דגם 3D Organotypic משותף תרבות תמיכה למניעת הפצת נשק מדולרי הרתי אפיתל תאים, התמיינות וביטוי גנים מופקר

Summary

Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein - a modified skin organotypic culture model - has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.

Abstract

פיתוח תא T תוך-הרתי דורש meshwork תלת-ממדי מורכב מורכב מתאי סטרומה שונים, כלומר, תאים שאינם-T. Thymocytes לעבור פיגום זה בצו של זמן ומרחב מתואם מאוד בעת שעברה ברצף נקודות בדיקת חובה, כלומר, מחויבות שושלת תא T, ואחריו דור רפרטואר קולט תא T ובחירה לפני יצואם לפריפריה. שני סוגי תאי התושב גדולים ויוצרים פיגום זה הם תאים בקליפת המוח (cTECs) והלשדיים הרתי אפיתל (mTECs). תכונה מרכזית של mTECs היא הביטוי המופקר כביכול של אנטיגנים-מוגבל רקמות רבות. אנטיגנים-מוגבל רקמות אלו מוצגים לה בוסר thymocytes במישרין או בעקיפין על ידי mTECs או תאים דנדריטים הרתי, בהתאמה וכתוצאה מכך סובלנות עצמית.

דגמים מתאימים במבחנה חיקוי המסלולים ופונקציות ההתפתחותי של cTECs וmTECs הם Lac כרגעהמלך. זה חוסר מודלים ניסיוניים נאותים יש למשל הקשו הניתוח של ביטוי גנים מופקר, שעדיין הוא הבין היטב ברמה התאית ומולקולרית. מתאמנים את מודל 3D organotypic שיתוף תרבות לתרבות לשעבר vivo mTECs המבודד. מודל זה תוכנן במקור כדי לטפח קרטינוציטים בדרך כגון כדי ליצור מקבילה עור במבחנה. מודל 3D נשמר תכונות פונקציונליות מרכזיות של ביולוגיה Mtec: התפשטות (i) ובידול מסוף של CD80 ^lo, Aire-השלילי ^להיי CD80, mTECs Aire-החיובי, (ii) היענות לRANKL, וכן (iii) ביטוי מתמשך של FoxN1, Aire וגנים-מוגבל רקמה בmTECs ^היי CD80.

Introduction

thymocytes פיתוח מהווה כ 98% מהתימוס, ואילו 2% הנותרים מורכב ממגוון רחב של תאים שביחד מרכיב את סטרומה הרתי (כלומר, תאי אפיתל, תאים דנדריטיים, מקרופאגים, תאי B, fibroblasts, תאי האנדותל). התאים החיצוניים של קליפת המוח אפיתל (cTECs) להשיג הגירה של תאים פרו-T ממח העצם, האינדוקציה שושלת תא T בתאים טרום-T multipotent וסלקציה חיובית של עצמי MHC מוגבל thymocytes בשל. התאים הפנימיים הלשדיים הרתי אפיתל (mTECs) מעורבים באינדוקצית סובלנות של thymocytes אלה עם זיקה גבוהה TCR למתחמי פפטיד העצמי / MHC או על ידי בחירה שלילית התרמה או הסטייה שלהם לשושלת תא T רגולטורים. בהקשר של אינדוקציה סובלנות מרכזית, mTECs הם ייחודיים בכך שהם מבטאים מגוון רחב של-אנטיגנים עצמי מוגבל רקמה (Tras) כך שיקוף עצמי ההיקפית. תופעה זו נקראת ביטוי גנים מופקר (PGE)^1,2.

המחקרים העדכניים ביותר בסוג התא מרתק זו מסתמכים על תאים מבודדים vivo לשעבר, כמו מערכות תרבות 2D לטווח קצר שונות הביאו תמיד בהפסד של PGE ומולקולות רגולטור מפתח כמו כיתת MHC II, FoxN1 וAire בתוך 2 הימים הראשונים ^3-6 . זה נשאר עם זאת ברור, שרכיבים ותכונות של meshwork 3D שלם של בלוטת התימוס מסוימים היו חסרות במודלי 2D. התרבות מחדש צבירת הרתי האיבר (RTOC) לא הייתה כל כך הרבה במערכת רק 3D, המאפשרת חקר התפתחות תאי T, מצד אחד, וביולוגיה של תא סטרומה, ומצד שני, במייקרו-סביבת הרתי שלם ^7. ובכל זאת, יש לי RTOCs מגבלות מסוימות, כלומר, הם כבר מכילים תערובת מורכבת של תאים, דורשים ההזנה של תאי סטרומה עובריים ולסבול תקופה תרבות מקסימלי של 5 עד 10 ימים.

חוסר רדוקציוניסט במערכות תרבות מבחנה עכב את המחקר שלכמה היבטים של organogenesis פיתוח התא והרתי T לפחות רגולציה לא המולקולרית של PGE והקשר שלה לביולוגיה התפתחותית של mTECs.

בשל הקרבה-ההתייחסות של הארגון המובנה של תאי האפיתל של עור והתימוס, בחרנו מערכת 3D תרבות organotypic (OTC) שפותח במקור כדי לחקות את הבידול של קרטינוציטים במבחנה ובכך ליצור מקבילה עורי. מערכת OTC מורכבת ממטריצת פיגום אינרטי מעולף עם fibroblasts עורי שלכודים בג'ל הפיברין, על שקרטינוציטים הם זורעים ^8,9. כאן, החלפנו קרטינוציטים עם mTECs המטוהר. תוך שמירה על התכונות הבסיסיות של מודל זה, אנו מותאמים פרמטרים מסוימים.

במודל OTC אימץ mTECs התרבו, עבר התמיינות מסוף ומתוחזק זהות Mtec וPGE, מחקה וכך באופן הדוק בפיתוח mTECs vivo ^{10. הערה טכנית זה מספקת פרוטוקול מפורט המאפשר הגדרת השלבים של OTCs התימוס.}

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של קרלסרוהה Regierungspräsidium. כל בעלי החיים שוכנו בתנאי הפתוגן ללא ספציפיים במרכז הגרמני לחקר הסרטן (DKFZ). לכל גורי עכבר ניסויי התרבות החל 1-7 ימים של גיל היו בשימוש.

1. בידוד של mTECs מקורנית

הערה: שלבי העיכול הבאים בוצעו כפי שתואר לעיל ¹ בתנאים סטריליים עם כמה שינויים כדלקמן.

1. לערוף את גורי העכבר ולהסיר את בלוטת התימוס. מניחים את thymi על קרח בצלחת פטרי המכילה בינוני RPMI 1640 (FCS המכיל 5%).
2. חותך את thymi לחתיכות דקות, קטנות ומקום בצינור תחתון עגול עם ~ 5-30 מיליליטר תקשורת RPMI ומערבב בעדינות באמצעות מגנט במשך 10 דקות ב RT.
3. לאחר מכן, למזוג supernatant המכיל בעיקר thymocytes ולעכל את רצף הרקמה שנותר עם סיבוב של collagena אחדIV se הסוג (0.2 מ"ג / מיליליטר ו -57 U / ml concentartion הסופי) במשך 15 דקות כל אחד על 37 מעלות צלזיוס, ואחריו collagenase / dispase (0.2 מ"ג / מיליליטר וריכוז סופי 1.2 U / ml) במשך 25 דקות כל אחד ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים עם ערבוב מגנטי עד thymi מתעכל לגמרי. השתמש אנזים 1 מיליליטר ל02:58 thymi.
4. להתסיס את הרקמה אחת לדקות 7-10 עם פיפטה פסטר. בריכת collagenase / השברים dispase ולסנן דרך גזה 70 מיקרומטר.
5. להעשיר את mTECs ידי תא מגנטי מיון (MACS). לבצע הטיהור של mTECs ידי תא מגנטי מיון כפי שתואר לעיל ^11, ומוצג באיור 1.
   הערה: למיון מגנטי של mTECs השתמשנו בנוגדנים הבאים: אנטי CD80-PE (16-10A1, שימוש ב1: 100 דילול) ואנטי-EpCAM-יו (G8.8, שימוש ב1: 100 דילול) ^12. mTECs בוגר והבשל באמצעות MACS הוגדר כ: CD45 ^- EpCAM ⁺ CD80 ^- CD45 ^ו-- CD80 ⁺ respectivאיליי.
6. לאחר טיהור MACS (טוהר mTECs בוגר = 83.1 ± 6.3% וmTECs הבוגר = 79.23 ± 3.42%), זרע mTECs על תרבויות organotypic כמתואר להלן (סעיף 2.3).
7. לחלופין, סוג mTECs ידי FACS (באמצעות 100 זרבובית מיקרומטר) לאחר דלדול CD45 MACS באמצעות הנוגדנים הבאים: אנטי CD45-PerCP (30-F11, שימוש ב1: 100 דילול), אנטי-Ly51-FITC (6C3, להשתמש ב1 : 100 דילול), אנטי-EpCAM-Alexa647 (G8.8, שימוש ב1: 500 דילול) ושימוש אנטי CD80-PE (16-10A1, בשעה 1: 100 דילול). תכלול תאים מתים באמצעות יודיד propidium (1: 5,000) (יום 4). mTECs בוגר והבשל באמצעות FACS הוגדר כ: PI ^- CD45 ^- Ly51 ^- EpCAM ⁺ CD80 ^- וPI ^- CD45 ^- Ly51 ^- EpCAM ⁺ CD80 ^+, בהתאמה.

2. 3D Organotypic שיתוף תרבויות (OTCs)

הערה: בונה 3D-עורי לטיפוח organotypic של keratinocytes הוכן כפי שתואר לעיל ^9,13. בכל צעדי תאים הודגרו על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2. OTCs באמצעות mTECs הוכן עם שינויים קלים באופן הבא.

1. הכנת fibroblasts האדם
   הערה: fibroblasts עורי האנושי התקבל מתרבויות explant של הדרמיס-epidermised דה כפי שתואר לעיל ^9.
   1. בקיצור, לחתוך רצועות של עור אנושי (~ 5 סנטימטר אורך) ולטפל בthermolysin (0.5 מ"ג / מיליליטר מלוחים עם 10 7.4 מ"מ Hepes pH) O / N ב 4 ° C.
   2. לאחר מכן, להפריד את העור מהעור באמצעות מלקחיים.
   3. דק לחתוך את העור לחתיכות קטנות, מקום בצלחת פטרי 10 סנטימטרים ולאפשר לו להתייבש במשך 1-2 שעות בזרימת אוויר סטרילי. להשלים את explants באופן קבוע עם DMEM המכיל 20% FBS.
   4. לפצל fibroblasts צמיחה החוצה כאשר מחוברות (בדרך כלל סביב 3 שבועות) באמצעות טריפסין 0.1% ולוודא כי explants ימשיך לדבוק הצלחת לקון נוסףסיבובי secutive של תולדה.
   5. הרחב את fibroblasts מאותו explants עד 3 פעמים בDMEM עם 10% FBS וcryo-לשמר אותם ^14. השתמש באותה הקבוצה של פיברובלסטים לכל סדרת ניסויים.
      הערה: fibroblasts לא היו מוקרן להגדרה של שווה עורי.
2. הכנת הפיגום
   1. חותך את 0.4-0.6 מ"מ ויסקוזה העבה, חומר סיבי לא ארוג (פרטי מוצר בתמיכת גיליון Excel) לעיגולים מסומנים היטב באמצעות אגרופן מתכת בקוטר 11 מ"מ חד שיתאים בדיוק ל -12 מוסיף גם מסנן. אז למקם אותו לתוך 12 הוספת מסנן היטב (הקרום הנקבובית נימי פוליאסטר, גודל 3 מיקרומטר נקבובית) כפיגום. מניחים את התקנת מסנן המלאה לתוך צלחת 12 גם סטרילי.
   2. הכן את הג'ל הפיברין באמצעות דבק הפיברין-ערכה לניתוח המורכב משילוב של פיברינוגן ותרומבין. טרום לדלל fibrinogen- כמו גם תרומבין-הרכיב של הערכה 8 מ"ג / מיליליטר ו -10יחידות / מיליליטר, בהתאמה. וליחיד של צלחת 12 גם פעל באופן הבא.
      1. לדלל 100 פיברינוגן μl (8 מ"ג / מיליליטר) עם 100 שנאגרו מלוח פוספט μl (PBS) ללא Ca ₂ ⁺ Mg ₂ ⁺ ו, pH 7.0. לדלל 100 תרומבין μl (10 יחידות / מיליליטר) עם FCS 100 μl מכיל 270,000 fibroblasts.
      2. לוותר 200 μl של תרומבין המכיל fibroblasts תא-לערבב על הפיגום, ולכך יש להוסיף פיברינוגן μl 200 (1: 1 תערובת), וכתוצאה מכך ריכוז סופי של פיברינוגן של 2 מ"ג / מ"ל ​​ושל תרומבין של 2.5 יחידות / מיליליטר. מערבבים היטב ולהפיץ באופן שווה על פני כל השטח של הפיגום על ידי pipetting העדין (יום 1).
         הערה: לאחר 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס קריש מצרף fibroblasts יהיה יצר, מילוי לחלוטין החללים הפנימיים של הפיגום ויצר משטח עליון חלק.
3. תרבות משותפת עם mTECs
   1. לטרום-תרבות, submerse תרבויות האיבר בDMEM עם 10% FBS, חומצת 50 מיקרוגרם / מיליליטר L-אסקורבית וng 1 / מיליליטר TGF-β1 עם שינוי בינוני בכל יום אחר במשך 4-5 ימים.
   2. ביום זריעת Mtec, להחליף את המדיום על ידי מדיום rFAD (1: 1 DMEM + DMEM / F12) עם 10% FBS, 10 ^-10 רעלן הכולרה, 0.4 מ"ג / מיליליטר הידרוקורטיזון, חומצה אסקורבית L-M 50 מיקרוגרם / מיליליטר, יגנד RANK (0.1 מיקרוגרם / מיליליטר) ו -500 יחידות / מיליליטר של Aprotinin, ובכך מונע פירוק פיברין מוקדמים על ידי פרוטאזות סרין מופרש על ידי fibroblasts.
   3. 7-8 שעות מאוחר יותר, הגדרת שיתוף התרבויות על ידי זריעת 250,000 mTECs (או mTECs מלא, או CD80 ^הפלא ותת ^היי CD80), בהיקף של 100 לכל גם μl על גבי פיגום פיברובלסטים. ספירת התאים באמצעות תא נויבאואר (יום 4).
      הערה: בכל עת תרבויות organotypic 3D התימוס הם טבלו בתקשורת בניגוד OTCs עור אשר-הרים אוויר.
   4. אחרי 24 שעות דגירה, לספק את התרבויות עם מדיום (תמורה כוללת בינונית) כאמור לעיל (שלב 2.3.2) עכשיו containing כמות מופחת של Aprotinin, 250 יחידות / מיליליטר (יום 5).
   5. על מנת להעריך את פעילות השגשוג של mTECs, להוסיף edu (6.7 מיקרומטר / מיליליטר, כלומר, 10 מיקרומטר / טוב) לOTCs במשך 4 שעות לפני סיום התרבויות. לבצע צביעת cryo-סעיפי OTC כפי שתואר בערכת edu ההדמיה בשילוב עם שיתוף הכתמה של קרטין 14. קביעת מדדי השגשוג של mTECs, או על ידי תאי K14 ⁺ edu ⁺ לספור בשני חלקים של כל דגימת תרבות או על ידי זרימה cytometry (edu cytometry זרימה, סעיף 1.7, אבל במקום Ly51-FITC להשתמש ¹⁵ CDR1-PB בדילול 1: 100 ו2.3.6.4).
   6. בעקבות 4-7 ימים של התרבות המשותפת, לסיים את OTCs ותהליך לבידוד RNA, cryo-חתך או ניתוח FACS (יום 8-11).
      1. לסיים את התרבויות באמצעות מלקחיים, הפרדה המקבילה פיגום / עורי מהמסנן של להכניס גם.
      2. לקריו-חתך, להטביע את כל OTC במתחם OCT ולהקפיא בliאדי חנקן לירות לפני cryo-חתך. הכן 5-7 מיקרומטר חלקים עבים OTC באמצעות cryostat ולאחסן ב -20 ° C עד שימוש. לאימונו-היסטוכימיה של OTCs בחתך cryo להשתמש אנטי-קרטין 14 (AF64, שימוש ב1: 1,000 דילול), ואנטי-vimentin (GP53, שימוש ב1: 100 דילול) נוגדנים. לבצע צביעת אימונו-היסטוכימיה העקיפה באמצעות נוגדנים משני בהתאמה.
      3. לבידוד RNA, להוסיף 1 מיליליטר Denaturing פתרון (המכיל פנול וthiocyanate guanidinium) בכובע בורג של צינור חופשי 2 מיליליטר RNase. חותך את כל OTC לחתיכות עם אזמל ולהוסיף לתוך הצינור המכיל פתרון denaturing. מכאני לגרוס OTCs עם מכשיר FastPrep פעמיים למשך 30 שניות במהירות של 6.0, מקום בין על קרח למשך 2 דקות (המדגם ניתן לאחסן ב -80 ° C לאחר שלב זה). אם קפוא ב -80 ° C, להפשיר על קרח. צנטריפוגה הצינורות ב11,500-13,000 סל"ד במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. מעבירים את supernatant לצינור טרי, דגירה של 5 דקות ב RT וFפרוטוקולי בידוד RNA ollow באמצעות מיצוי thiocyanate-פנול, כלורופורם guanidinium חומצה כפי שתואר על ידי היצרן.
      4. לניתוח FACS, להסיר את הפיגום ולהפריד את הקרום מהפיברין / פיברובלסטים / ג'ל Mtec. דק לחתוך ג'ל עם אזמל ולעכל אותו בצינור FACS ל~ 20 דקות או עד שעכל לחלוטין עם 2 מיליליטר של collagenase / dispase על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים עם ערבוב מגנטי. להתסיס את פתרון האנזים עם פיפטה פסטר פעם כל 5 דקות. לאחר עיכול שלם, לסנן את ההשעיה התא דרך מסנן 70 מיקרומטר; להכתים את ההשעיה התא בודדת באמצעות הנוגדנים כפי שתואר ב1.7 ולנתח ידי cytometry זרימה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

אנחנו אימצנו מודל 3D organotypic התרבות המשותפת (3D OTC) שפותח במקור לתרבות לטווח ארוכה במבחנה של קרטינוציטים ^9. mTECs המועשר MACS (ראה איור תכנית העשרת MACS 1) היו זורעים על פיגום הכולל ג'ל הפיברין ופיברובלסטים בפח. Fibroblasts לספק המטריצה ​​חיונית תאית (ECM)...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

לצד RTOCs, OTCs 3D היה עדיף בהרבה על ידי במונחים של בידול TEC ותחזוקה / אינדוקציה PGE (טבלה 1) בהשוואה לאחרים (i) "תרבויות 3D פשוטות" באמצעות - fibroblasts לבד בלי הפיגום; (Ii) מערכות 2D באמצעות - תאי פיברובלסטים / מזין שיתוף תרבותי עם Tecs ^10, (iii) תאי 3T3-J2 בי השיבוטים TEC לפתח, א?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pregnant C57BL/6 mice	Charles River WIGA
LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
CD45 Microbeads, mouse	Miltenyi Biotec	130-052-301
Anti-PE Microbeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
Streptavidin Microbeads	Miltenyi Biotec	130-048-101
EpCAM (G8.8 -Alexa 647 and -biotin)	Ref. 12
CD80-PE antibody	BD Pharmingen	553769
CD45-PerCP antibody	BD Pharmingen	557235
Ly51-FITC antibody	BD Pharmingen	553160
CDR1-Pacific Blue	Ref. 15
Keratin 14 antibody	Covance	PRB-155P
Vimentin antibody	Progen	GP58
Cy3-conjugated AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-165-003
Alexa 488-conjugated AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	106-546-003
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Molecular Probes (Invitrogen GmbH)	A-11008
Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit	Invitrogen	C10339
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit	Invitrogen	C10425
12-well filter inserts (thincerts)	Greiner bio-one	657631
12-well plate	Greiner	665180-01
Jettex 2005/45	ORSA, Giorla Minore, Italy
Fibrinogen TISSUECOL-Kit Immuno	Baxter
Thrombin TISSUECOL-Kit Immuno	Baxter
PBS	Serva	47302.03
DMEM	Lonza	BE12-604F
DMEM/F12	Lonza	BE12-719F
HEPES	Gibco	15630-049
FBS Gold	GE Healthcare	A11-151
Aprotinin (Trasylol)	Bayer	4032037
Cholera toxin	Biomol	G117
Hydrocortisone	Seromed (Biochrom)	K3520
L-ascorbic acid	Sigma	A4034
TGF-ß1	Invitrogen	PHG9214
RANKL	R&D systems	462-TR-010
Thermolysin	Sigma Aldrich	T-7902
OCT Compound	TissueTek	4583
Trizol (aka. Denaturing solution - Acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction)	Invitrogen	10296028
FastPrep FP120	Thermo Scientific
Collagenase Type IV	CellSystems	LS004189	0.2 mg/ml and 57U/ml final conc.
Neutrale Protease (Dispase)	CellSystems	LS002104	0.2 mg/ml and 1.2U/ml final conc.
DNase I	Roche	11 284 932 001	25 µg/ml final conc.