הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Summary

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3’ UTR.

Abstract

תעתיק ורגולציה לאחר תעתיק לשניהם יש השפעה עמוקה על ביטוי גנים. עם זאת, מבחני סינון מבוסס תאים נפוצים אימצו להתמקד ברגולצית תעתיק, שנועדו במהותו בזיהוי של מולקולות מיקוד אמרגן. כתוצאה מכך, מנגנונים שלאחר תעתיק נחשפים במידה רבה על ידי פיתוח תרופות ממוקדות ביטוי גנים. כאן אנו מתארים assay מבוסס תאים שנועד לבחון את התפקיד של 'האזור מתורגם (3' 3 UTR) באפנון של הגורל של mRNA שלה, ובזיהוי תרכובות יוכלו לשנות אותה. Assay מבוסס על השימוש במבנה כתב בלוציפראז המכיל 'UTR 3 של גן של עניין המשולב ביציבות לקו תא מחלה-רלוונטית. הפרוטוקול מחולק לשני חלקים, עם ההתמקדות הראשונית על ההקרנה הראשונית שמטרתו זיהוי של מולקולות המשפיעות על הפעילות בלוציפראז לאחר 24 שעות של טיפול. החלק השני של הפרוטוקולמתאר את הצורך להפלות תרכובות ויסות פעילות לוציפראז במיוחד דרך UTR '3 הקרנה ללא מרשם. בנוסף לפרוטוקול מפורט ותוצאות נציג, אנו מספקים שיקולים חשובים על פיתוח assay והאימות של הלהיט (ים) על יעד אנדוגני. Assay הגן המתואר מבוסס תאי הכתב יאפשר למדענים לזהות מולקולות ויסות רמות חלבון באמצעות מנגנונים שלאחר תעתיק תלויים ב'UTR 3.

Introduction

לרגולצית תעתיק תקופה ארוכה של ביטוי גנים שחשבו לשחק עיקרי אם לא בלעדי תפקיד בשליטה על ייצור חלבון. צבירת ראיות, לעומת זאת, מצביע על כך שרגולציה לאחר תעתיק תורמת באותה מידה, אם לא יותר מ, רגולציה תעתיק לקבוע שפע חלבון תאי ^1,2. שליטה לאחר תעתיק של ביטוי גנים היא הרבה יותר מורכב ומשוכלל יותר מהייתה במחשבה ראשונה. למעשה, את כל השלבים השונים של בקרה לאחר תעתיק צמחו להיות מוסדרים, כוללים עיבוד mRNA, לוקליזציה, מחזור, תרגום ^3, כמו גם מתילציה RNA הפיכה תיארה זה עתה ^4. ממספר תהליכי רגולציה לאחר תעתיק מושפע באופן פוטנציאלי, assay מתואר להלן מתמקד באלה הקשורים 'האזור מתורגם (3' mRNA 3 UTR). 3 'UTR רחב משפיע גורל mRNA בעיקר באמצעות אינטראקציה ספציפית של יחסי ציבור מחייב RNAoteins וRNAs ללא קידוד רצפיה רגולציה ו / או מבנים משניים ^5. לכן, מולקולות קטנות המשנות אינטראקציות אלה או להפריע למסלולי העברת אותות במעלה הזרם תעבור את האיזון שמסדיר שפע חלבון. גישה טיפולית זו היא בעלת חשיבות מיוחדת לפתולוגיות אדם שלראיות מראים כי קיימות גנים של מחלות-רלוונטי נתונות לרגולציה שלאחר תעתיק, אשר מייצגת אפוא יעד פוטנציאלי להתערבות תרופתית. לכן, מערכות המאפשרות להקרנה של מאפננים 'רמות ה- mRNA באמצעות התערבות במנגנוני בקרה שלאחר תעתיק בפורמט תפוקה גבוהה יכולות להיות כלי רב ערך בזיהוי של טיפולי רומן פוטנציאליים.

Assay גן הכתב מבוסס התאים המתוארים מאפשר לזיהוי תרכובות מסוגלת לווסת את גורל mRNA באמצעות מנגנונים תלויים בה 3 'UTR. הוא מורכב מכמה ג העיקריomponents (איור 1) ודורש כמה צעדים ראשוניים כדי לאמת את הכדאיות של assay. קודם כל, לבנות הכתב נועד כולל UTR '3 מגן של עניין. 3 'UTR הוא התמזגו בסופו של גן כתב כגון לוציפראז גחלילית (איור 1). כל שינוי במנגנוני בקרה שלאחר תעתיק מופעל באמצעות 3 'UTR הוכנס ישנה את היציבות ו / או יעילות תרגום של תמליל chimeric זה, וכתוצאה מכך רמות לוציפראז מגוונות. לכן, שינויים בפעילות לוציפראז לשמש אמצעי עקיף של תקנה לאחר תעתיק המושפע של הגן של עניין. המרכיב השני של המערכת הוא לבנות כתב שליטה, פלסמיד ביטוי זהה המבטא את אותו גן הכתב אך אינו מכיל 'UTR 3. יכולים להיות מתוכנן שני פלסמידים הכתב במעבדה תוך שימוש בפרוטוקולי ביולוגיה מולקולרית קונבנציונליים או שנרכשו ממקורות מסחריים.

הבחירה של קו תא מתאים היא קריטית לבניית assay. איזה קו התא הוא המודל האופטימלי תלוי בגורמים רבים, החל מדרישות קליניות כמו דמיון מקסימאלי לפתולוגיה לסוגיות מעשיות רק כמו מאפיינים זמינות, transfectability, וצמיחה. חשוב לציין, לפני להמשיך יש לוודא כי שילוב של 3 'UTR לגן הכתב יש השפעה צפויה על הרמה של תמליל chimeric. היעדר ההבדל משמעותי באות בלוציפראז מן 3 'UTR כתב נושאות ושליטה בונת transfected זמני בתאים שנבחרו היה מציין כי 3' UTR הוא לא פונקציונלי במודל סלולארי זה, מה שגרם לחיפוש של חלופה אלה. לפורמט התפוקה הגבוהה, בונה כתב 3 נושאות UTR 'ולוציפראז השליטה צריכה להיות משולבת ביציבות בקו התא הנבחר. שימוש משולב על יציבות זמנית transfectedשורת תאים עדיפה מכמה סיבות. זה ירחיב את הבחירה של מודל סלולארי כולל שורות תאים שקשה transfect, להקטין את השונות בנתונים נובעים מתנודות ביעילות transfection, חולף עלויות. יתר על כן, על תאי transfection חולפים הם לעתים קרובות מאוד עמוסים עם פלסמיד דנ"א המוביל לרוויה של המערכת. בהגדרות אלה עלייה נוספת בביטוי העיתונאי עשויה להיות מאתגרת, וכתוצאה מכך ירידה ברגישות כלפי תרכובות upregulating פוטנציאליות.

לבסוף, כאשר כל רכיבי assay מוגדרים, זה קריטי, לפני שעבר לפורמט התפוקה הגבוהה כדי לקבוע את הכדאיות של assay, כלומר, אם פעילות לוציפראז יכול להיות אכן למעלה ובמיוחד באמצעות הוכנס 3 'למטה מוסדר UTR. הפקדים הטובים ביותר יהיו מולקולות קטנות דיווחו לווסת את היציבות או translatability של mRNA באמצעות UTR '3 של עניין. אם יש אלה הואלא ניתן, בקרות פונדקאיות מחקה את האפקט הרצוי מתקבלות. אלה יכולים להיות miRNAs או מחייב חלבוני RNA הידועים להפעיל האפקטים שלהם באמצעות קשירה ל'UTR 3 של עניין. הערכת בקרות כגון לפני ההקרנה הראשונית מצביעה לא רק את הפונקציונליות של assay פיתח, אלא גם מאפשרת להערכת הטווח, הרגישות שלה הדינמית וביצועים בפורמט התפוקה גבוהה.

באמצעות הפרוטוקול המתואר הוקרן ספריית 2,000 מתחם ^6. נוירובלסטומה, הגידולים מוצקים extracranial הנפוצים ביותר של גיל הינקות, שימשה כמודל ביולוגי ו'UTR 3 של אונקוגן MYCN, הגברה שמאוד מנבא תוצאות שליליות של נוירובלסטומה, כגן מטרה ^7. איור 2 מתארים את הפריסה הניסיונית. ההקרנה הייתה מחולקת בשלוש ריצות עם גודל אצווה של 27 צלחות הוקרנו בטווח אחד. הקבוצה של 27 צלחות כלולות ספריית ספקטרום אוסףצלחות הערת 1-N.8 + n.25 (הפעלה ראשונה), n.9-n.16 + n.25 (ריצה שנייה) וn.16-n.24 + n.25 (סיבוב שלישי), כל אחד צלחת הוקרנה בשלושה עותקים. כך, צלחת אחת ספרייה (n.25) הייתה assayed בתוך כל שלוש הריצות עושים השוואה בין-טווח אפשרי. הפרוטוקול להלן מתאר ריצה אחת של 9 צלחות ספרייה נבדקו בשלושה עותקים.

Protocol

הערה: התפוקה של מערכות assay זה תלויה בציוד המעבדה HTS זמין. פרוטוקול זה הוא בהנחייתם של טקאן חופש רובוט EVO 200, אשר מבצע טיפול נוזלי בפורמט 96-היטב. מזעור לפורמט 384 גם הוא גם אפשרי. מערכת הטיפול הנוזלי רובוטית ממוקמת מתחת הזרימה למינרית על מנת לשמור על תנאים אספטיים במהלך כל שלבי הניסוי. אם אין אוטומציה של טיפול בנוזלים זמינה, הפרוטוקול ניתן להתאים בקלות לפורמט נמוכה תפוקה.

הקרנה ראשונית

1. יום 1: הכן ותאי זרע

הערה: תאי זרע להניב מפגש 80% בעת מנסה לאמוד פעילות לוציפראז, כלומר, 48 שעות לאחר זריעה.

1. Resuspend trypsinized תאי נוירובלסטומה CHP134-mycn3UTR לריכוז של 2 × 10 ⁵ תאים / מיליליטר בRPMI המכיל 10% FBS ו -1% L- גלוטמין. במשך 27 צלחות להכין לפחות 250 מיליליטר של השעיה תא לוקחת בחשבון טיפול נוזלי, שקתות כרכים מתים וצעדי pipetting חוזרים ונשנים. יוצקים את ההשעיה התא לתוך מאגר סטרילי ולמקם אותו על שולחן הרובוט.
2. הנח 9 צלחות המינימרקטים לבנים שטוחות תחתונה 96-היטב ותיבה של 200 μl טיפים pipet סטרילי על שולחן הרובוט. מערבבים את ההשעיה התא על ידי pipetting לפני כל צעד היתר להימנע מתאי שיקוע תחת כוח הכבידה. לוותר 75 μl של תאים לתוך באר כל 9 צלחות כדי לקבל צפיפות סופית של 1.5 × 10 ⁴ תאים לכל טוב.
3. מכסה את הצלחות עם העפעפיים ולהשאיר אותם מחוץ לחממה למשך 30 דקות כדי לאפשר לתאים למשקעי תחתית הבאר. זה יהיה למזער את אפקט קצוות.
4. חזור על שלבים 1.2 ו -1.3 פעמיים כדי להכין את המספר כולל של 27 צלחות.
5. מקמו את הצלחות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ ו דגירה של 24 שעות.

2. יום 2: פנק את התאים עם תרכובות הספרייה

ntent "> הערה: ספריית המולקולה הקטנה ספקטרום האוסף מורכב של 2,000 תרכובות מסודרות בשורות 8 ו -10 עמודים ב- 25 96-גם צלחות בריכוז של 10 מ"מ בDMSO הבארות בעמודים הראשונים ואחרונים נותרו ריקות עבור פקדים. . מבחני מיון מתחם מבוצעים בדרך כלל בריכוז מתחם 1-10 מיקרומטר ^8. פרוטוקול ההקרנה המתואר כאן מתקן 2 מיקרומטר כריכוז העבודה ו -24 שעות כנקודת סיום assay.

1. להפשיר 9 צלחות ספריית מתחם בטמפרטורת חדר.
2. הכן שתי שקתות עם PBS סטרילי ופתרונות DMSO%-0.5 PBS ומניח אותם על שולחן הרובוט. לכל צלחת ספרייה, להכין ולתייג בהתאם צלחת דילול אחד - פוליפרופילן צלחת 96-היטב U-תחתונה עם נפח עבודה של לפחות 400 μl. מלא היטב בכל עמודות 2-11 לוחות דילול עם 398 μl של PBS סטרילי באמצעות טיפים הקבועים של המטפל הנוזלי. עמודים מלא 1 ו -12 עם 50 μl של PBS סטריליעם DMSO 0.5% על מנת לשחזר את ריכוז הרכב בבארות השליטה (0.02%).
3. מניחים שתי צלחות ספרייה, צלחות דילול שכותרתו בהתאמה, שתי קופסות של טיפים pipet סטרילי 50 μl ושש צלחות תאים על שולחן הרובוט. לחשוף לוחות תאים.
4. Pipet 2 μl של פתרון 10 מ"מ מניות מאחת משתי צלחות ספרייה בצלחת הדילול המתאימה ומערבבים היטב. זה יגרום ריכוז תרכובות ביניים של 50 מיקרומטר. באמצעות אותה הקבוצה של טיפים, לוותר 3 μl של דילול 50 מיקרומטר ב 3 96-גם צלחות הלבנות המינימרקטים עם תאים. תוצאות תכנית דילול זה ב 2 מיקרומטר עובד ריכוז של כל נבדקו מתחם.
   הערה: כדי למנוע מניפולציות מיותרות עם הטיפים, להשתמש סט מלא של 96 טיפים מההתחלה, למרות שצלחות הספרייה מכילות רק 80 תרכובות. זה אפשרי מאז ראשון והטורים האחרונים של צלחות הספרייה ריקים.
5. החלף את הטיפים pipet וחזור Step 2.4 לצלחת הספרייה השנייה.
6. מכסה את צלחות תאים ולהחזיר אותם לחממה למשך 24 שעות.
7. חזור על שלבי 2.3-2.6 פעמים נוספות לצלחות ספרייה שנותרו.

3. יום 3: בצע בלוציפראז Assay

הערה: לפני ביצוע assay בלוציפראז, ניתן זמנית אותו עם assay כדאיות תא המבוסס על הפחתה של resazurin על מנת לקבל מדד תא-כדאיות מכל הטוב ^9. לוציפראז Multiplexing וassay כדאיות תוצאות מבחני בהפחתה של אות בלוציפראז ש, לעומת זאת, אפשר להתעלם ממנו אם התאים לספק מספיק רמה גבוהה של פעילות בלוציפראז. פעילות לוציפראז יכולה להיות מזוהה על ידי מגוון רחב של חומרים כימיים assay ^10,11 לוציפראז מסחריים וביתיים עם אות זורח יציבה.

1. לאזן מגיב לוציפראז מחדש של בחירה לטמפרטורת חדר. ודא שעוצמת הקול הוא מספיק לכל צלחות assayed. במשך 27 צלחתשל 170 מיליליטר של מגיב לוציפראז יידרש תוך טיפול נוזלי חשבון, שקתות נפח מת וצעדי pipetting חוזרים ונשנים. יוצקים את מגיב לוציפראז לתוך מאגר ולמקם אותו על שולחן הרובוט.
2. הסר 9 צלחות עם תאים מן החממה, מניח אותם על שולחן הרובוט, לחשוף ולחכות עד equilibrated לטמפרטורת חדר. הוסף 50 μl של מגיב לוציפראז לכל צלחת היטב על ידי צלחת. בין הלוחות, להציג עיכוב שווה לזמן קריאת הארה של צלחת אחת. זה יבטיח שכל הצלחות נמדדות בתוך פרק זמן שווה מבנוסף מגיב.
3. לאחר דגירה 30 דקות, מניח את הצלחת הראשונה בluminometer ולמדוד הארה אחרי צעד רועד קצר. חזור על פעולה עבור כל הצלחות. רשום את הברקוד של כל צלחת ולשייך אותו לקובץ נתונים המקביל, כדי למנוע טעויות הנובעות ממספר רב של צלחות בטיפול.
4. חזור על שלבי 3.2-3.3 פעמיים במשך 18 הצלחות שנותרו עם תאים.
5. לאסוף את מגיב לוציפראז שנותר ולאחסן אותו ב -20 ° C.

4. יום 4: ניתוח נתונים

1. נתוני ניסוי תהליך באמצעות נורמליזציה של כל הדגימות לממוצע של בקרות רכב שטופל על-צלחת. לכל מתחם ספרייה, לחשב את ממוצע x הערך וSD על triplicates.
2. בחר עד-ויסות ולהיטים ידי קביעת סף של X ± k × SD, שבו x הערך הממוצע וSD מחושבים על כל ערכי assay מעובד, וk ויסות כלפי מטה הוא מוגדר קבוע.
3. בחר סף שרירותי חתוך <20% בקבוצת ביקורת שטופל ברכב כאשר הפחתה של אות בלוציפראז היא ככל הנראה קשורה עם רעילות מתחם. השלכת הלהיטים מתחת לסף זה יהיה להפחית באופן משמעותי מספר הלהיטים חיוביים שגויים בדלפק-ההקרנה.
   הערה: במקום נורמליזציה מבוססת שליטה, יכולים להיות מעובד נתוני ניסוי החלת ציון Z או B של האנלוגי החזקה שלהליבה ^12. בנוסף, גישות סטטיסטיות חלופיות לבחירת להיט זמינות ^12.

5. Counter-הקרנה

הערה: תרכובות שזוהו במסך הראשי (שכותרתו 'להיטים') הם אישרו והערכה לסגולית על ידי נגדי הקרנה.

1. לבחור לעצמה את הלהיטים שנבחרו מaliquots מאוחסן בצינורות המינימרקטים 2D אחת וליצור חדשים "פגעה צלחות", להציל את הפריסה המקבילה. אל תשכח להשאיר עמדות חינם לבקרה.
   הערה: בהעדר מערכת דובדבן-קטיף יעיל, אפשר לבדוק את שניהם שליטה ו -3 תאים 'UTR נושאות במקביל בהקרנה הראשונית. במקרה זה, בחירה ספציפית של תרכובות עם אפקטים תלויים רק ב3 'UTR הציג תתאפשר לאחר ההקרנה הראשונית ומבטלת את הצורך של נגד הקרנה. עם זאת, ההקרנה המקבילה בשתי שורות תאים תכפיל את assayעלויות.
2. בעקבות הפרוטוקול להקרנה הראשונית (סעיף "יום 1: הכן ותאי זרע"), עבור כל "צלחת פגע" להכין שלוש 96-גם צלחות של כל תאים יציבים CHP134-mycn3UTR וCHP134-CTRL.
3. בעקבות הפרוטוקול להקרנה הראשונית (סעיף "היום 2: פנק את התאים עם ספריית תרכובות"), להשתמש בכל צלחת להיט לטיפול בשלוש CHP134-mycn3UTR ושלוש צלחות CHP134-CTRL בשעה 2 מיקרומטר עובד ריכוז.
   הערה: בעוד דלפק המסך המתואר כאן מתבצע בtriplicates במנה אחת של 2 מיקרומטר, זה יכול להיות מועיל להחליף משכפל הסטנדרטי ולבדוק את הלהיטים ב 3 ריכוזים כפי 10 דילולים הנעים בין 2 מיקרומטר עד 20 ננומטר. יישום גישה זו לא יאפשר רק כדי לאשר את הנתונים של המסך הראשי, אלא גם לקבל נתונים מנה-תגובה ראשוניות על הלהיטים העיקריים, מזעור שיעורים חיוביים שגויים. במקרה זה, צינור ניתוח שונה צריך להיות applied לעבד את נתוני הניסוי ולאשר את הלהיטים.
4. בעקבות הפרוטוקול להקרנה הראשונית (סעיף "יום 3: בצע בלוציפראז Assay"), למדוד את הפעילות בלוציפראז בכל צלחות CHP134-mycn3UTR וCHP134-CTRL.
5. בעקבות הפרוטוקול להקרנה הראשונית (סעיף "יום 4: ניתוח נתונים"), לנרמל את הנתונים ניסיוניים מבארות שטופלו לממוצע של בקרות רכב שטופל על-צלחת ולחשב את הממוצע וSD על משכפל. עבור כל מתחם שנבדק, לחשב את שינוי הקיפול של פעילות לוציפראז בCHP134-mycn3UTR לעומת תאי CHP134-CTRL. בחר שינוי קיפול שרירותי לחתוך מחיקות של> 1.5 ומשמעות p-ערכים של <0.01.
   שים לב: בהגדרות assay תיארו את הפרמטר הקובע ללהיט סגוליות הוא שינוי משמעותי של פי פעילות לוציפראז בCHP134-mycn3UTR לעומת תאי CHP134-CTRL. אם יש צורך, אפשר גם להעריך רעילות מתחם על ידי ביצוע במקביל assay כדאיות תא על seתרכובות lected. זה עשוי להיות מועיל במיוחד אם הלהיטים הראשוניים-הוקרנו דלפק בניתוח תגובת מינון. למנה אחת, הניסיון שלנו מצביע על מתאם חזק של פעילות לוציפראז המופחתת לירידה בכדאיויות תא ^6. לכן, ירידה בפעילות בלוציפראז בתאי מטרה, כמו גם תאי שליטה יכולה להיחשב כמדד לרעילות מתחם בריכוז נבדק.

תוצאות

שימוש בגישה המתוארת, אנו הוקרנו ספריית 2,000 מתחם למאפנני פוטנציאל של מנגנוני בקרה שלאחר תעתיק מופעלים באמצעות 'UTR 3 של גן MYCN. איור 3 מתארים את התוצאות של בדיקות הסקר הראשוניים שהודגמה על ידי צלחת ספרייה אחת. אות בלוציפראז מוצגת כאחוז מפקדי רכב שטופל היית?...

Discussion

This protocol describes a cell-based reporter-gene assay aiming at the identification of modulators that target 3’ UTR-dependent post-transcriptional processes. It encompasses the primary screening and the counter-screen and, if needed, can be accompanied by a cytotoxicity assay. The outcome of the primary screening is a number of valuable candidate compounds, whose reproducibility and specificity is further validated in the counter-screening.

The identification of primary hits is based ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Culture plate 96-well White	PerkinElmer	6005688
StorPlate 96-well U bottom (dilution plate)	PerkinElmer	6008190
100 ml disposable trough for reagents	Tecan	10 613 048
300 ml disposable robotic reservoir	VWR	PB12001301
Robot tips DITI 50 μl Sterile	Tecan	30038607
Robot tips DITI 200 μl Sterile	Tecan	30038617
Matrix 1.4 ml 2D Barcoded w, Flat Bottom Tubes	Thermo Scientific	3711
ONE-Glo Luciferase Assay System	Promega	E6120
RPMI	Lonza	BE12-918F
PBS-1x, w/o Ca2+, Mg2+	Lonza	BE17-516F
L-Glutamine 200 mM	Lonza	BE17-605E
FBS	Lonza	DE14-801F
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
The Spectrum collection (compound library)	MicroSource Discovery Systems	N/A
Tecan Freedom EVO200 robot	Tecan	N/A
Tecan F200 multiplate reader	Tecan	N/A