדי לחשוף את תהליכי spinous, laminas ומפרקי הפן מThIX לL2. לחשוף את ההיבטים הרוחביים של L1 ו- L2 ידי ניתוק שרירים מהתהליכים הרוחביים.
6. הוק שיניים החותכות של בעלי החיים ב3D המסגרת כדי לאבטח את העמדה (איור 5). הצמד את חוליות L1 ו- L2 עם המלקחיים שונה. חבר את המלקחיים שונה ל3D המסגרת כדי לייצב את בעלי החיים.
7. משכו בעדינות caudally המלקחיים מחזיקים עמוד השדרה המותני כדי להדק את כל עמוד השדרה ולרומם את בית החזה מהספסל.
   הערה: עם ההסדר המתואר בעלי החיים צריכים להיות מסוגלים לנשום. יתר על כן, למרות תנועות נשימה של כלוב הצלעות, עמוד השדרה ועמוד השדרהכבל צריך גם להישאר ללא תנועה.
8. הסר את processess spinous מThIX לThXII. הכנס בעדינות את הלהב הנחותים של להב העצם מתחת לlamina השמאל של ThXII ולאחר מכן לסגור את חתך העצם כדי לחתוך את lamina (איור 6).
9. חזור על אותו התרגיל לlamina תקין וברציפות להסיר את הקשת האחורית. חזור על השלבים הקודמים לThXI החוליות לThIX על מנת להשיג laminectomy ארבע ברמה. הסר את שני מפרקי הפן לכל חוליה.
   הערה: לאורך כל ההליך, לנקות את שדה הניתוח מדימום מקומי. לשם כך, השתמש בצמר גפן והשקיה עם מי מלח פושר. עצירת דימום באופן שיטתי מתרחשת בתוך דקות.

4. CEU בדיקה מיקום

1. מכסה את מאטר הדורה עם ג'ל אולטרסאונד. זה מאפשר העברת יעילה של גלי אולטרסאונד בין החללית ואת חוט השדרה (איור 7).
2. לייצב את שנינות הבדיקה אולטרסאונדמהדק חה שיכול להיות מחובר להמשך 3D המסגרת על ידי זרוע מפרקים. באופן ידני למקם את החללית. ודא שהבדיקה מכוונת להשגת פרוסת sagittal אורך אלכסונית. במיקום נכון, חוט השדרה הוא אופקי אך ורק על התמונה והתעלה של חוט השדרה המרכזית גלויה לאורך הקטע המלא של חוט השדרה.
   הערה: מיקום צריך להיות מונחה על ידי תמונת B-המצב בזמן אמת המוצגת על המסך של מכשיר אולטרסאונד. מרחק המוקד של הבדיקה אולטרסאונד צריך להיות מתואם עם התעלה של חוט השדרה המרכזית. בשלב זה, ההיבט האחורי של חוט השדרה הוא נגיש שסופו של דבר יאפשר למיצוב של impactor.
3. כאשר אופטימלי, לנעול את זרוע מפרקים כדי לייצב את המצב.

5. הכנת חומר הניגוד - Microbubble הכינון מחדש

1. שימוש בתוכן של ערכת הכינון מחדש מסחרית ולחבר את מוט הבוכנה על ידי חיזוקו tightly לתוך המזרק (עם כיוון השעון). פתח את שלפוחית ​​מערכת ההעברה ולהסיר את כובע קצה מזרק. פתח את מכסה מערכת ההעברה ולחבר את המזרק למערכת ההעברה (להדק בחוזקה).
2. הסר את דיסק מגן מהבקבוקון. חלק את הבקבוקון לתוך השרוול השקוף של
3. מערכת העברה ולחץ בחוזקה כדי לנעול את הבקבוקון במקום.
4. רוקן את התוכן של המזרק לתוך הבקבוקון על ידי לחיצה על מוט הבוכנה. לנער במרץ במשך 20 שניות כדי לערבב את כל התוכן בבקבוקון להשיג נוזל הומוגני חלבי לבן.
5. הפוך את המערכת ולסגת בזהירות את חומר הניגוד לתוך המזרק. להתיר את המזרק ממערכת ההעברה. לאחר הכינון מחדש (עפ"י הוראות), 1 מיליליטר של הפיזור וכתוצאה מכיל hexafluoride גופרית 8 μl בmicrobubbles. צייר את ההשעיה של microbubbles לתוך מזרק 100 מיליליטר. הכנס את מזרק 100 מיליליטר למשאבה החשמלית. סגור את המכסה.
6. התחל תסיסה מתמדת של מחדשmicrobubbles הממוסדת. תסיסה מתמדת מתקבלת על ידי סיבוב איטי של המזרק, ששומר על ההשעיה microbubble. חבר את המשאבה לקטטר וריד הצוואר באמצעות הצינור גמיש. להגדיר את מכשיר אולטרסאונד כדי "מצב הרמוני".
   הערה: האחרון התואם למצב שבו ניתן לאתר microbubbles במיוחד ודמיין. יש מצב זה מדד מכאני נמוך, אשר אינו להרוס microbubbles בניגוד לB-המצב.
7. לטהר את הצנתר על ידי יציקת מנה ראשונה (400 μl) של חומר ניגוד. במהלך העירוי ראשון זה, לבדוק שmicrobubbles מופיעה על מסך אולטרסאונד. זו מאשרת את המעגל השלם (מהמזרק למחזור הדם של החולדה) הוא שלם ופתוח.
8. להגדיר את מכשיר אולטרסאונד כדי "B-מצב" כדי להמחיש את parenchyma חוט השדרה וההרס של כמה microbubbles שנותרה במחזור הדם. התדירות הגבוהה של "B-Mode" טראןאנרגיה גבוהה סמיטס לmicrobubbles, המאפשרת להם התמוטטות.
9. בואו החיה שכבה עדיין על כ 30 דקות. תקופה זו מאפשרת לייצוב הפרמטרים haemodynamic.

6. הערכת SCBF בחוט השדרה השלמה

1. להגדיר את מכשיר אולטרסאונד כדי "המצב ההרמוני". התחל בו זמנית (1) עירוי של חומר ניגוד (400 μl) ו- (2) כרונומטר.
   הערה: במהלך העירוי, הריכוז של microbubbles בזרם הדם צריך להגדיל, המאפשר לדמיון הניגוד של חוט השדרה (איור 8). מאז microbubbles נהרסות במהירות, הריכוז של microbubbles הדם מתחיל לרדת פעם אחת ההזרקה הושלמה אשר מייצרת ירידה הדרגתית בהדמית ניגוד של חוט השדרה.
2. לאחר דקות 1, בחר (עיתונות) על כפתור "חנות קליפ" על המכונה אולטרסאונד. זה יאפשר אחד כדי להציל 1 דקות של Raw נתונים אולטרסאונד והווידאו ההדמיה הקלטה (שהוצג בעבר על מסך אולטרסאונד).
3. להגדיר את מכשיר אולטרסאונד כדי "B-Mode". זה יבטל את microbubbles שנותרה.

7. ניסיוני SCI

1. שימוש micromanipulator המחובר ל3D המסגרת, מקם את מכשיר impaction ירידה במשקל, כך שקצה impactor בא במגע עם הדורה מאטר (על קו האמצע חוט השדרה), בצומת בין THX וThXI (איור 9) .
   הערה: רמה זו צריכה להתאים לאמצע הקטע של חוט השדרה נצפה עם מכשיר אולטרסאונד. החלוץ והגוף של impactor הם 8 מ"מ קוטר. קצה impactor, שיפיק את הפגיעה, הוא 3 מ"מ קוטר.
2. מניחים את החלוץ של מכשיר impaction בעמדה 10 סנטימטר גבוה. לגרום SCI הניסיוני על ידי שחרור החלוץ של מכשיר impaction. החלוץ נופל ומשחרר הimpactor דואר, ופצע את חוט השדרה. Impaction המותאם אישית מספק מקביל השפעה למשקל 10 גרם שצנח מגובה של 10 סנטימטרים.

8. הערכת SCBF 5 דקות לאחר SCI

1. חזור על השלבים שתוארו בסעיף 6 (הערכה של SCBF). Microbubbles לא תוכל לעבור בנימי הדם הזעירה הפגומה ומוקד הפגיעה יישאר כהה (איור 10).

9. קורבן בעלי החיים

1. להרדים את החיה עם הזרקה תוך הצפק קטלני של pentobarbital (100 מ"ג).

10. כימות SCBF על ידי ניתוח מנותק

1. הפעל את תוכנת Ultra-להאריך משמשת לכימות (במכונה אולטרסאונד). בחר "קובץ" ולאחר מכן בחר את הנתונים גולמיים שנשמרו בעבר ולפתוח את הקבצים הקשורים. הפעל את "מצב הכימות" על ידי לחיצה על כפתור "צ'י Q" (בחירה). Sele גודלCT "הגדר החזר על ההשקעה" (כפתור) ולבחור את הצורה העגולה.
2. בחר "צייר ROI" (כפתור) ולצייר שבעה אזורים מעגליים סמוכים של עניין (ROI) בחוט השדרה (איור 11). פתח את התפריט "התאמה" ולבחור את הפונקציה "ערך Curve". שים לב לתוכנה בו מוצגות כמה עקומות, כל מתאים לשינויים של ריכוז microbubbles בתוך החזר על השקעה.
   הערה: לכל אחד יש עקומת פרופיל "זלוף-deperfusion". השלב הראשון של העקומה הוא שטוח ומתאים לתקופה שלפני הגעתו של microbubbles. בשלב השני, הריכוז של microbubbles מגדיל במהירות כתוצאה מהעירוי. בשלב השלישי, אשר מתחיל כאשר העירוי יושלם, הריכוז של microbubbles בהדרגה יורד ככל שהם disintegratse בזרם הדם.
3. מניחים את הקו האנכי הראשון בתחילת השלב השני של גurve ובחר "קבע". זה מודיע תוכנה מאיפה להתחיל ניתוח.
4. מניחים את הקו האנכי השני בסוף ההקלטה ושוב בחר באפשרות "SET". זה מודיע התוכנה היכן לעצור ניתוח.
5. תסתכל על תפריט "קורות חיים" ולהקליט את הערך "AUC", אשר תואם את "השטח מתחת לעקומה" ניתחה. ערך זה הוא פרופורציונאלי לSCBF בתוך ROI המקביל.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

עם הפרוטוקול שתואר לעיל, ניתן למפות את SCBF לאורך קטע sagittal אורך חוט השדרה.

בחוט השדרה שלם, נראה שיש אי סדרים SCBF בתוך parenchyma (איור 12). זה יכול להיות מוסבר על ידי ההפצה המשתנה של עורקי radiculo-לשדי (RMA) מבעלי חיים אחד למשנהו. RMA מתייחס...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

למרות שתארנו כיצד להשתמש CEU במודל חבלת עכברוש SCI, פרוטוקול זה יכול להיות שונה כדי להתאים את יעדי ניסוי אחרים או מודלים SCI. אנחנו בחרנו למדוד SCBF רק שתי נקודות בזמן (לפני פציעה ו -15 דקות לאחר SCI), עם זאת את מספר נקודות זמן, והעיכוב בין מדידות SCBF ניתן להתאימם לצורך של מחקרים א?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
External Fixator Hoffman 3	Stryker, Kalamazoo, USA		Modular system used to build the custom made 3D frame and the jointed arm holding the ultrasound probe
Toshiba Applio	Toshiba, Tokyo, Japan		Ultrasound machine
Sonovue	Bracco, Milan, Italy		Contrast agent : microbubbles
Vueject pump	Bracco, Milan, Italy		Electric pump for infusion of microbubbles bolus
Aquasonic Ultrasound Gel	Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA		Ultrasound gel used to transmit the ultrasound waves
Isovet	Piramal Healthcare, Mumbai, India		Isoflurane used for anesthesia
Ultra Extend	Toshiba, Tokyo, Japan		Software used for quantification of spinal cord blood flow
Mastercraft Five-piece Mini-pliers Set, Product #58-4788-6	Canadian Tire, Toronto, Canada		Set of pliers for Do-it-yourself job