ניתוח של Autophagy ב<em&gt; Chrysogenum Penicillium</em&gt; על ידי שימוש ברפידות רעב בשילוב עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Summary

A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

Abstract

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells possess several lines of defense against damage to biologically relevant molecules like nucleic acids, lipids and proteins. In addition to organelle dynamics (fusion/fission/motility/inheritance) and tightly controlled protease activity, the degradation of surplus, damaged or compromised organelles by autophagy (cellular ‘self-eating’) has received much attention from the scientific community. The regulation of autophagy is quite complex and depends on genetic and environmental factors, many of which have so far not been elucidated. Here a novel method is presented that allows the convenient study of autophagy in the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. It is based on growth of the fungus on so-called ‘starvation pads’ for stimulation of autophagy in a reproducible manner. Samples are directly assayed by microscopy and evaluated for autophagy induction / progress. The protocol presented here is not limited for use with P. chrysogenum and can be easily adapted for use in other filamentous fungi.

Introduction

פטריות פילמנטיות הן מערכות מודל מצוינות לחקר תהליכים התפתחותיים. הם מציעים מספר יתרונות ניסיוניים כמו טיפוח זול, מספרים גבוהים של צאצאים ונגישות גנטית. הנקודה האחרונה היא רלוונטית במיוחד לבניית transformants המאפשרים לחקור את החשיבות של גנים, עד כה, uncharacterized למנגנונים תאיים שונים. פטריות פילמנטיות כבר סייעו להבהרה של מספר גורמים ומנגנונים של מסלולי בקרת איכות סלולריות כמו פעילות פרוטאז לפירוק של חלבונים חריגים, דינמיקה של המיטוכונדריה לשמירה על השלמות וautophagy המיטוכונדריה להסרת עודפים ו / או רכיבי תא מתפקדים ולשמירה כדאיות תא בזמנים של ^1,2,3 רעב.

ישנן מספר שיטות ניסיוניות זמינות ללימוד autophagy בפילמנטיות פטריות ^2: חקירה (i) של vacuoles if הם מכילים גופי autophagic צפופים כאשר פרוטאזות מעוכבת על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים הילוכים ^4, (ii) להדמיה של autophagosomes על ידי ניטור מוקדי GFP-Atg8 באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ^5,6 וכן (iii) זיהוי של מבני autophagosomal acidified באמצעות קדברין monodansyl צבע פלואורסצנטי ^7.

כאן, שיטה חדשה של גובר chrysogenum Penicillium ללימודי autophagy מוצגת. האלמנט העיקרי הוא 'פנקס הרעב', שפשוט מורכב של 1% מומסים agarose במים ברז מעוקר. תרכובות נוספות (למשל, לחצים, אוכלי נבלות, מאפנני autophagy) ניתן להוסיף לפנקס כל עוד הם לא להציג אוטומטי הקרינה. הכרית ממוקמת בשקופיות מיקרוסקופ המכילות חלל מרכזי רדוד. פנקס זה במחוסן או עם השעיה נבג או עם שברי תפטיר קטנים. האחרון הוא מומלץ אם המתח של עניין אינו sporulatדואר יעילות (למשל, זני atg1 Δ ^8). השקופיות ממוקמות בתאים רטובים (ניתן לבנות האלה בקלות על ידי שימוש בתיבות קצה פיפטה ריקות) כדי למנוע התייבשות של המדגם וטופחו בטמפרטורת חדר. P. chrysogenum הוא מסוגל לגדול לכמה ימים בתנאים אלה. Autophagy ניתן לצפות מיקרוסקופי על ידי הגדלת vacuolar אשר מהווה סמן חיובי לפטריית autophagy. בתרומה זו, P. זן chrysogenum (Wisconsin 54-1255) משמש המהווה חלבון פלואורסצנטי ירוק כי הוא ממוקד לperoxisomes על ידי הרצף 'SKL' C-המסוף שלה ^9. לכן ניתן לעקוב אחר השפלה של peroxisomes. זה אפשרי לתייג גם תאים אחרים של התא (לדוגמא, מיטוכונדריה) באמצעות אותות לוקליזציה מתאימים ולנתח שפלתם. למרות נתונים מפ chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL) מוצג כאן, זה בהחלט אפשרילהשתמש בשיטת 'פנקס רעב "גם לפטריות פילמנטיות אחרות (למשל, crassa Neurospora, macrospora Sordaria, מיני Aspergillus, וכו').

Protocol

1. הכנת P. chrysogenum לניסויי הרעב

1. אם P. זן chrysogenum עניין נשמר על אורז ("אורז ירוק"), מקום 2-3 גרגרי אורז מכוסים המתנבג תפטיר לתוך צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge. מלא אותו בYGG 500 μl (10 גר '/ ליטר KCl, 20 גר' / גלוקוז l, 10 גר '/ בסיס חנקן שמרי l, 5 גר' / ליטר K ₂ HPO תמצית שמרי _4, 20 גר '/ ליטר).
   1. מערבולת הצינור למשך 30 שניות כדי שנבגים יכולים להתנתק מהאורז ביעילות.
   2. דגירה הצינור ליום 1 בטמפרטורת חדר (למשל, בין 20 ל 25 מעלות צלזיוס).
   3. הכן דילול 1/50 של השעיה נבג זה במים ברז סטרילי, ומערבב היטב.
2. אם P. זן chrysogenum עניין נשמר על צלחת אגר (למשל, צלחת אגר YGG), להעביר חתיכות קטנות של התפטיר לתוך צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge המכיל 400 μl מים ברז סטרילי וכ GL 100 מ"גחרוזים התחת באמצעות איסוף שן סטרילי או פיפטה קצה.
   1. מערבולת הצינור למשך 2 דקות, כך שהתפטיר הופך מקוטעת. השתמש בתוכן של הצינור באופן מיידי.

2. שלבי הכנה לטיפוח P. chrysogenum על רפידות רעב

1. לעבור על צלחת חימום ולהגדיר אותו כ 60 ° C.
2. לפזר 2 גרם של agarose ב100 מ"ל מי ברז על ידי בישול הפתרון במיקרוגל. תשמור על עצמך כי פתרון זה הוא ברור לחלוטין לאחר חימום. אם זה לא, לבשל אותו שוב עד agarose הוא נמס לגמרי. תן פתרון agarose להתקרר כ 60 ° C לפני השימוש.
3. מלא 1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge (2-4, תלוי במספר דגימות) במים ברז 400 μl סטרילי כל אחת (לא תרכובות נוספות הוסיפו) או 400 x μl (תוספת של x μl של פתרון מתחם בשלב 2.5) ולמקם אותם לצלחת חימום דקות לפחות 1, כך שהוואטאה בתוך מתחמם.
4. הנח שקופיות מיקרוסקופ המכילות חלל מרכזי לצלחת חימום דקות לפחות 1.
5. להוסיף 400 μl 2% agarose לפתרון בצינורות 1.5 מיליליטר microcentrifuge ובקצרה מערבולת. לאחר שלב זה אם תרצה בכך, להוסיף תרכובות נוספות (כלומר, rapamycin 1 מיקרומטר). אם זה נעשה, מערבולת בקצרה לאחר כל חומר נוסף הוא pipetted לצינור. שים את הצינורות בחזרה על שולחן החימום כדי למנוע התמצקות מוקדמת.
   הערה: הנפח הכולל של צינור microcentrifuge צריך להיות 800 μl.

3. הכנת שקופיות מיקרוסקופ המכילה רפידות רעב

1. 140 μl פיפטה של ​​פתרון agarose לתוך החלל של שקופיות מיקרוסקופ (שעדיין נמצא על צלחת החימום). נסה להימנע מבועות במידת האפשר.
2. מייד במקום להחליק כיסוי על פתרון agarose.
   הערה: זה יגרום משטח שטוח.
3. שים מיקרושקופית היקף על ספסל המעבדה לכ -4 דקות, כדי לאפשר את כרית agarose כדי לחזק.
4. מוציאים בזהירות את coverslip מפנקס agarose ידי הזזה אותו בעזרת אצבע אגודל או מדד (ללבוש כפפות, כדי למנוע זיהום!).
5. מניחים את שקופית מיקרוסקופ עם הכרית לחדר רטוב כדי למנוע התייבשות. המלצה: השתמש בתיבת קצה ריקה שעדיין יש להכניס להחזקת הטיפים פיפטה. מוסיף מים סטריליים לתיבה, כך שהחלק התחתון מכוסה. מניחים את שקופיות מיקרוסקופ על ההוספה ולסגור את התיבה.

4. ייחס רפידות הרעב עם פ chrysogenum ודגירה

1. 5 μl פיפטה של ​​דילול 1/50 הנבג (אם התרבויות גדלו על אורז) או 5 μl של הפתרון חי מכיל שברי תפטיר (אם התרבויות גדלו על צלחת אגר) על מרכז כרית הרעב.
2. סגור את התא הרטוב ולעטוף אותו בשקית ניילון (זה משמש כהגנה נוספת מפני התייבשות של רפידות הרעב). היזהר שלא להזיז את הקופסה יותר מדי כי אחר טיפות החיסון יהיו מוטרדות.
3. אחסן את התיבה העטופה בRT לפחות 20 שעות לפני ניתוח הדגימות.

5. ניתוח מיקרוסקופי של הדגימות

1. לאחר 20 שעות של דגירה הדגימות מוכנות לניתוח מיקרוסקופי; לשים שקופית מיקרוסקופ על נייר טישו יבש (התחתון נוטה להיות רטוב).
2. פיפטה נפח קטן של מים (בערך 50 μl) על כרית הרעב. שים coverslip על הכרית ולסחוט את מים עודפים. הסר את עודפי מים עם נייר טישו.
3. שים את שקופיות מיקרוסקופ על שולחן ההתבוננות במיקרוסקופ פלואורסצנטי. כדי לקבל סקירה כללית של צמיחת תפטיר, להשתמש אובייקטיבי 20X. מטרות השימוש 63X או 100X ללימוד הלוקליזציה של ה- GFP בעובש. על מנת למנוע התייבשות הדרגתית של המדגם לא לנתח דגימות ליותר מ -15 דקות לפני שמכניס אותם בחזרה לתוך החדר הרטוב.
4. חזור על 5.3 במרווחי זמן קבועים (לדוגמא, לאחר 40 שעות ו -60 שעות של צמיחה).
   הערה: המדגם ניתן להחזיר לתא הרטוב. אין צורך להסיר את coverslip כפי שהוא אינו משפיע על צמיחת תפטיר.

תוצאות

כדי להדגים את התועלת של הפרוטוקול המפורט לעיל השפלה peroxisome בפ זן chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL) נותח. בזן זה GFP-SKL בדרך כלל מיובא לperoxisomes ^9. התוצאה היא ההופעה של צורות כדוריות מרובות כאשר המדגם מנותח באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אם autophagy מתרחש, vacuoles להגדיל. GFP-SKL הופך ?...

Discussion

השיטה המוצגת כאן מאפשרת מחקר והנוח לשחזור של autophagy בפ chrysogenum. לדוגמא, ניתן להשתמש בו לסינון היעילות של תרכובות שונות אם הם מסוגלים ויסות תגובת autophagy של פטרייה זו או לא. התוצאות עם rapamycin להוכיח כי עיכוב של איתות TOR מוביל לאינדוקציה בולטת של autophagy בפ chrysogenum שגם הו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope slides with central cavity	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	H884.1	These can be used multiple times after cleaning.
Glass beads	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	A553.1	Diameter: 0.25 - 0.50 mm