ניתוח electroretinogram של התגובה החזותית בדג הזברה זחלים

Summary

We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

Abstract

Electroretinogram (ERG) הוא שיטה לא פולשנית אלקטרו לקביעת תפקוד רשתית. באמצעות המיקום של האלקטרודה על פני השטח של הקרנית, פעילות חשמלית שנוצרה בתגובה לאור ניתן למדוד ומשמש להערכת הפעילות של תאים ברשתית in vivo. כתב יד זה מתאר את השימוש של ERG למדוד תפקוד ראייה של דג הזברה. דג הזברה ארוכה כבר נוצל כמודל לפיתוח חוליות בשל הקלות של דיכוי גן על ידי oligonucleotides morpholino ומניפולציה תרופתית. ב5-10 DPF, רק קונוסים הם פונקציונליים ברשתית הזחל. לכן, דג הזברה, בניגוד לבעלי חיים אחרים, היא מערכת מודל עוצמה לחקר תפקוד הראייה קונוס in vivo. פרוטוקול זה משתמש הרדמה סטנדרטית, מיקרומניפולציה ופרוטוקולי stereomicroscopy כי הם נפוצים במעבדות המבצעות מחקר דג הזברה. שיטות שתוארו לעשות שימוש בEQ אלקטרופיזיולוגיה הסטנדרטיuipment ומצלמה אור נמוך כדי להנחות את המיקום של microelectrode ההקלטה על גבי קרנית הזחל. לבסוף, אנו מדגימים כיצד ממריץ / מקליט ERG זמין מסחרי שנועד במקור לשימוש עם עכברים יכול בקלות להיות מותאם לשימוש עם דג הזברה. ERG של דג הזברה זחל מספק שיטה מצוינת שלו מנסה לאמוד פונקציה חזותית חרוט בבעלי חיים ששונו על ידי הזרקת oligonucleotide morpholino כמו גם בשיטות של הנדסה גנטית חדשות יותר כגון אצבע nucleases (ZFNs) האבץ, תמלול Activator-כמו מפעיל nucleases (TALENs), ו חזרות התקבצו באופן קבוע Interspaced הקצר Palindromic (CRISPR) / Cas9, אשר כולם בצורה ניכרת את היעילות והיעילות של גן המיקוד בדג זברה. בנוסף, אנו מנצלים את היכולת של סוכנים תרופתיים לחדור זחלי דג הזברה להעריך את המרכיבים המולקולריים התורמים לphotoresponse. פרוטוקול זה מתאר התקנה שיכולה להיות משונית ושימוש על ידי חוקריםעם מטרות ניסוי שונות.

Introduction

Electroretinogram (ERG) הוא שיטה לא פולשנית אלקטרו שכבר נעשה שימוש נרחב במרפאת לקביעת התפקוד של הרשתית בבני אדם. הפעילות החשמלית בתגובה לגירוי אור נמדדת על ידי הנחת אלקטרודות הקלטה על פני השטח החיצוניים של הקרנית. המאפיינים של הפרדיגמה הגירוי וצורת גל התגובה להגדיר את תאי העצב ברשתית תורמים לתגובה. שיטה זו הותאמה לשימוש עם מספר המודלים של בעלי חיים, כולל עכברים ודג זברה. יש תגובת ERG חוליות הטיפוסית ארבעה מרכיבים עיקריים: א-גל, שהוא פוטנציאל קרנית-שלילית הנגזר מפעילות תאי קולטי אור; ב-הגל, פוטנציאל קרנית-חיובית הנגזר מON תאים דו קוטביים; ד-הגל, פוטנציאל קרנית-חיובית להתפרש כפעילות של התאים דו קוטביים OFF; וג-הגל, אשר מתרחש כמה שניות לאחר b-הגל ומשקף פעילות בגליה מולר והמילאפיתל הפיגמנט INAL ^1-4. אזכור נוסף להבנת ההיסטוריה והעקרונות של ניתוח ERG בבני אדם ובעלי חיים מודל הוא ספר הלימוד המקוון, Webvision, מאוניברסיטת יוטה וטקסטים כגון עקרונות ותרגול של אלקטרופיזיולוגיה הקלינית של ^{4 Vision, 5.}

rerio Danio (דג הזברה) כבר העדיף ארוך כמודל לפיתוח חוליות, בשל ההבשלה המהירה שלה ושקיפות, אשר מאפשרת ניתוח לא חודרני המורפולוגי של מערכות איברים, מבחני התנהגות והן קדימה לאחור מסכי גנטיים (לסקירה, ראה Fadool ו דאולינג ^6). זחלי דג הזברה הם נוחים מאוד למניפולציה גנטית ותרופתית, אשר, כאשר יחד עם הפוריות הגבוהה שלהם, לגרום להם מודל חיה מצוין לניתוחים ביולוגיים תפוקה גבוהה. היחס גבוה יותר של קונוסים למוטות בדג הזברה זחל - בערך 1: 1 בהשוואה לעכברים (~ קונוס 3%ים) - להפוך אותם שימושי במיוחד ללימוד הפונקציה חרוט ^7-9.

ברשתית החוליות, קונוסים לפתח לפני מוטות ^10. מעניין, קונוסים דג הזברה הם אופרטיביים מוקדם ככל 4 DPF, המאפשרים ניתוח אלקטרו סלקטיבית של קונוסים בשלב זה ^{6, 11,12.} בניגוד לכך, תגובות ERG במוטות מופיעות בין 11 ל 21 DPF ^13. לכן, זחלי דג הזברה ב4-7 DPF לשרת תפקודי כרשתית כל-קונוס. עם זאת, תגובת ERG photopic יליד 4-7 זחלי DPF נשלט על ידי b-הגל. יישום של סוכנים תרופתיים, כגון L - (+) - 2-אמינו-4-phosphono-butyric חומצה (L-AP4), אגוניסט לגלוטמט metabotropic קולט (mGluR6) בא לידי ביטוי בON תאים דו קוטביים, חוסם ביעילות את הדור של ב-הגל ומגלה את הפוטנציאל המבודד ההמוני קונוס קולט, ("גל") ^14-17.

כאן אנו מתארים פשוטים וreliablשיטת דואר לניתוח ERG באמצעות ציוד ERG זמין מסחרי מיועד לשימוש עם עכברים שהותאמו לשימוש עם זחלי דג הזברה. מערכת זו יכולה להיות מנוצלת על זחלי דג הזברה של משתנה רקע גנטי, כמו גם אלו שטופלו בסוכנים תרופתיים, כדי לסייע לחוקרים בזיהוי של מסלולי איתות שתורמים לרגישות חזותית והסתגלות אור ^16. הפרוצדורות מפורטות בפרוטוקול זה תדריך את החוקרים בשימוש בניתוח ERG כדי לענות על מגוון של שאלות ביולוגיות הנוגעות לראייה, ומדגימות את הבנייה של התקנת ERG גמישה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

אחזקת בעלי חיים ופרוטוקולי ניסוי אושרו על ידי ועדות הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים של אוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל, ולעמוד בכל הדרישות של משרד NIH של בעלי חיים במעבדת רווחה והאגודה להערכה והסמכה של מעבדה טיפול בבעלי חיים בינלאומיים.
הערה: פרוטוקולים כדי להשיג זחלים לניתוח ERG, שפורסם לגידול דג הזברה סטנדרטי ותחזוקה הועסקו ^18. זחלים שהושגו באמצעות רבייה טבעית, ושוכנו בשעה 14 מחזור אור / חושך 10 שעות. פרוטוקול זה כבר מותאם לזחלים ב5-7 ימים לאחר הפריה (DPF), אבל יכול להתבצע באופן אידיאלי על דגים מבוגרים עם שינויים קטנים להליך. כאן, להשתמש בלחץ TL של זחלי דג הזברה wild-type בשעה 5 DPF.

1. Micropipette הפקה

1. משוך כמה micropipettes באמצעות 1.5 x 0.86 מ"מ (קוטר חיצוני על ידי קוטר פנימי) נימי זכוכית בורוסיליקט אש מלוטשת עםחוט להט (טמפרטורת התכה, 821 ° C) וFlaming / בראון micropipette פולר P-97 מצויד בנימת חום תיבה. השתמש בתכנית לעיצוב micropipettes המתואר בטבלה 1.
2. בדוק כל micropipette תחת מיקרוסקופ עם שליט graticule מתאים כדי להבטיח שטיפים הם 10-15 מיקרומטר בקוטר ויש לו טיפ פתיחה חלקה (כלומר, ללא קצוות משוננים).
3. לאחסן בזהירות micropipettes כדי למנוע נזק קצה וחשיפה לאבק. אפשרויות אחסון כוללות צלחות פטרי עם מעבדה קלטת, קופסות מרופדות קצף, או מיכלי אחסון micropipette זמין מסחרי.
   ניתן להשתמש בנימי מושכי micropipette אחרים וזכוכית ארוכות כמו הקוטר הנכון של micropipette וקצה באיכות גבוהה מושגת: הערה.

לחץ	חום	משוך	Velocity	זמן
500	560	-	30	200
500	450	-	30	200
500	410	55	40	200

טבלת 1: תכנית לייצור micropipettes באמצעות / micropipette פולר חום P-97 Flaming המצויד בנימת חום תיבת Micropipettes מבוצעים באמצעות 1.5 x 1.0 מ"מ ² (קוטר חיצוני על ידי קוטר פנימי) נימי זכוכית בורוסיליקט אש מלוטשת עם נימה. (טמפרטורת היתוך, C 821 °).

2. הצפת הכנה

1. השתמש מסונן, המאגר של רינגר דג זהב מחומצן ¹⁹ בנימי microelectrode וכדי להרוות את ספוג אלכוהול פוליוויניל (PVA) על שהזחלים ממוקמים לניסויים. לחלופין, השתמש ב- E3 תקשורת עובר או תמיסת מלח מאוזנת של האנק.
2. הכן פתרון 10x רינגר דג זהב כפי שמתואר בטבלה 2. התאימו לpH 7.8, ולעקר באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר ולאחסן את המניה 10x על 4 מעלות צלזיוס.
3. ליצור פתרון עבודה ביום של הניסוי על ידי דילול הפתרון של רינגר 10x ל1X עם מים ללא יונים, מזוקקים. לסנן באמצעות מערכת סינון 0.22 מיקרומטר. חמצן על ידי מבעבע עם 95% O גז ₂ CO _2/5% במשך 10 דקות. כובע בחוזקה לאחר מכן על מנת להבטיח שהפתרון נותר מחומצן.

NaCl	1.25 M
KCl	26 מ"מ
CaCl 2	25 מ"מ
MgCl 2	10 מ"מ
גלוקוז	100 מ"מ
HEPES	100 מ"מ

jove_content "> טבלה 2: הכנת פתרון 10x רינגר דג זהב.

3. electroretinogram פלטפורמה

1. לבצע ניסויי ERG על שולחן נגד רעידות בתוך כלוב פאראדיי כדי לשפר את יחס האות לרעש. צרף פלטפורמת פלדה מותאמת אישית לשולחן נגד הרעידות באמצעות אגוזי משושה. הנח פלטפורמת פלסטיק מטלטלין עם תחתית viscoelastic פולימר urethane הלם קליטה על השולחן מתחת למקור האור.
2. מקם את המצלמה עם מעמד ממוגנט, שמטרה למטה בפלטפורמת פלסטיק מטלטלין. מקם את micromanipulator (אשר יחזיק microelectrode ההקלטה) עם מעמד ממוגנט שני מהימין לפלטפורמת פלסטיק מטלטלין. ודא שהמצלמה וmicromanipulator לא יופרעו על ידי התנועה של ציוד אחר ושהם לא לחסום תאורה ממקור האור.
3. חבר את המצלמה לצג וידאו ולמקם אותו כדי להציג את עינו שלזחל להצבת אלקטרודה במיקום הנכון.
4. ודא שההגדרה היא מוארקת כראוי עם חוטי נחושת. כדי לבדוק את הרעש, למקם את האלקטרודה התייחסות וקצה microelectrode ההקלטה בגודל 35 מ"מ צלחת פטרי מלא עם הפתרון של רינגר. בדוק את רמות הרעש החשמלית של ההתקנה עם אוסצילוסקופ או תכונה מובנית של מנגנון ERG. רמות רעש צריכה להיות לא יותר מ ± 10 μV מנקודת ההתחלה.

4. ספוג הכנה

1. לחתוך מלבן קטן של ספוג PVA היבש שיתאים בנוחות בצלחת פטרי 35 מ"מ. העובי של הספוג לא צריך להיות גדול יותר מהעומק של המנה. השתמש בסכין יפני בסכין גילוח נקי לחיתוך.
2. הפוך קיצוץ נוסף לתוך הספוג כדי להתאים את האלקטרודה ההתייחסות (או לחתוך רדוד לאורך בחלק התחתון של הספוג או פרפר לחתוך אנכי דרך אחד הקצוות הקטנים יותר).
3. השתמש סמן עמיד כימיכדי לסמן נקודה קטנה על ספוג (שבו הזחל יוצב) שיכול לשמש למיצוב המצלמה.
4. משרים את ספוג PVA בפתרון של רינגר עד רווי. הסר ולמחוק במהירות על מגבת נייר 2-3 פעמים. מניחים את הספוג בצלחת פטרי 35 מ"מ נקייה.
5. מקם את צלחת פטרי המכילה את הספוג על פלטפורמת הפלסטיק כך שהסימן יכול להיות דמיין ידי המצלמה.

5. אלקטרודה הכנה

הערה: התקנת דג הזברה מורכבת אלקטרודה התייחסות במגע עם ספוג רינגר-רווי פתרון PVA והאלקטרודה הקלטה במגע עם הקרנית. האלקטרודה ההתייחסות מורכבת מגלולת Ag / AgCl. האלקטרודה ההקלטה היא micropipette זכוכית משך מלא בפתרון של רינגר ומוחזק על ידי בעל microelectrode מכיל חוט Ag.

1. כלוריד אלקטרודות ידי טבילתם ב6-9 hypochlorite נתרן% (אקונומיקה) במשך 5 דקות (MICR ההקלטהחוט oelectrode) או 15 דקות (האלקטרודה ההתייחסות). אוויר יבש על Kimwipe במשך 5 דקות.
   1. בהתאם לסגנון של חתך שנעשה בשלב 4.2, למקם את כדור Ag / AgCl של האלקטרודה ההתייחסות ל( לקיצוץ הפרפר האנכי) או מתחת (לחתך הרדוד לאורך בתחתית) את הספוג. צרף להוביל אלקטרודה התייחסות למערכת ההקלטה.
   2. לחלופין, אם יש לו את התקנת ERG אילוצי שטח או שיש חפצי פוטו חזקים במיוחד מן האלקטרודה Ag / AgCl, לחבר את האלקטרודה ההתייחסות לספוג באמצעות גשר מלח אגר להעביר את האלקטרודה מנתיב האור.
2. צרף ~ 40 סנטימטרים של צינורות בגודל המתאים ל5 מיליליטר מזרק מנעול שאינו Luer. מלא את המזרק עם הפתרון של רינגר. בעלי microelectrode בעל יציאות לחץ בדרך כלל ספינה עם מתאמים כדי להתאים צינורות בקטרים ​​פנימיים של 1/16 ", 3/32", 1/8 "או 5/32".
3. מלא שאינו Luer מזרק 1 מיליליטר מנעול עםהפתרון של רינגר ו, באמצעות מיקרו-fil, למלא בקפידה את בעל microelectrode. למנוע היווצרות של בועות.
4. צרף את מזרק 5 מיליליטר ליציאת הלחץ של בעל microelectrode עם צינורות ולהשתמש בו כדי להבטיח כי בעל microelectrode מלא של הפתרון של רינגר. השימוש במייקרו-fil ומזרק 1 מ"ל מלא הפתרון של רינגר, למלא את כוס micropipette מהקצה ולהבטיח כי אין בועות נמצאות.
5. צרף micropipette הזכוכית לבעל microelectrode, להיות זהיר, כדי לשמור על ישר חוט האלקטרודה. ברגע שהשיג, להשתמש במזרק 5 מיליליטר לכפות זהירות הפתרון של רינגר דרך microelectrode עד כמות זעירה של פתרון נראית לעין בקצה. יישום מזדמן של לחץ למזרק (כאשר לא חל על קרנית) ימנע היווצרות של בועות אוויר, כמו גם חסימות בשל אבק או הצטברות מלח, בקצה micropipette.
   1. אם הפתרון יוצא כזרם, להחליף את gmicropipette ילדה, כפתיחת טיפ גדולה מדי או פגומה.
6. זהירות במקום microelectrode ההקלטה בmicromanipulator ולצרף את יתרון מערכת ההקלטה.

6. ניתוח electroretinogram

הערה: עקב הדומיננטיות חרוט של רשתית הזחל, ניתן להשיג תוצאות ERG באיכות גבוהה כאשר הכנות להקלטה מתבצעות תחת רמות נמוכות של אור לבן עקיף (<סוויטה דה לוקס 1) או לתקופות קצרות (<1 דקות) בעוצמה גבוהה יותר ( ≤250 אור סוויטה דה לוקס) עובד. תקופה קצרה של הסתגלות כהה עדיין נדרשת לפני ההקלטה (ראה שלב 6.7). עם זאת, ניתן לבצע ניסויים באור אדום או באינפרא האדום עמום באמצעות מצלמת אינפרא אדום רגישה. כל הניסויים בוצעו במי מערכת עיקור מסנן (0.22 מיקרומטר) ממתקן UNC דג הזברה חקלאות המים אך יכול לשמש אמצעי תקשורת חלופי עובר.

1. ריבועי נייר מגבת לחתוך מדידה כ 1² סנטימטר.
2. אם מדידת פוטנציאל קולט המוני קונוס מבודד, דגירה 3-5 זחלים במי מערכת עם 500 מיקרומטר (±) -2--4-phosphonobutyric חומצת אמינו (APB) במשך 5 דקות.
   הערה: בעוד APB הוא תערובת של רצמית הפעיל (L) וצורות לא פעילים (R) של AP4, זה יעיל כמו L-AP4 ופחות יקר.
3. הרדימי 3-5 זחלים במי מערכת עם 0.02% (w / v) Tricaine עד, כ 1-2 דקות להגיב.
4. השתמש במשאבת פיפטה ופיפטה פסטר להעביר בזהירות זחלים בודדים על ריבועי נייר מגבת תחת stereoscope לנתח באמצעות תאורה מינימאלית (≤250 סוויטה דה לוקס ל< 1 דקות). בדוק את המיקום של כל זחל ולבחור מועמד שהוא למעלה בצד גב עם עין unoccluded.
   1. להקלטות ארוכות (> 30 דקות), לשמור את הזחל לח על ידי זיגוג הגוף עד, אבל לא כולל את הראש עם methylcellulose 3% בעזרת מברשת משיער הגמל בסדר.
5. בעזרת מלקחיים, להעביר את squar מגבת ניירדואר עם הזחל לספוג PVA הלח.
   1. להקלטות ארוכות (> 30 דקות), יחול זרם רציף של O 100% רוויי מים ₂ גז על הזחל ידי מבעבע הגז דרך airstone בבקבוק בצד זרוע המכיל מים מזוקקים. מקם את צינור יציאה בצד זרוע הבקבוק שמעביר את חמצן humidified ליד ראשו של הזחל.
      הערה: שלב 6.4.1 וצעד 6.5.1 יהיה להאריך את החיים של הדגים ^16.
6. תחת תאורה מינימאלית, להשתמש micromanipulator ומצלמה לעמדת קצה microelectrode בנקודת האמצע בין האף וקצות הזנב של העין ולחץ בעדינות על גבול הגב של הקרנית.
   הערה: מיקום שגוי של קצה האלקטרודה לאזורים הרחוק הדיסטלי של הקרנית יכול לגרום לגל ERG של קוטביות הפוכה.
7. לאפשר זחל אל dark-להסתגל למשך 5-10 דקות.
8. שיא תגובות הבזק מבחן לאור הניתן ממקור אור LED או ממריץ אופטי באמצעות avaiציוד גירוי והקלטת lable. להתאים את הפרמטרים פרוטוקול כגון עוצמת הבזק, אורך הבזק, הבזק צבע, עוצמת רקע והגדרות צבע ומסנן כדי להתאים את הניסוי.
9. כאשר סיימו עם הניסוי, להרדים זחלים על פי הנחיות AVMA / IACUC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

בדרך כלל, ERGs נרשמים מזחלי דג הזברה בשעה 5 DPF, מאז מספר מחקרים שפורסמו הקלטות ERG בשלב זה ^{9, 16,20.} תגובות הזחל נמדדו בתנאים כהים מותאם ללא תאורת רקע באמצעות גירוי msec 20 אור LED הלבן. אנו מנוצלים מערכת זמינה מסחרי בהיקף של ERG ממריץ Ganzfeld אור ובקר / צורב במחשב. ממריץ משתמש אפנו?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

בפרוטוקול זה הליך פשוט להקלטות ERG של דג הזברה זחל מפורט. הליך זה מאפשר לassay מהיר והמקיף של function.There החזותי מספר שלבים קריטיים בכל ההליך שצריך להיות כל הזמן בראש. זחלי דג הזברה צריכים להיות בריאים לפני הניסוי למניעת מוות בטיפולים תרופתיים פוטנציאליים ולהבטיח פרנסה ממוש...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Faraday cage	80/20 Inc	custom	Custom designed aluminum "Industrial Erector Set" for Cage framework
PVA sponge	Amazon	B000ZOWG1C	Provides a soft, moist platform for placement of zebrafish larvae
150 ml Sterile Filter systems	Corning	431154	Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes
Espion E2	Diagnosys, LLC	contact	Modular electrophysiology system capable of generating visual stimuli for any stimulator and digital recording and analysis of responses using propietary software, more information at http://www.diagnosysllc.com
Colordome	Diagnosys, LLC	contact	Light stimulator with RGB LED and Xenon light sources for Ganzfeld ERG, more information at http://www.diagnosysllc.com
Micromanipulator	Drummond	3-000-024-R	Holding and positioning the recording microelectrode
Magnetic ring stand	Drummond	3-000-025-MB	Holding and positioning of the camera and refrence electrode
Lead extensions	Grass Technologies	F-LX	Spare female to male 1.5 mm lead cables for connecting electrodes
Male Pin to Female SAFELEAD Adaptor	Grass Technologies	DF-215/10	Connecting 2 mm pins to 1.5 headboard pins
Window screen frame (metal) and spline	Lowes or Home Depot	various	For attaching copper mesh to Faraday cage framework
Steriflip 50 ml filters	Millipore	SCGP00525	Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes
BNC adaptor	Monoprice	4127	Connecting camera to BNC cable
BNC cable	Monoprice	626	Connecting camera to video adaptor
Camera lens	Navitar	1582232	Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea
Camera coupler	Navitar	1501149	Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea
Luna BNC to VGA + HDMI Converter	Sewell	SW-29297-PRO	BNC to VGA adaptor allowing camera image to project on computer monitor
APB	Sigma	A1910	mGluR6 agonist, blocks b-wave allowing analysis of the isolated cone mass receptor potential
Borosilicate glass	Sutter	BF-150-86-10	Fire- polished borosilicate glass (metling temperature = 821°C) with filament and dimensions of 1.5mm x 0.86 mm (outer diameter by inner diameter)
P97 Flaming/Brown puller	Sutter	P97	For pulling glass micropipettes
Sorbothane sheet	Thorlabs	SB12A	Synthetic viscoelastic urethane polymer, placed under Passive Isolation Mounts and ERG platform to absorb shock and prevent slipping, can be cut to size
Breadboard	Thorlabs	B2436F	Vibration isolation platfrom for ERG stimulator and zebrafish specimen
Passive Isolation Mounts	Thorlabs	PWA074	Provides vibration isolation to breadboard
Copper mesh	TWP	022X022C0150W36T	To line Faraday Cage
Pipette pump	VWR	53502-233	Used with Pasteur pipettes to carefully transfer zebrafish larvae
Pasteur pipettes	VWR	14672-608	Used with Pipette pump to carefully transfer zebrafish larvae
Camera	Watec	WAT-902B	Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea
Tricaine (MS-222)	Western Chemical	Tricaine-S	Pharmaceutical-grade anesthetic,
Micro-fil	WPI	MF28G-5	Filling microelectrode holder and microelectrode glass
Microelectrode holder	WPI	MEH2SW15	Holds glass microelectrode, connects to ERG equipment
Reference Electrode	WPI	DRIREF-5SH	Carefully break off last centimeter of casing to drain electrolyte and expose sintered Ag/AgCl pellet electrode
Reference Electrode (alternative)	WPI	EP1	Alternative to DRIREF-5SH. Ag/AgCl electrode that must be wired/soldered to connecting lead
Low-noise cable for Microelectrode holder	WPI	13620	Connecting recording microelctrode holder to adaptor/headboard