פיתוח של כמותי recombinase פולימראז ההגברה Assay עם בקרה פנימית חיובית

Summary

Provided is a protocol for developing a real-time recombinase polymerase amplification assay to quantify initial concentration of DNA samples using either a thermal cycler or a microscope and stage heater. Also described is the development of an internal positive control. Scripts are provided for processing raw real-time fluorescence data.

Abstract

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to quantify DNA sample concentration using a standard curve. In this manuscript, a detailed protocol for developing and implementing a real-time quantitative recombinase polymerase amplification assay (qRPA assay) is provided. Using HIV-1 DNA quantification as an example, the assembly of real-time RPA reactions, the design of an internal positive control (IPC) sequence, and co-amplification of the IPC and target of interest are all described. Instructions and data processing scripts for the construction of a standard curve using data from multiple experiments are provided, which may be used to predict the concentration of unknown samples or assess the performance of the assay. Finally, an alternative method for collecting real-time fluorescence data with a microscope and a stage heater as a step towards developing a point-of-care qRPA assay is described. The protocol and scripts provided may be used for the development of a qRPA assay for any DNA target of interest.

Introduction

הגברה חומצות גרעין הכמותית היא טכניקה חשובה לזיהוי של איכות הסביבה, foodborne, ופתוגנים שמקורן במים, כמו גם לאבחון קליני. תגובה בזמן אמת השרשרת של פולימראז כמותיים (qPCR) היא שיטת תקן הזהב לגילוי רגיש, ספציפי, וכמותי של חומצות גרעין, למשל, לHIV-1 בדיקה נגיפית עומס, זיהוי של חיידקים פתוגנים, ובדיקות סקר לאורגניזמים רבים אחרים ^{- 1 3.} במהלך זמן אמת qPCR, פריימרים להגביר DNA הפתוגן במחזורים, ואות ניאון שנוצרה היא פרופורציונאלי לכמות ה- DNA המוגבר במדגם בכל מחזור. מדגם המכיל ריכוז לא ידוע של DNA הפתוגן ניתן לכמת באמצעות עקומה סטנדרטית המתייחסת הריכוז הראשוני DNA של דגימות סטנדרטי והזמן שבו אות הניאון מגיעה לסף מסוים (כלומר, סף המחזור, או _T C).

"Jove_content"> מכיוון שזמן אמת qPCR דורש ציוד יקר תרמית רכיבה על אופניים וכמה שעות כדי לקבל תוצאות, טכניקות הגברה בידוד תרמיות חלופיות, כגון הגברה פולימראז recombinase (RPA), פותחו ^4. פלטפורמות אלה בדרך כלל מספקות תוצאות מהירות יותר ולהגביר חומצות גרעין בטמפרטורה נמוכה יותר, בודדת, אשר עשוי להיות מושלמת עם ציוד פחות יקר, יותר פשוט. RPA, שהוא אטרקטיבי במיוחד עבור יישומי נקודה של טיפול, מגביר DNA בדקות, דורש טמפרטורה נמוכה הגברה (37 ° C), ונשאר פעיל בנוכחות של זיהומי ^5,6. מבחני RPA פותחו עבור מגוון רחב של יישומים, כוללים ניתוח מזון, זיהוי פתוגן, הקרנת סמים סרטן, וזיהוי של סוכני biothreat ^7-12. עם זאת, שימוש בRPA לכימות של חומצות גרעין הוגבל ^13,14.

בעבודה קודמת, זה היה shown שRPA כמותית בזמן אמת (qRPA) אינו ריאלי ^15. כאן, פרוטוקול מפורט יותר ניתן לשימוש בזמן אמת RPA כמותיים לכמת דגימות ידועות באמצעות עקומה סטנדרטית, שיטה שדומה לכימות באמצעות qPCR. פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע תגובת RPA על Cycler תרמית לגילוי DNA HIV-1 כהוכחה של קונספט, כמו גם כיצד לפתח שליטה פנימית חיובית (IPC) כדי להבטיח את המערכת מתפקדת כראוי. איסוף נתונים באמצעות Cycler תרמית או ניתוח מיקרוסקופ ונתונים לבניית עקומת סטנדרט באמצעות נתוני אימון גם מפורט. לבסוף, השיטה לכימות דגימות ידועות באמצעות העקומה סטנדרטית עם תסריט מותאם אישית באה לידי ביטוי. טכניקה זו מאפשרת qRPA כימות של דגימות בריכוזים לא ידועים ויש לו יתרונות רבים על פני זמן אמת מסורתי qPCR.

Protocol

תכנית 1. Cycler התרמי לתגובות qRPA בזמן אמת

1. צור פרוטוקול חדש בתוכנת Cycler התרמית.
   1. הכנס צעד מראש דגירה: 39 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות.
   2. הוסף צעד שני: 39 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות ואחריו צלחת קריאה.
   3. לבסוף, הכנס "ללכת" שחוזר על השלב השני 59 פעמים יותר.
   4. שמור את הפרוטוקול.
2. צור צלחת חדשה בכרטיסייה "עורך צלחת" של התוכנה. בחר בארות על הצלחת המתאימה למקומות מתגובות RPA (כאן, בארות שימוש A1, A4-A8, B1, וB4-B8).
   הערה: זה לא חשוב אם את סוג המדגם של הבארות (למשל, "תקן", "NTC") מצוין, כמו ניתוח הנתונים נעשה באמצעות סקריפט מותאם אישית.
   1. לניסויים המכילים DNA HIV-1 בלבד, בחר fluorophore "HEX" לכל הבארות. לניסויים המכילים DNA HIV-1 ושיתוף פנימי חיוביntrol, בחר את שניהם "HEX" וfluorophores "FAM" לכל הבארות. שמור את הצלחת.

2. הכן לניסויים בHIV-1 qRPA

1. להרכיב תגובות RPA בסביבת עבודה לפני הגברה ייעודית המכילה טפטפות מיועדת, טיפים פיפטה, vortexer, ומיני-צנטריפוגה, כמו לqPCR. כRPA עשוי להגביר עותק יחיד של DNA על ידי ככל עשרה סדרי הגודל (מידע לא מוצג), לטפל ולהיפטר מצינורות המכילים מוצרי DNA מוגבר פוסט באזור לאחר הגברה ייעודית.
   1. למנוע מגע בין כל המגיבים מראש ההגברה והמוצרים לאחר ההגברה. תרסיס סביבות עבודה מראש הגברה וציוד עם אקונומיקה 50% לפני ואחרי כל הניסויים. השתמש במגבת נייר לנגב אקונומיקה עודפת.
2. רצף פריימר קדימה רכישה 5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3 'ולהפוך רצף פריימר 5'-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3 'מסינתיסייזרים DNA מסחריים. לרכוש את רצף הבדיקה 5'- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA / HEX] GC [THF] C [DT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3 "ממקורות מסחריים. אחסן את כל צבעי היסוד ובדיקות בבית 4 ° C בaliquots בריכוז של 10 מיקרומטר לפני השימוש.
   הערה: assay qRPA מגביר רצף HIV-1 ייחודי. עבור assay הוכחה של קונספט זה, השתמש בpHIV-IRES- eYFPΔEnvΔVifΔVpr פלסמיד שתואר על ידי et al סאטון. המכיל את רצף היעד ^16. בניסויים qRPA, פלסמיד אוחסן על 4 מעלות צלזיוס בaliquots המכיל 1, 10, 10 ^2, 10 ^3, ו- 10 ⁴ עותקים לμl במאגר המכיל 10 מ"מ טריס, 0.1 מ"מ EDTA ב- pH 8.0, וng / 1 DNA μl אדם הגנומי המוביל (360,486). ריכוז ה- DNA ספק זה שווה את ריכוז ה- DNA המתקבל מערכות חילוץ מסחריות DNA הסרום משמשות לאבחון HIV-1 ^17. HIV-1 אלהדילולים שמשו כתבניות בתגובות qRPA לבנות עקומה סטנדרטית.

3. להרכיב qRPA תקן Curve HIV-1

1. לפני הרכבת תגובות qRPA, להכין את סביבת העבודה לפני ההגברה כמתואר בשלב 2.1.1. מניחים בלוק קר 96-גם באחסון על 4 מעלות צלזיוס.
2. הכן ריאגנטים עבור 12 תגובות:
   1. הזז את אצטט מגנזיום, חיץ להחזרת הנוזלים, ו -12 כדורי תגובת RPA לסביבת העבודה לפני ההגברה.
   2. להפשיר אצטט מגנזיום וחיץ להחזרת הנוזלים בטמפרטורת חדר.
   3. Aliquot 32.5 μl של אצטט מגנזיום (2.5 μl לכל תגובה) לצינור microcentrifuge.
   4. להכין תערובת 13x אדון. להוסיף 383.5 μl של החיץ להחזרת הנוזלים (29.5 μl לכל תגובה) לצינור microcentrifuge נפרד לתערובת האמן. להוסיף 41.6 μl של מים חופשיים nuclease (3.2 μl לכל תגובה) לתערובת האמן. מערבולת תערובת האמן.
   5. להחזיר את aceta מגנזיוםמאגר te והחזרת נוזלים לאחסון ב -20 ° C.
   6. הזז את aliquots פריימר והבדיקה מהמקרר לאזור קדם-ההגברה, הימנעות מחשיפה מוגזמת לאור כדי למזער photobleaching.
   7. להוסיף 27.3 μl כל אחד 10 מיקרומטר קדימה לאחור פריימרים (2.1 μl לפריימר לכל תגובה) לתערובת האמן.
   8. להוסיף 7.8 μl של חללית DNA 10 מיקרומטר שכותרתו HEX HIV-1 (0.6 μl לכל תגובה) לתערובת האמן.
   9. חזור פריימרים ולחקור לאחסון.
3. התאמת פריסת הצלחת מתוארת בסעיף 1.2, מקום גלולה אנזים 1 בכל אחד מצינורות שמאל הקיצוני וגלול אנזים 1 בכל אחד 5 צינורות קצה שמאלי של 2 8-גם רצועות צינור עלייה נמוכה PCR.
4. בזהירות להוסיף 37.5 μl של תערובת אמן לכל צינור המכיל גלולה אנזים, באמצעות קצה פיפטה חדש עבור כל צינור ובעדינות תוך ערבוב תערובת האמן וגלול עם הקצה עד גלולה נמס לגמרי. מערבבים בעדינות כדי למנוע formati בועהב, ולהסיר את הקצה בזהירות כדי למנוע כל אובדן של עוצמת התגובה.
5. אחרי הכל כדורי האנזים כבר rehydrated עם תערובת האמן, לשלוף את הגוש קר 96-גם מאחסון C 4 מעלות. מניחים את רצועות צינור PCR בגוש הקר לצנן את תערובת האמן.
6. בעוד תערובת האמן מתקררת, לטעון את תוכנת Cycler תרמית עם הפרוטוקול והצלחת המתואר בסעיף 1.
7. לחתוך 2 רצועות של דבק מיקרו-חותם פלסטיק שקוף להיות מעט רחב יותר מאשר צינורות PCR, ולאחזר 2 מכסי רצועת צינור שטוחים PCR.
8. אחזר 6 aliquots תבנית מאחסון (המכיל 0, 1, 10, ^1, 10 ^2, 10 ^3, או 10 ⁴ עותקים של פלסמיד HIV-1 לכל microliter).
9. הוסף 10 μl של כל תבנית לצינורות המיועדים שלריכוז התבנית. השתמש קצה פיפטה חדש עבור כל צינור, בעדינות תוך ערבוב הפתרון עם הקצה כדי לערבב את תערובת ההורים ותבנית. הקפד להוסיף את התבנית למיקום הנכון למ 'Atch פריסת הצלחת מתוארת בסעיף 1.2.
10. ודא שמתאם רצועת צינור PCR לmicrocentrifuge נמצא במקום.
11. לוותר 2.5 μl של אצטט מגנזיום לכל מכסה צינור שיונח על צינור המכיל תגובת qRPA.
12. מניח בעדינות את העפעפיים על גבי צינורות PCR כך שהם אינם אטומים לחלוטין וניתן להסיר. אצטט מגנזיום ידבק המכסים ולהיות ברור לעין מלמעלה.
13. הכנס כל רצועת צינור PCR עם מכסים לכל צד של בעל צינור PCR. סגור את המכסה של minifuge להסתובב אצטט מגנזיום מהמכסים ולתגובת RPA, שיזם את תגובת RPA. צנטריפוגה עד שכל הבועות בוטלו וכל הנוזל שנאסף בחלק התחתון של צינור אחד (כ -10 שניות).
14. להסיר במהירות את רצועות צינור PCR ולהחזיר אותם לבלוק הקר כדי לעצור את תגובות qRPA.
15. מוציא בזהירות את המכסים כדי למנוע היווצרות תרסיס ולאטום כל רצועת צינור PCR עם החתךחתיכות של סרט מיקרו חותם ברור.
16. במהירות ללכת לCycler התרמית ולטעון שתי רצועות צינור PCR לCycler התרמית במקומות פריסת הצלחת (בארות A1-B8) התאמה. סגור את המכסה של Cycler התרמית, לחץ על "התחל הפעלה", ולייעד את שם הקובץ לצורך הניסוי.
    הערה: למרות שהיצרן ממליץ התססה המדגם לאחר 5 דקות של דגירה, צעד זה אינו הכרחי עבור assay המסוים הזה ויכול להיות מושמט.
17. לאחר הריצה תושלם, בחר באפשרות "הגדרות", "הגדרת Baseline," "לא Baseline חיסור" כדי להציג את נתוני הקרינה הגלם. לייצא את הנתונים לתוכנת גיליונות אלקטרוניים על ידי בחירה "יצוא", "לייצא את כל גיליונות נתונים ל- Excel." קובץ עם התוספת "תוצאות כימות הגברה" ייווצר המכיל את נתוני הקרינה בזמן אמת גלם.

4. פיתוח פנימי חיובי בקרה

1. בחר רצף ה- DNA ממינים שלא סביר שנמצא במדגם היעד. הרצף צריך להיות ארוכה יותר מamplicon היעד כך שהדור של רצף היעד מועדף.
   הערה: לassay זה, parvum Cryptosporidium, טפיל מעיים, נבחר לכהן כתבנית לדור של רצף IPC כי האורגניזם זה לא סביר שאפשר למצוא בדם והיה זמין במעבדה מפרויקט אחר. כדי ליצור את רצף IPC, לחלץ ולטהר DNA מג ביצי parvum כפי שתוארו במקום אחר ^18.
2. לרכוש את קדימה (5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G / ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3 ') ולהפוך (5'- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G / TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3 ') פריימרים ממקורות מסחריים. פריימרים IPC PCR משמשים assay זה מוצגים באיור 1 ומכילים אזור אחד שהוא חינם לתבנית IPC DNA (למשל, parvum ג, באיור 1 סגול) ואזור אחד שהוא חינם לאורגניזם היעד (לדוגמא, HIV-1, כחול באיור 1).
3. לבצע PCR באמצעות פריימרים ותבנית ה- DNA IPC.
   1. להרכיב 50 תגובות μl PCR באמצעות ריאגנטים ערכת Phusion גבוהים פידליטי DNA פולימראז על פי הוראות היצרן, לא כולל פולימראז. השתמש 2 μl של תבנית ה- DNA וPhusion המאגר HF.
   2. הוסף את פולימראז Phusion לכל תגובה אחרי התחלה חמה על 98 מעלות צלזיוס, ואחריו 60 שניות על 98 מעלות צלזיוס, ואחריו 40 מחזורים של 15 שניות על 98 מעלות צלזיוס, 30 שניות על 62 מעלות צלזיוס, ו- 30 שניות על 72 מעלות C עם סיומת סופית על 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לאחר רכיבה על אופניים תרמיים, להחזיק דגימות ב 4 מעלות צלזיוס.
   3. ניתוח דגימות על ידי ג'ל אלקטרופורזה על 2% agarose ג'ל טה, ולאחר מכן לחלץ ולטהר DNA באמצעות ערכת חילוץ ג'ל QIAquick לפי פרוטוקול microcentrifuge כלול בהערכה.
4. מסך מועמדי IPC ביכולתם להגביר שימוש בqRPA.
   1. הכן תגובות qRPA כפי שתואר בסעיף 3, באמצעות HIV-1 פריימרים, בדיקה שכותרתו FAM ספציפיים לIPC (5'-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [DT-BHQ1 ] GGT TTT GTA ATT GGA, וכן סך -3 ') של 0, 10, 10 ^2, 10 ^3, 10 ^4, או 10 ⁵ עותקים של כל מועמד IPC לכל תגובה, בדיקה כל הריכוזים בשני עותקים.
   2. בחר את מועמד IPC שמגביר באופן עקבי ביותר ויש לו הגבול-של-גילוי הנמוך ביותר.
5. Co-להגביר HIV-1 וIPC כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי של IPC DNA.
   1. בדומה לסעיף 3, לשלב הבא בכל תגובת 50 μl: 29.5 μl של חיץ להחזרת נוזלים, 2.1 μl של RPA של פריימר קדימה [10 מיקרומטר], 2.1 μl של RPA לאחור תחל [10 מיקרומטר], 0.6 μl של HEX HIV-1 בדיקה שכותרתו [10 מיקרומטר], 10 μlשל DNA HIV-1 בריכוזים שונים, 2.5 μl של אצטט מגנזיום, וגלולת אנזים 1. במקום להוסיף 3.2 μl של מים חופשיים nuclease כפי שנעשה בשלב 3.2.4, להוסיף 0.6 μl של תווית בדיקה-FAM IPC [10 מיקרומטר], ו -2.6 μl של IPC DNA. השתמש בריכוז IPC שהוא גילוי הגבול-של-(לוד) כאשר qRPA מתבצע עם DNA IPC לבד (לוד המוגדרת כריכוז הנמוך ביותר שבו כמות דור אות הקרינה היא גדולה יותר מזה שנוצר על ידי הקרינה שנוצרה על ידי הדגימות עם אין DNA יעד).
   2. דגירה הדגימות באמצעות הפרוטוקול המתואר בסעיף 1.1.
   3. אם IPC לא להגביר בכל מדגם, לשקול חזרה על הניסוי עם כדי ריכוז אחד IPC גודל גבוה. הריכוז האופטימלי של ה- DNA IPC עבור assay HIV-1 הוא 10,000 עותקים / μl. בעוד דגימות נחשבות תקפה אם יש או IPC או הגברה DNA HIV-1, באופן אידיאלי IPC מציג הגברה גילוי לכל תגובה.

5. בניית עקומת סטנדרט מניסויים מרובים

1. להבטיח את הנתונים עבור כל ניסוי כבר מיוצא לתכנית גיליון אלקטרוני כמפורט בסעיף 3.13.
2. לפתוח ולהפעיל את התסריט "JoVE_qRPA_standard_curve.m". כל התשומות תתבקש באופן אוטומטי בחלון הפקודה. לאחר התסריט הוא יזם, המשתמש מתבקש באופן אוטומטי ליעד "מספר קבצי נתונים" המשמש לבניית העקומה סטנדרטית.
3. בחלון הפקודה, הקלד את מספר הקבצים שישמש לבניית עקומת הסטנדרט ולחצו תנטרו.
4. הקלד בחלון הפקודה מספר הדגימות ומספר החזרות בכל קובץ הכשרה (לחץ על ENTER לאחר כל כניסה).
   הערה: בפריסת הצלחת המתוארת בסעיף 1.2, היו 6 דגימות עם ריכוזים שונים ו -2 חזרות של כל דגימה).
5. הקלד בחלון הפקודה DN הנמוך ביותרריכוז שימש לבניית העקומה סטנדרטית (בlog10 עותקים) ולחץ ינטר (לפריסת הצלחת המתוארת בסעיף 1.2, ריכוז התבנית הנמוך ביותר הוא '1' log10 עותקים).
6. הקלד את החלון הפקודה ההבדל בריכוז בין כל תקן (בlog10 עותקים) ולאחר מכן קש enter (לפריסת הצלחת המתוארת בסעיף 1.2, מרווח הריכוז הוא '1' log10 עותקים).
7. לאחר בקשת האישור, הקלד את "סף המדרון" בחלון הפקודה ולחץ על Enter.
8. בחלון הפקודה, הקלד את "מספר (z) סטיות תקן מעל הרקע לסף חיובי," ולאחר מכן לחץ על Enter. ערכים אופייניים עבור מגוון z 1-5.
9. ציין אם הנתונים נאספו באמצעות Cycler התרמית ('1'), * תמונות מיקרוסקופ .tiff ('2'), או * מיקרוסקופ .jpg תמונות ('3') על ידי הקלדת המספר '1', '2,' או '3, "וpressing להיכנס.
10. בחר להגדיר סף IPC חדש או להשתמש ערך ברירת מחדל עבור הסף על ידי ההקלדה 'y' או 'n' בהתאמה, כאשר תתבקשו לעשות זאת.
11. הבא, בחר כל אחד מקבצי הגיליון האלקטרוני המשמשים לבניית העקומה סטנדרטית.
    הערה: התסריט באופן אוטומטי לייבא נתונים HEX וקרינת FAM; לקבוע אם כל תגובה הייתה בתוקף (כלומר, אם אותות הקרינה חריגה הספים לHEX או ערוצי FAM); לקבוע את מקדם r ² למעריכים, ליניארי, ובכושר פולינום מסדר שני; עלילה "log10 עותקים לעומת סף מחזור" לכל מדגם המשמש לבניית העקומה סטנדרטית; וליצור קובץ גיליון אלקטרוני המכיל משתנים חיוניים כדי לבנות מחדש את העקומה סטנדרטית עבור ניסויי אימות ללא צורך למשתמש להזין מחדש את כל הפרמטרים הקלט שוב.

6. Assay אימות וכימות של דגימות ידועות שימושעקומת הסטנדרט

1. השתמש בתסריט "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m" להעריך את הדיוק ואת הדיוק של assay באמצעות דגימות בריכוזים ידועים או להשתמש בו כדי לכמת דגימות בריכוזים לא ידועים.
   הערה: מאחר שהמחקר שפורסם בעבר הראה כי כושר מעריכי הניב המקדם r בריבוע הטוב ביותר ^18, התסריט הזה מנצל בכושר מעריכי לעקומה סטנדרטית. אם סוג של כושר שונה הוא רצוי, התסריט עשוי להיות שונה בהתאם.
   1. לפתוח ולהפעיל את התסריט "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m". לאחר התסריט הוא יזם, המשתמש מתבקש באופן אוטומטי להזין את כל התשומות לחלון הפקודה.
   2. הזן '1' כדי לאמת assay באמצעות עקומה סטנדרטית עם מדגם ריכוזים ידועים או להיכנס '2' לכמת דגימות ידועות.
   3. כשיתבקש, או לבחור עקומה סטנדרטית הצילה או לבנות אחד חדש על ידי הזנת המידע דואר ששדל באופן אוטומטי בחלון הפקודה (את אותו מידע שנדרש לתסריט "JoVE_qRPA_standard_curve.m" מסעיף 5).
   4. הקלידו את מספר הניסויים (כלומר, קבצי גיליון אלקטרוני) כדי לנתח לאימות / כימות.

7. הכנה לאיסוף נתונים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי וצ'יפ מחומם

1. ודא שיש מיקרוסקופ פלואורסצנטי דוד במה ובקר טמפרטורה 1-ערוץ Precision יציבות גבוהה במקום.
2. ודא מיקרוסקופ פלואורסצנטי יש קוביית מסנן לרגש ולאסוף הקרינה מכל fluorophore. לרגש ולאסוף את הקרינה FAM נוצרה במהלך ההגברה IPC DNA דרך מסנן GFP (עירור BP 470/40 ננומטר, nm BP 520/50 פליטה). לרגש ולאסוף את הקרינה HEX שנוצרה במהלך ההגברה DNA HIV-1 דרך מסנן HEX (עירור BP 530/30 ננומטר, nm BP 575/40 פליטה).
3. השתמש בתוכנת עריכת תסריט מיקרוסקופ כדי ליצור אלגוריתם אוטומטי לשכפל איסוף נתונים על Cycler התרמית.
   1. ראשון להכניס "הגדרות" צעד כדי לסגור את התריס. הבא להוסיף צעד "חשיפה" כדי להגדיר את החשיפה עד 60 שניות. הכנס "Snap" לביצוע עיכוב 60 שניות, אשר מיישם את התקופה שלפני הדגירה 1 דקות. הוסף צעד "הגדרה" כדי לשנות את קבוצת העבודה למסנן GFP. הכנס אחר צעד "חשיפה" על מנת להתאים את החשיפה ל -200 אלפיות שניים. כל החשיפות באמצעות GFP או קוביות מסנן HEX תוגדר 200 אלפיות שניים.
   2. לאחר השלב "חשיפה", להוסיף "Snap" ולציין את המצלמה שבה התמונה תילקח. השתמש בצעד נוסף "הגדרה" כדי לסגור את התריס וצעד "שמור תמונה" כדי לשמור את התמונה לתיקייה זמנית בהגדרת משתמש.
   3. מתג ליד קוביית מסנן HEX באמצעות צעד נוסף "הגדרה" והen להוסיף "חשיפה" ב- 200 אלפיות שני, "הצמד", וצעד "שמור תמונה".
   4. חזור על תהליך זה 59 פעמים עם עיכוב ראשוני של 20 שניות במקום 60 (תריס קרוב, לחכות 20 שניות, מתג לקוביית מסנן GFP, חשיפה, שקבעה 200 אלפיות שני, הצמד, קרוב תריס, לחסוך, מתג לקוביית מסנן HEX חשיפה שנקבעה, 200 אלפיות שני, הצמד).
4. צור שבב שיחזיק תגובות qRPA.
   1. בניסויים באמצעות מיקרוסקופ, להשתמש בקובץ JoVE_qRPA_base.ai לחתוך 40 x 15 מ"מ בסיס מלבני מגיליון של "1/8 אקריליק השחור העבה, בעזרת סכין לייזר מוגדר כוח 100%, מהירות של 10%.
   2. השתמש בקובץ JoVE_qRPA_well.ai לחתוך תגובה גם בהיקף של ריבוע בגודל 10 x 10 מ"מ עם חור עגול בקוטר 5 מ"מ מגיליון של 1.5 מ"מ אקריליק ברור העבה.
   3. צרף עד שלוש בארות לבסיס יחיד באמצעות ג'ל דבק מגע.
   4. לילה יבש.

8. איסוף נתונים וAnalysis באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

1. הכן את המיקרוסקופ לאיסוף נתונים על ידי טעינת תסריט איסוף נתונים האוטומטי JoVE_AxioVision_Script.ziscript.
   1. הגדר את תנור שלב 48 ° C ומחמם את שבב התגובה על דוד הבמה לכ -20 דקות. הגדרת טמפרטורה של 48 מעלות צלזיוס שומרת על טמפרטורה של 39 מעלות צלזיוס בתגובה גם (מידע לא מוצג).
   2. באמצעות מטרת NA 10X, 0.45, להתמקד בחלק העליון של הקצה הפנימי של התגובה גם עם מסנן GFP במקום. הקצוות של אקריליק autofluorescent לאחר חיתוך לייזר ויכולים להיות דמיינו בקלות. לאחר ההתמקדות, לא להתאים את הגובה של הבמה מיקרוסקופ עד שכל הנתונים שנאספו.
2. להרכיב תערובת אמן qRPA בסביבת עבודה לפני הגברה ייעודית כמתואר בשלב 4.5.1. עבור כל דגימה, לערבב גלולה אנזים, תערובת אמן, ותבנית ה- DNA HIV-1 בצינור microcentrifuge. להוסיף 2.5 μl של אצטט מגנזיום לreactio הראשוןn ובקצרה מערבולת.
3. במהירות להעביר את צינור microcentrifuge המכיל מדגם qRPA למיקרוסקופ פלואורסצנטי.
   1. בזהירות פיפטה 30 μl של תגובת RPA לתגובה גם מבלי ליצור בועות. הנח טיפה של שמן מינרלי כיתה PCR על תגובת RPA על מנת למנוע אידוי.
   2. מקם את גם ישירות מתחת למיקרוסקופ המטרה, מקפיד תמונה רק במרכז הבאר, לא כל קצות אקריליק אוטומטי ניאון. לאחר היטב ממוקם, להריץ את הסקריפט האוטומטי 7. התסריט יוצר תמונה אחת JPEG באמצעות קוביית מסנן FAM ואחד תמונת JPEG באמצעות קוביית מסנן HEX כל 20 שניות.
4. לאחר התסריט הושלם, להעביר תמונות אלה מתוך תיקיית האחסון הזמנית לפני הפעלת דגימות נוספות.
   1. צור 2 תיקיות: 1 עבור כל fluorophore (כלומר, 'HEX' ו 'FAM'). אחסן את שני התיקיות באותה תיקיית אב. בכל fluorophoreתיקייה, צור תיקייה שכותרתו עם מספר עותקי DNA בדגימה (לדוגמא, 0, 10, וכו ').
   2. העבר את כל הקבצים עם 'HEX' הקידומת לתיקיית המשנה המקביל בתיקייה 'HEX'. העבר את כל הקבצים עם 'GFP' הקידומת לתיקיית המשנה המקביל בתיקייה 'FAM'.
5. סעיפים חזרו על 8.2-8.4 לתגובות qRPA עם 0, 10, 10 ^2, 10 ^3, 10 ^4, ו -10 ⁵ עותקי DNA HIV-1.
6. לאחר איסוף הנתונים עבור כל דגימות qRPA בניסוי, לטעון את התסריט "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m." כאשר תתבקש על ידי התסריט, בחר את התיקייה המכילה את תיקיות הורה fluorophore 2, אשר בתורו להכיל את התמונות עבור כל ריכוז בתיקיות משנה.
   הערה: התסריט באופן אוטומטי ליצור קובץ גיליון אלקטרוני בספריית האב שבו נתוני הקרינה HEX יישמרו בנאמו גיליון"HEX 'אד, ונתוני הקרינה FAM יישמרו בגיליון בשם" FAM'. בכל גיליון, מספר המחזור מופיע בעמודת B, ונתוני הקרינה בזמן אמת להגדלת ריכוזים של תבנית ניתנים בעמודות C, D, וכו '. כל נתון הקרינה בזמן אמת הוא עוצמת הקרינה הממוצעת של התמונה שצולמה באותה נקודת הזמן.
7. השתמש בפונקצית עלילת פיזור ברירת מחדל בתוכנת הגיליונות האלקטרוניים לתכנן B2 תאים: H61 של 'HEX' וגיליונות 'FAM' כדי להמחיש הקרינה בזמן אמת וליצור חלקות דומות לאלה ב2A דמויות, 2B, 3A, 3B ו.
   הערה: גם הגיליון האלקטרוני שנוצר בשלב 8.6 ניתן להשתמש בסקריפטים "JoVE_qRPA_standard_curve.m" ו- "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m".

תוצאות

לפני בחירת רצף לשמש IPC בניסויי qRPA עם יעד מועמדי DNA (HIV-1), שליטה פנימית חיובית (IPC) נוצרים והוקרנו ביכולתם להגביר בתגובות qRPA ללא נוכחי DNA HIV-1. מועמדי IPC הם ארוכים יותר מהיעד (HIV-1) DNA כדי למנוע היווצרות IPC מהיווצרות amplicon HIV-1 מתחרה-out. כפי שניתן לראות באיור 2 א, הדור של שני...

Discussion

על מנת לקבל נתונים כימות משמעותיים באמצעות אלגוריתם MATLAB, המשתמש חייב לבחור ערכי קלט מתאימים כאשר תתבקשו לעשות זאת. לאחר ביצוע כל תסריט בסעיפים 5 ו -6, כל משתני הקלט שנשלחים באופן אוטומטי בחלון הפקודה ותפוקות נוצרות באופן אוטומטי. בסעיף 5.7 המשתמש יתבקש לבחור סף מדרון. הע...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
qRPA Assay
HIV-1 forward primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3’
HIV-1 reverse primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3’
HIV-1 probe	BioSearch Technologies	custom DNA oligos	5’- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3’
IPC probe	BioSearch Technologies	custom DNA oligos	5’-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3’
RPA exo reagents (pellets, rehydration buffer, magnesium acetate	TwistDx	TwistAmp exo
PCR tube strips	BioRad	TLS0801
PCR flat cap tube strips	BioRad	TCS0803
Micro-seal adhesive	BioRad	558/MJ
HIV-1 target (pHIV-IRES- eYFPΔEnvΔVifΔVpr)			custom plasmid, see: Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy 8, 118–129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003).
Human male genomic DNA	Applied Biosystems	360486
96 well cold-block	Cole Parmer	EW-36700-48
Thermal cycler	BioRad	CFX96
MiniFuge	VWR	93000-196
Vortex	VWR	58816-121
Tris buffer 1.0 M, pH 8.0	EMD Millipore	648314
EDTA 0.5 M, pH 8.0	Promega	V4321
Nuclease free water	Ambion	AM9937
IPC Development
Cryptosporidium parvum IPC template	Waterborne Inc	P102C	It is also possible to order a double stranded synthetic target from IDT if the user is unequipped to work with C. parvum (a BSL-2 infectious agent). PCR and RPA primers for C. parvum were designed using GenBank accession number AF115377.1
PCR long forward primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3’
PCR long reverse primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3’
Phusion High-Fidelty DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530S
Qiaquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
TAE 10X buffer	EMD Millipore	574797
Agarose	Sigma Aldrich	A9539
Microscope Experiments
Upright fluorescence microscope	Zeiss	Zeiss Imager.J1
Stage heater	Bioscience Tools	TC-GSH
1-Channel Precision High Stability Temperature Controller	Bioscience Tools	TC-1100S
FAM/GFP filter cube	Zeiss	filter set 38 (000000-1031-346)	excitation BP 470/40 nm, emission BP 520/50 nm
HEX filter cube	Chroma	49014	excitation BP 530/30 nm, emission BP 575/40 nm
Laser cutter	Engraver's Network	VLS3.60
1/8" black acrylic	McMaster Carr	8505K113
1.5 mm clear acrylic	McMaster Carr	PD-72268940
Super glue	Office Depot	Duro super glue
PCR grade mineral oil	Sigma Aldrich	M8662-5VL
Data Analysis
Microsoft Excel	Microsoft
MATLAB	MATLAB
MATLAB script: "JoVE_qRPA_standard_curve.m”	Included in SI
MATLAB script: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m”	Included in SI
MATLAB script: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m”	Included in SI
Adobe Illustrator	Adobe
JoVE_qRPA_well.ai	Included in SI
JoVE_qRPA_base.ai	Included in SI
AxioVision software	Zeiss
JoVE_AxioVision_Script.ziscript	Included in SI