לטווח ארוך Intravital multiphoton מיקרוסקופית הדמיה של תאים חיסוני בבריאים וחולה כבד באמצעות עכברים CXCR6.Gfp Reporter

Summary

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

Abstract

דלקת כבד כתגובה לפציעה היא תהליך דינמי מאוד מעורב החדירה של סוגים נבדלים של לויקוציטים כוללים מונוציטים, נויטרופילים, תת תא T, תאי B, רוצח טבעי (NK) ותאי NKT. מיקרוסקופיה Intravital של הכבד לניטור נדידת תאים חיסוני היא מאתגרת במיוחד בשל הדרישות גבוהות לגבי הכנת מדגם וקיבעון, רזולוציה אופטית והישרדות של בעלי חיים לטווח ארוך. עם זאת, הדינמיקה של תהליכים דלקתיים כמו גם מחקרי אינטראקציה סלולריים יכולה לספק מידע קריטי להבין ייזום, ההתקדמות ונסיגה של מחלת כבד דלקתית טוב יותר. לכן, שיטה רגישה והאמינה ביותר הוקמה כדי ללמוד הגירה ותא-תא-אינטראקציות של תאי חיסון שונים בכבד עכבר על פני תקופות ארוכות (כ -6 שעות) על ידי מיקרוסקופ שני הפוטונים intravital סריקת לייזר (TPLSM) בשילוב עם טיפול נמרץ ניטור. אף אוזן גרון "> השיטה סיפקה כוללת הכנה עדינה וקיבוע יציב של הכבד עם ההפרעות מינימליות של האיבר; הדמיה intravital ארוכת טווח באמצעות מיקרוסקופ multiphoton ססגוניות עם כמעט ללא photobleaching או תופעות phototoxic על פני תקופה של עד 6 שעות זמן, המאפשרת מעקב של תת ספציפיים לויקוציטים; ותנאי הדמיה יציבים בשל ניטור המקיף של פרמטרים חיוניים עכבר וייצוב של זרימה, טמפרטורה וחילוף גזים.

לחקור הגירת הלימפוציטים על דלקת כבד CXCR6.gfp לדפוק בעכברים היו נתונים להדמית כבד intravital בתנאי מחקר ולאחר פגיעה בכבד אקוטית וכרונית הנגרמת על ידי הזרקת intraperitoneal (ים) של פחמן טטרא ₍₄ CCL).

CXCR6 הוא קולט chemokine הביע בלימפוציטים, בעיקר על הטבעי Killer T (NKT) -, רוצח טבעי (NK) - associ רירית ותת קבוצות של לימפוציטים מסוג T כגון תאי CD4 T, אלא גםשמורת ated תאים (MAIT) T ^1. בעקבות הדפוס נודד ומיצוב של CXCR6.gfp ⁺ תאי חיסון אפשר תובנה מפורטת להתנהגותם המשתנית שלהם על פגיעה בכבד, ולכן מעורבות הפוטנציאל שלהם בהתקדמות מחלה.

Introduction

ההדמיה של תאים ותפקודים תאיים בכל איברים או אפילו כל יצורים הייתה עניין רב במשך יותר מ -50 שנים, הכוללת כמעט את כל חלקי הגוף ^2. לכן, חלק מהמחקרים המוקדמים כבר בהדמית intravital של הכבד ^3,4. עם זאת, יש מספר מגבלות קיימות מעודכנים לגבי הדמיה ברזולוציה גבוהה יציבה לטווח הארוך של רקמת כבד.

בשל המיקום האנטומי של הכבד בקשר הדוק עם הסרעפת ומערכת עיכול ^5, הבעיה הנפוצה ביותר להדמיה מיקרוסקופית intravital היא תנועה בשל נשימה ו, ובמידה פחותה, נפיחה של המעי ^6. בהשוואה לאיברים מוצקים אחרים, ניתוח בכבד הוא מאתגר במיוחד. בשל מבנה כלי הדם הצפוף, מניפולציה כירורגית יכולה להוביל לנגעים מדממים מסיביים, זרימת דם לקוי ⁷ וגם הפעלה של תושב iתאי mmune כגון תאי Kupffer ^8. לכן, קיבעון מכאני של הרקמה כפי שפורסם במקום אחר ^6,9 עלול להפריע להדמיה מיקרוסקופית intravital.

בכבד בריא, 10-15% מכלל נפח הדם שוכנים בתוך כלי הדם בכבד, והאיבר מקבל כ -25% מתפוקת הלב הכוללת ^{של 10,} טיוח האיבר רגיש מאוד לשינויים במחזור הדם (למשל, תנודות בלחץ הדם ). לכן, שיבושים בזרימת דם בכבד עקב למשל, מאמץ גזירה, עקירה, פגיעה על ידי טיפול ברקמה מוגזם או מחזור מרכזי יובילו לשינויים מלאכותיים בהתנהגות נדידה לויקוציטים, חמצון כבד פגום ונזק כבד ולכן עוד יותר, המשפיעים על תגובה חיסונית בכבד, כמו גם כשימור איברים וזמן חיים כולל של בעלי החיים.

מחקרים מיקרוסקופיים מוקדמים התבססו על מיל epifluorescence intravitalcroscopy, אבל כמה אילוצים טכניים כגון הלבנת תמונה ועומק חדירה נמוכה להגביל את השימוש בטכניקה זו להדמיה כבד לטווח ארוך ^4,11,12. עם התפתחותה של מיקרוסקופיה multiphoton בשנת 1990, את המגבלות של הלבנת תמונה או עומק חדירה נפתרו בעיקר, כשיטת חדשה זו הייתה מבחינה טכנית מסוגלת לבצע בדיקות הדמיה כמעט בכל האיברים תחת מצבים בחיים אמיתיים ^13-15. עם זאת, האתגרים העיקריים שנותרו פתוחים בנוגע להדמית כבד היו: תנועות נשימה, autofluorescence של רקמת כבד, הבטחת זרימת דם ללא שינוי בsinusoids הכבד, והדמיה יציבה במיוחד לתקופות ארוכות יותר של מספר שעות ^16.

למרות שמספר מחקרים התייחסו לפונקציה וההגירה של לויקוציטים השונים בכבד ^17, למשל, NKT-תאים ^18-20, תאי T ^21,22, מקרופאגים כבד ^23,24 או נויטרופילים ^25, מ 'multiphoton לטווח ארוךההדמיה icroscopy עדיין לא נוצרה בהצלחה, משימה מאתגרת יותר אפילו בבעלי חיים עם מחלת כבד אקוטית או כרונית עקב הנזק הקיים ורגישות גבוהה יותר ולכן לפגיעה נוספת ^26. עם זאת, ניטור התנהגות נדידה ותפקוד תאי של לויקוציטים בכבד בזמן אמת מאפשר תובנות רומן בתפקיד המסוים שלהם בהומאוסטזיס כבד ומחלות ^27.

CXCR6 קולט chemokine באה לידי ביטוי בכמה תת-רכיבי הלימפוציטים, כוללים רוצח טבעי (NK) תאים, תאי NKT וכמה אוכלוסיות תאי T ^18,28. מחקרים קודמים בעכברים הראו כי CXCR6 וCXCL16 יגנד המקור שלה יכולים לשלוט הסיורים של תאי NKT על sinusoids הכבד במהלך הומאוסטזיס. כתוצאה מכך, השימוש בעכברי CXCR6.gfp (ביצוע נוק-בחלבון פלואורסצנטי ירוק [GFP] של במוקד CXCR6) תוארו לחקור את ההגירה של לימפוציטים באיברים שונים כגון מוח ²⁹וגם כבד ^18,20, מראה עליית חדירה של תאי CXCR6.gfp על דלקת.

בשיטה שנקבעה במחקר זה ניתן היה לעקוב אחר תהליכים אלה על פני תקופה ארוכה של זמן בתנאים התייצבו. הליך multiphoton intravital מבוסס אפשר הדמיה שהייתה מאוד לשחזור עם ההפרעות מינימליות של בעלי החיים והאיברים; מותאם להישרדות של בעלי חיים לטווח ארוך על ידי ניטור נרחב אחריו שליטה הדוקה של נשימה ומחזור דם; וגמישים וקלים מאוד לאמץ גם לאיברי parenchymal אחרים כגון כליות או טחול.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הערה: הניסויים בוצעו בהתאם לחקיקה המסדירה הגרמנית מחקרים בבעלי החיים הבאים "המדריך לטיפול ושימוש בחי מעבדה" (NIH פרסום, מהדורת 8, 2011) וההוראה 2010/63 / האיחוד האירופי על ההגנה על בעלי החיים משמש למטרות מדעיות (כתב עת הרשמית של האיחוד האירופי, 2010). אישור רשמי ניתנה ממשרד הטיפול בבעלי החיים ושימוש הממשלתי (LANUV Nordrhein-Westfalen, רקלינגהאוזן, גרמניה).

הערה: צעדים שניתן להשמיט הדמיה לטווח קצר (למשל יריות הצמד, ערימות 3-D או גם מיקרוסקופיה זמן לשגות זמן קצר) מסומנות בכוכבית (*) כדי לקצר את זמן הכנה ולפשט את הפרוטוקול כירורגית. הדמיה יכולה גם להתבצע ללא בקרת ניטור ומחזור נרחבת במידת צורך, עם זאת, זמן הישרדות יופחת במידה ניכרת.

1. הגדרת מיקרוסקופ וטרום ניתוח הכנה (5-10 ק"מn)

1. מערכת מתג (מיקרוסקופ, מעבדה כוח, לייזר, כרית חימום, תא האקלים, מצלמת אינטרנט, מכשיר משאבת מזרק, הנשמה).
2. חבר O ₂ אספקה ​​לIsoflurane החמקן ורמת Isoflurane מוגדרת 1.5% כרך (V / V), להתחבר למכונת הנשמה חיה קטנה.
   1. הדמיה לטווח קצרה, לשמור על ההרדמה באמצעות isoflurane רק לאחר האינדוקציה ההרדמה ip הראשונית (ראה שלב 2.2). לאחר מכן, השתמש 2% כרך (V / V) Isoflurane, ולשמור על זמן ההדמיה מתחת ל -2 שעות כדי להבטיח זרימת דם בכבד יציבה.
3. הגדר נשימה ל120-140 מחזורי נשימה / min בהיקף של 150-200 μl.
4. הגדר את שלב agarose העכבר. הכן של 3% (w / v) agarose 100 מיליליטר, לשפוך אותו לתוך צלחת (כ 10 סנטימטרים x 15 סנטימטרים בסיס) בזווית של 40 מעלות.
5. הגדר את אזור ניתוח עבודת איסוף המכשור הנדרש. כדי למנוע זיהום חיידקים, חיטוי מכשירים באמצעות פתרון 1% מSekusept Forte S (9.9% w / v), Glutaral 9.8% w / v, פורמלדהיד ל5 דקות לפני הניסוי (איור 1 א).
6. להשיג רכיבים שנותרו: חיטוי עור (לדוגמא, תמיסת יוד povidone 10%), שלב כבד (ערימות וגשר), פתרון agarose (3% (w / v) בPBS), משאבת מזרק עם 5% (w v /) פתרון גלוקוז (G-5), משאבת מזרק עם חומר הרדמה ש( מ"ג קטמין 0.1 / מיליליטר, מ"ג Xylazine 0.5 / מיליליטר, 5 מיקרוגרם / מיליליטר פנטניל), צמר גפן, n-בוטיל-2-Cyanoacrylat, ו1x PBS. שים צלחת שלב agarose לתוך תא דגירה לחימום מוקדם.

2. קנה (10-15 דקות)

1. השתמש C57BL / 6 עכברים ברביית בית במשקל 25-28 גרם. בית העכברים בתנאי הפתוגן ללא ספציפיים בהתאם להנחיות FELASA, לטמפרטורת סביבה ולחות מבוקרת עם hr אור 12 / מחזור כהה 12 שעות. לאפשר גישה חופשית לבעלי חיים תזונה סטנדרטית עכברים (דיאט מכרסם רגיל לרחרח) וכרצונך מים.
2. להרדים את העכבר על ידי initintraperitoneal ial הזרקה (IP) של 250 μl של ההרדמה II (קטמין 0.1 מ"ג / מיליליטר, מ"ג Xylazine 1 / מיליליטר, עצירות 10 מיקרוגרם / מיליליטר).
   1. * לתחזוקה במהלך ההדמיה intravital, ברציפות לנהל הרדמה אני בזריקת ip רציפה (מ"ג קטמין 0.1 / מיליליטר, מ"ג Xylazine 0.5 / מיליליטר, פנטניל 5 מיקרוגרם / מיליליטר) באמצעות מכשיר משאבת מזרק עם קצב זרימה של 0.2 מיליליטר / שעה ב שילוב עם% כרך inhalative isoflurane 0.5 (V / V).
   2. בדוק את הרפלקסים לאחר 5 דקות (לדוגמא כרית כף רגל קמצוץ עם מלקחיים), לחטא את העור לtracheotomy, להתחיל הכנה אם עכבר נמצא במצב הרדמה כירורגית סובלני.
   3. החל קרם עיני מגן (לדוגמא, Dexpanthenol 50 מ"ג / g) כדי למנוע קרנית מפני התייבשות (איור 1).
3. לקבע עכבר על שולחן הכנה חושף צד הגחוני באמצעות נייר דבק לגפיים; בעדינות להתמתח יתר על מידת צוואר, לקבע בתנוחה זו, למשל., על ידי שימוש בגומיית מכור to החותכות.
   1. לחטא את עור ופרווה באמצעות תמיסת יוד povidone, על ידי יישום חומר חיטוי עם מקלון צמר גפן.
4. לבצע חתך בעור ראשוני (סנטימטר אורך 0.5-1) ישירות מתחת לסנטר (איור 1 ג)
   1. בזהירות לנתח רקמות חיבור בין בלוטות רוק (1D איור).
   2. לקרוע זהירות קנה הנשימה צינור המקיף את שרירים פתוחים (איור 1E, F).
5. מניחים חוט כירורגי מתחת לקנה הנשימה לקיבוע צינור האוורור מאוחר יותר (איור 1G).
   1. קנה נשימה פתוחה עם מיקרו מספריים בין טבעות סחוס ביצוע חתך בצורת T (איור 1H)
6. מניחים צינור אוורור לקנה נשימה דרך החתך (~ 0.5 סנטימטרים). לדחוף את הצינור קדימה, לתפוס סוף הזנב עם מלקחיים אנטומיים קטנים ובעדינות לקדם את הצינור לתוך קנה הנשימה (איור 1 ט)
7. לקבע צינור עם חוט כירורגית (לדוגמא , 5-0) עם חוט יוצב בשלב 2.5 קשירת קשר סביב צינור בתוך קנה הנשימה; לבצע קיבוע גולגולת שני של הצינור בעור, כדי למנוע depositioning המקרי (איור 1J, K).
8. לחתוך חותם עם דבק רקמות (למשל, n-בוטיל-2-Cyanoacrylat) (איור 1 ליטר).
9. לקבע צינור בראש באמצעות סרט דבק.

3. Laparatomy (15-20 דקות)

1. הנח את העכבר על כרית חימום כדי למנוע היפותרמיה. לגלח את הבטן, להסיר בזהירות את שיער מהעור. לחטא את עור ופרווה מגולחים באמצעות תמיסת יוד povidone.
2. בצע עור קטן לחתוך מתחת לעצם החזה באמצעות מספריים כירורגית (איור 2 א). להאריך את הקיצוץ רוחבי מתחת לצלעות לשני הצדדים, צריבה כל כלי הדם הגלויים כדי למנוע דימום.
3. לבצע בזהירות חתך קטן בalba linea מתחת לעצם החזה, פתיחת הצפק (איור 2). להאריך את החתך לשני הצדדים באמצעות cauterization כדי למנוע דימום (איור 2 ג, ד).
4. הנח את העכבר לתוך צלחת שלב agarose (איור 2E). מניחים ערימות של גובה מתאים בשני הצדדים של העכבר (בדרך כלל 12-14 כיסוי התלושים) (איור 2F).
5. הנח חיישן הדק נשימה מתחת גב עליון לסנכרן מיקרוסקופ עם הנשימה. הפעל יחידת הדק (איור 2G).
6. מניחים חוט כירורגי (5-0) דרך עצם החזה לחזור צלעות (איור ט 2).
7. לחתוך בזהירות רצועת חיבור כבד וסרעפת (רצועת falciform), כמו גם בדרכי עיכול וכבדות באמצעות מספריים כירורגיות מעוקלים. חותך את רצועות falciform אל אב העורקים (איור י 2).

4. הגדרת דוגמא (10-15 דקות)

1. מניחים את העכבר בצד ימין עם זווית של 45 מעלות לגישה קלה לאונת כבד גדולה.
2. להוסיף גשר בימוי מתחת לצלעות, המכסה את הבטןחלל. ייצור גשר באמצעות להחליק את מכסה סטנדרטי עם ציפוי נייר דבק כדי לכסות קצוות חדים (איור 2K).
3. הנח אונת כבד גדולה על במה. להחליק בזהירות בדיקה עט כדור הכפול או מרית מרופדת מתחת לכבד והחזק את החלק העליון של האיבר באמצעות מקלון צמר גפן רטוב או רקמה רטובה. הרם אונה לשקופית ולהחיל גרירה עדינה. אונה יכולה להיות כפופה או מקופלת. לספק טיפול נוסף כדי רק מניפולציה עדינה של הכבד (איור 2L).
4. מניחים הימור צדדי תומך, למשל, ערימות של פתקים קטנים כיסוי (20 מ"מ x 20 מ"מ), בסך של כ באותו הגובה של אונת הכבד לצד זה כדי לתמוך בתלוש לכסות.
5. מניחים פתק גדול כיסוי (24 מ"מ x 50 מ"מ) באונת הכבד. ודא שכיסוי להחליק מכוון כאופקי ככל האפשר (איור 2M).
   הערה: להחליק את המכסה צריך להיות במגע עם הרקמה בלי לסחוט אותו. לבדוק סימנים נראים לעין של זרימת דם לקויה (רקמה לבנה). אם microcirculation מופר, להוסיף תמיכה בהימור נוספת.
6. * מקום שני צנתרים intraperitoneal עצמאיים (איור 2N) להרדמה לטווח ארוך ויישום G-5. התקן צנתרים רוחבי בבטן התחתונה בסמוך לגפיים האחורי.
   הערה: הצנתרים intraperitoneal יכולים להיות על ידי חיבור 27 מחטי G עם צינורות גמישים סיליקון (איור 3) מתוצרת עצמית.
7. * מחט לקבע עם לולאה של חוט 5-0 כירורגית לעור, כדי למנוע תזוזה מקרית.
8. * צרף משאבת מזרק עם פתרון הרדמה אני לקטטר 1, קצב זרימה מוגדר 0.2 מיליליטר / שעה; לצרף משאבת מזרק עם G-5 לקטטר 2, קצב זרימה מוגדר 0.1 מיליליטר / שעה.

5. ניטור עכבר

1. * אלקטרודות א.ק.ג. מקום לחזית וגפיים אחוריות (איור 4 א).
2. * צרף צינורות תפוגה ל- CO ₂ חיישן רמה.
3. להוסיף חיישן טמפרטורה חיצוני המחובר למשטח חום (איור 4C).

6. הטבעה וקיבוע רקמות (5-10 דקות)

1. הכן של 3% (w / v) agarose ב1X PBS 100 מיליליטר. להטביע כבד, כאשר הטמפרטורה היא 41 מעלות צלזיוס באמצעות מזרק 5 מיליליטר ומחט 18 G (איור 5 א).
2. יוצקים agarose שנותר על coverslip וסביב העכבר (איור 5 ב, ג). חכה עד agarose gelatinized באופן מלא.
3. הסר agarose העודף באמצעות מרית היידמן, הכנת viewfield גדולה מספיק כדי לסרוק את אונת הכבד מוכנה (איור 5D, E).

7. הדמיה

1. העבר את העכבר לתא אקלים מיקרוסקופ.
2. להוסיף 50-100 מיליליטר של 1x PBS (שחומם מראש על 37 מעלות צלזיוס).
3. כיסוי צלחת מדגם כדי למנוע אידוי (איור 5F).
4. * ירידת isoflurane inhalative 0.5 כרך% (v / v).
5. * התחל תוכנת ניטור, הקלטת א.ק.ג., קצב לב וCO ₂ הנשיפה.
6. התחל הדמיה: לפתוח להתריסי ser, לזהות שדות ראייה של עניין, להגדיר גבול עליון ותחתון לZ-ערימות, ולהתחיל בהקלטת הזמן לשגות. להתקין מחדש Z-ערימות אם יש צורך לתקן את Z-הסחיפה (למשל. כתוצאה משינויים בלחץ דם או תנודות טמפרטורה, איור (5G).
   הערה: לאחר סיום תקופת ההדמיה או אם במחזור או ההרדמה של בעלי החיים הופך לבלתי יציב, להקריב את העכברים על ידי נקע בצוואר הרחם (בלי התעוררות מההרדמה).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

כדי לאמת את גישת TPLSM intravital שלנו, אנו חשופים ^{GFP / +} עכברי CXCR6 להדמית TPLSM intravital. עכברים שלא טופלו או הושארו כפקדים בסיסיים או נתון להזרקת intraperitoneal אחת של פחמן טטרא (CCL ₄₎ כדי לגרום לנזק בכבד חריף ^20.

רצפי וידאו נלקחו על פני ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מטרת המחקר שלנו הייתה לפתח שיטה סטנדרטית מאוד, יציבה ושחזור ההדמיה TPLSM intravital של הכבד. ההדמיה Intravital בכלל נתנה תובנות רבות ערך להתנהגות סלולרית בתנאי חיים אמיתיים הבאים ביות ואינטראקציה של אוכלוסיות לויקוציטים שונות בפיתוח, הומאוסטזיס ומחלה. עם זאת, העמדה המאתגרת מעט ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetics
Buprenorphine	Essex Pharma	997.00.00	Analgeticum, 0.1 mg/kg
Fentanyl	Rotex Medica	charge: 30819
Fluovac anesthesia system	Harvard Apparatus	34-1030
Glucose 5%	Braun
ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser	Eickemeyer	4802885
Isoflurane	Forene Abbott	B 506
Isotonic (0.9%) NaCl solution	DeltaSelect GmbH	PZN 00765145
Ketamin 10%	ceva	Charge: 36217/09
Xylazin 2%	medistar	Charge: 04-03-9338/23
Consumable supplies
20 ml Syringe	BD Plastipak
250 ml Erlenmeyer flask	Schott Duran	21 226 36
25 ml Beaker 2x	Schott Duran	50-1150
2 ml syringe	BD Plastipak
4-0 Vicryl suture	Ethicon	V7980
Agarose	commercially available
Bepanthen Eye and Nose ointment	Bayer Vital GmbH	6029009.00.00
Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery Kit	Fine Science Tools Inc.	18010-00
Cotton Gauze swabs	Fuhrmann GmbH	32014
Cover Slip 24x50 mm	ROTH	1871
Durapore silk tape	3M	1538-1
Feather disposable scalpel	Feather	02.001.30.011
Fine Bore Polythene Tubing 0.58 mm ID	Smiths medical	800/100/200
Histoacryl	Braun	1050052	5x 0.5 ml
Leukoplast	BSN Medical Inc.
Microscope Slides	ROTH	1879
Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum	Antiseptica GmbH	72PAH200
Sterican needle 18 G x 1	B. Braun	304622
Sterican needle 27 3/4 G x 1	B. Braun	4657705
Tissue paper	commercially available
Surgical Instruments
Amalgam burnisher 3PL	Gatz	0110?
Blair retractors (4 pronged (blunt)) x2	Storz&Klein	S-01134
Dumont No.7 forceps	Fine Science Tools Inc.	91197-00
Graefe forceps curved x1	Fine Science Tools Inc.	11151-10
Graefe forceps straight x2	Fine Science Tools Inc.	11050-10
Heidemann spatula HD2	Stoma	2030.00
Needle holder Mathieu	Fine Science Tools Inc.	12010-14
Scissor	Fine Science Tools Inc.	14074-11
Semken forceps	Fine Science Tools Inc.	11008-13
Small surgical scissors curved	Fine Science Tools Inc.	14029-10
Small surgical scissors straight	Fine Science Tools Inc.	14028-10
Standard pattern forceps	Fine Science Tools Inc.	11000-12
Vannas spring scissors	Fine Science Tools Inc.	15000-08
Equipment
ECG Trigger Unit	Rapid Biomedical	3000003686
MICROCAPSTAR End-Tidal Carbon Dioxide Analyzer	AD Instruments
Minivent Typ 845	Harvard Apparatus	73-0043
Multiphoton microscope Trimscope I	LaVision
Perfusor Compact	B. Braun
PowerLab 8/30 8 channel recorder	AD Instruments	PL3508
Temperature controlled heating pad	Sygonix	26857617
Temperature sensor	comercially available
Temperature controlled System for Microscopes -Cube&Box	Life Imaging Services