Paw-גרירה: רומן, ניתוח רגיש של מבחן צילינדר העכבר

Summary

ניתוח הסימטריה forelimb הקלאסי של מבחן הגליל משמש באופן שגרתי כדי להעריך גירעונות התנהגות בחולדות הבאים פגיעה מוחית או שבץ; עם זאת, זה לא מצליח לזהות את הגירעונות עקביים בעכברים. מחקר זה מוכיח כי כימות כפת גרירת התנהגות הוא ניתוח רגיש יותר של פגיעה מוחית בעכברים.

Abstract

מבחן הגליל משמש באופן שגרתי כדי לחזות נזק איסכמי מוקד לקליפת המוח המוטורי forelimb במכרסמים. כאשר הניחו בגליל, מכרסמים לחקור על ידי גידול ולגעת בקירות של הגליל בכפות forelimb לתמיכה ביציבה. בעקבות פציעת איסכמי לקליפת המוח הסנסורית forelimb, חולדות להסתמך יותר בכבדות על כפת forelimb המושפעת לתמיכה ביציבה וכתוצאה מכך פחות נגיעות בכפה המושפעת שנקראת סימטריה forelimb. לעומת זאת, נזק איסכמי מוקדי במוח העכבר לא מצליח לגרום לגירעונות עקביים דומים בסימטרית forelimb. בעוד גירעונות הסימטריה forelimb הם נצפו לעתים רחוקות, עכברים אין להפגין התנהגות פוסט שבץ רומן נקרא "כפת גרירת". Paw גרירת היא הנטייה לעכבר כדי לגרור כפתה המושפעת לאורך קיר הצילינדר ולא ישירות מלדחוף את הקיר כאשר פירוק מאחורי לעמדת ארבעה רגליים. אנחנו הוכחנו בעבר שהתנהגות גרירת כפה היא רגישה מאוד לפציעות איסכמי בקליפת המוח קטנות לקליפת המוח המוטורי forelimb. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט לניתוח גרירה-כפה. אנו מגדירים מה היא כפת גרירה ולהדגים כיצד לכמת גרירה-כפת התנהגות. מבחן הגליל הוא בדיקה פשוטה ולא יקרה לניהול ואינו דורש מראש הכשרה או אסטרטגיות מניעת מזון. בשימוש בניתוח גרירה-כפה עם מבחן הגליל, זה ממלא נישה לניבוי פציעות איסכמי קליפת המוח כגון photothrombosis ואנדותלין-1 (ET-1) איסכמיה -induced - שני דגמים שהולכים וגוברים בפופולריות ולייצר פציעות מוקדי קטנות יותר מחסימת עורק המוח אמצעית. לבסוף, מדידת גרירה-כפת התנהגות במבחן הגליל תאפשר מחקרים של החלמה תפקודית לאחר פגיעה בקליפת המוח באמצעות עוקבה רחבה של זני עכבר מהונדסים שבי ניתוח הסימטריה forelimb קודם לא הצליח לזהות את גירעונות עקביים.

Introduction

המטרה של אסטרטגיות התחדשות עצביות היא להדגים שני תיקון רקמות והחלמה תפקודית. התאוששות תפקודית מוערכת בדרך כלל עם בדיקות התנהגותיות המודדות גירעונות תפקודיים, במקרה זה כרוך בכישורים מוטוריים הקשורים לפגיעה באזורים הספציפיים במוח. פגיעה מוחית טראומטית או נזק איסכמי לאזור forelimb הסנסורית של הקליפה ניתן להדגים על ידי מספר הבדיקות התנהגותיות. מבחן אחד כזה, במבחן הגליל נעשה שימוש נרחב בחולדות להעריך גירעונות תפקודיים בפעילות forelimb ^1. יש מבחן עלות הקמה נמוכה הדורשת רק צילינדר, מצלמה ושולחן עם ראש שקוף. זה קל לניהול כפי שהוא מבוסס על התנהגות הגישוש הטבעית של מכרסמים, כך שלפני אימון ומניעת מזון או תגמולים אינם נדרשים. למרות יתרונות רבים אלה, מבחן הגליל מנוצל תחת להעריך גירעונות forelimb בעכברים הבאים פציעות מוקד לים forelimbensorimotor קליפה, שאנו מייחסים לניתוח התנהגות עכבר במבחן הגליל. הסימטריה forelimb היא המדד הקלאסי של ניתוח לבדיקת הצילינדר. כאשר הניחו בגליל, מכרסמים באופן טבעי לחקור את הקירות של הגליל על ידי גידול על הגפיים האחורי שלהם ולגעת בקירות הצילינדר בכפות forelimb לאיזון יציבה. מספר נגיעות כפה עם הקיר אחד עם forelimb הוא לכמת בקלות על ידי צילומי מכרסמים במהלך חקירה זו של הגליל. הסימטריה forelimb מתרחשת כאשר כפת forelimb המושפעת עושה פחות נגיעות בקיר מכפת forelimb מושפעת ומעידה על נזק לקליפת המוח הסנסורית הנגדית. בחולדות, זריקות תוך-המוחיית של סוכן vasoconstrictive, אנדותלין (ET-1), לקליפת המוח הסנסורית forelimb גורם נגע איסכמי מוקדי שתוצאת גירעונות התנהגות בforelimb הנגדי. גירעונות בשימוש forelimb נגדי מזוהים בקלות שינויים בForelimb חוסר סימטריה במבחן הגליל בחולדות ^1-3. בניגוד לחולדות עם זאת, שינויים בסימטרית forelimb משתנים ופחות עקביים בעכברים הבאים זריקות ET-1 דומה ^4-6. כאן אנו מדגימים ניתוח רומן של forelimb התנהגות במבחן הגליל - ניתוח של גרירה-כפת התנהגות. הראינו בעבר כי ניתוח גרירה-כפה הוא מדד רגיש יותר לנזק לקליפת המוח הסנסורית forelimb בעכברים מאשר ניתוח הסימטריה forelimb הקלאסי ולכן חל על מגוון רחב של דגמי פציעת קליפת המוח מוקד.

בדיקה של כמה אנשי הקשר בכפו קיר הצילינדר הבאים נזק איסכמי לקליפת המוח הסנסורית forelimb חשף התנהגות רומן בעכברים - כפה-גרירת ^4. גרירת כפה מתרחשת כאשר עכבר עומד על רגליו האחוריות כדי לחקור את קיר הגליל אז גורר את כפתה המושפעת (קונטרה-lesional) לאורך קיר הגליל לכיוון קו האמצע שלה או את הקיר בזמן שבכפו לא נפגע מספקת תמיכה יציבה על הקיר. Paw-גורר לעתים רחוקות מתרחש בעכברים ללא כל פגע לכן את המראה של כף גרירה הוא אינדיקטור חיובי של פגיעה בקליפת המוח הסנסורית forelimb ^4. יש לנו לכמת בעבר גרירה-כפת התנהגות בעכברים הבאה ET-1 נזק איסכמי לקליפת המוח הסנסורית forelimb והראו שנגרמה התנהגות גרירה-כפה בעכברים עד שבועיים שבץ-פוסט ^4. כאן אנו מראים כי גרירה-כפת ההתנהגות מתמשכת עד שבץ-פוסט ארבעה שבועות. ניתוח של גרירה-כפת התנהגות מספק כלי חדשני ורגיש להערכת נזק איסכמי מוקד לקליפת המוח הסנסורית forelimb בעכברים. ההגדרה שלה זולה, קל ממשל ובקיע להפוך את זה לכלי פשוט, עדיין שימושי כדי להעריך במהירות את גירעונות התנהגות forelimb בעכברים.

Protocol

הצהרת אתיקה: כל הניסויים אושרו על ידי האוניברסיטה ממוריאל של ועדת האתיקה הטיפול בבעלי חיים של ניופאונדלנד בהתאם להנחיות של המועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים.

1. עכברים

1. השתמש עכברים בוגרים. במחקר זה, עכברי FVBN זכר בוגר (n = 10) בין 2-4 חודשים היו בשימוש. עכברי בית בשעה 00:12 להפוך מחזור אור-חושך ולספק אוכל מכרסם סטנדרטי וכרצונך מים.

2. חומרים הדרושים לבדיקת הצילינדר

1. להשיג שולחן עם ראש שקוף לצלם את מבחן הגליל. הממדים של השולחן הם לא רלוונטיים, העליון חייב להיות פרספקס או זכוכית, ושחייב להיות מספיק מקום כדי למקם מראה מתחת לשולחן. זה מאפשר לעכבר להיות צילם מלמטה. השתמש במראה מתחת לשולחן כדי לשקף את התמונה דרך הגליל. כחלופה, להשתמש מצלמה הפוכה, אם זמין. הממדים של שולחן שימוש בפרוטוקול זה הם 54 x 56 x 66.5cm (wxlxh) עם 51 x 51cm העליון (wxl).
2. להשיג מראה. הממדים של מראה שימוש בפרוטוקול זה הם 34 x 58cm (wxl).
3. להשיג צילינדר שקוף / פרספקס לעכבר כדי לבצע ב. הממדים של הגליל בשימוש בפרוטוקול זה הם 17.5cm גבוה, 8.8cm זיהוי, 9.5cm OD עם עובי דופן של 0.35cm. גליל גבוה עשוי להידרש לזני עכבר פעילים יותר.
4. מניחים את הגליל על השולחן ולצלם את ההשתקפות במראה להלן.
5. מצלמת וידיאו וחצובה נדרשים. להקליט קטעי וידאו בכ 650Kb / s, שכ הוא 190MB לכל 5 דקות של וידאו גליל. ודא שיש לו את המצלמה פונקציונלי זום על מנת להבטיח שהגליל מקיף את כל שדה הראייה.
   הערה: מצלמת וידיאו שימוש בפרוטוקול זה הוא Sony DCR-SR42, זום אופטי 40X, זום דיגיטלי 2,000x, 680kpix אשר משתמש הגדרה סטנדרטית, interlaced וידאו NTSC).
6. להשיג תוכנה לניתוח - pl תקשורתAyer עם תמיכת וידאו ואפנון מהירות השמעה. נגן המדיה שימוש בפרוטוקול זה הוא v2.1.2 VLC Media Player.
7. להשיג מחשב עם מערכת הפעלה מסוגלת להריץ את נגן המדיה וצג.
8. אחסון אלקטרוני עבור קטעי וידאו נדרש. להוריד קטעי וידאו לדיסק קשיח חיצוני או להעתיק אותו על גבי תקליטורי DVD לאחסון לטווח ארוך.
   הערה: ב190MB לוידאו, 84 מפגשים יתאימו על כרטיס SD GB 16 ו -168 מפגשים יתאימו על כרטיס SD 32GB. בשל inexpensiveness היחסי של תקשורת SD, וחוסר הוודאות בכמה זמן כמה עכברים דורשים כדי להשלים 20 אחוריים, כרטיס 32 GB מומלץ. במחקר הנוכחי, קטעי הווידאו הועתקו מהמצלמה לדיסק קשיח חיצוני 2TB ולאחר מכן recopied על תקליטורי DVD כגיבוי.

3. התקנה ניסיונית של מבחן הצילינדר

1. להדק מראה מתחת לשולחן בזווית של 45 מעלות לשולחן. האם שני סוגריים תמיכה זו באמצעות מצורף לרגלי השולחן לSupport העליון ותחתון של המראה, בהתאמה. מקומות הסוגר מצוינים בצד וצפה בטבלה (איור 1 א) ונוף פנים על השולחן (איור 1).
2. מניחים גליל במרכז השולחן. לצייר ארבעה קווים במרחק שווה הגליל שבי יושב על השולחן עם טוש שחור (נוכל), כך שהגליל יכול להיות הרים וחזר לאותו המצב (איור 2). ציורם בחלק התחתון של השולחן השקוף מאפשר השולחן לנקות בין ניסויים בבעלי החיים ללא המסת דיו הסמן.
3. צרף את המצלמה וחצובה. לכוון את המצלמה במראה, כך שהתמונה היא מחפשת ישירות דרך הקנה של הגליל. ודא שהקיר הפנימי המלא של הגליל הוא גלוי וללא הפרעה על ידי הבסיס (איור 3). ראה מבט מצד על של ההתקנה, כולל הזווית היחסית של התקנת המצלמה ומראה, מלמעלה (איור 4 א) ומרמה של השולחן, כולל גידול עכבר (איור 4).
4. הכן כרטיסי רמיזה לזהות כל עכבר לפני צילומים. ודא שהכרטיסים כוללים בדרך כלל מספר זיהוי לכל עכבר, נקודת הזמן של הבדיקה (לדוגמא., 3 ימים לאחר טיפול) ומועד פגישת צילומים. אינו כולל את קבוצת הטיפול בכרטיס האות כדי להבטיח את הניסוי הוא עיוור.
5. סרט בתנאי תאורה פנימיים סטנדרטיים כמו זה ברמה של אור נדרש כדי לראות את תנועות העכבר סביב הגליל בבירור.
   הערה: אם זמין מצלם בחושך עם מצלמה אור אדומה עשויים להספיק, אולם אחד היה קודם צריך לבדוק אם נגיעות כפה וגורר נראות בבירור לכימות.

4. ביצוע

1. להתחיל לצלם. הצג את כרטיס אות העכבר המתאים מול עדשת מצלמה.
2. מנמיכים את העכבר לתוך הצילינדר מלמעלה הפתוחים מייד לאחר שצילם את כרטיס האות.
3. תתחיל לצלם את העכבר. למזער את הרעש בתקופה זו, כמו עכברים עלולים לאבד עניין בחקר אם נבהל.
4. שים לב לחלק אחורי העכברים לחקור את הגליל. ללכוד את הווידאו עד העכבר מבצע מינימום של אחוריים עשרים.
   הערה: אחורית מתרחשת כאשר שני כפות רגליו קדמיות מאבדות מגע עם הרצפה והעכבר עומד על רגליו האחוריות.
5. נגב שולחן וגליל עם תמיסת ניקוי מתאימה בין כל עכבר כדי לטהר ולהסיר ריחות עכבר.
6. הקפאה היא כאשר עכברים להפסיק לחקור ולהישאר בשקט יושבים על ארבע לכ 5 דקות. אם עכברים להקפיא לפני אחוריים עשרים להתרחש, זה עשוי להיות נחוץ כדי להסיר אותם מהגליל 10-20 דקות לפני חידוש המבחן. אם עכברים לא לבצע אחוריים עשרים, הם יוסרו מן המחקר.
   הערה: מניסיוננו, עכברים לא צריכה להיות נכללו עקב אי לחקור את הגליל.

5. הערכת מבחן הצילינדר באמצעות Paw גרירהניתוח

1. לנגן את הווידאו בקצב של בין 0.25x ו0.67x מהירות קבועה תלוי כמה מהר את העכבר בוחן את הגליל. להשתמש בנגן מדיה שמציע מהירויות השמעה איטיות יותר.
2. לכמת את המספר הכולל של נגיעות כפה. נגיעות כפה להתרחש כאשר אחורי העכבר (איור 5 א), נוגעים בצד של הגליל (איור 5), לאחר מכן יורדת מסוס עם שני כפות בו זמנית (איור 5 ג) ואדמות (איור 5D). הכפה יכולה או לא יכולה לפנות לקיר הגליל עם כף מלאה, אבל קשר כלשהו עם קיר הגליל חייב להתרחש. להעריך נגיעות כפה על ידי ספירת מספר הפעמים שהעכבר יוצר קשר (לא משנה כמה קצר) עם קיר הגליל עם אחת או את שני כפות רגליו קדמיות עת שעמד על הרגליים האחוריות שלה במהלך אחורי.
   שים לב שקשר עם קיר הגליל נספר רק כ" מגע כפה "או" כפת גרירה "אם העכבר נמצא בעמדה אחורית - מעמדעל הגפיים האחורי שלה עם שני כפות רגליו קדמיות מעל השולחן. אם העכבר נשאר בעמדת 3 נקודות - שני גפיים אחוריות וכף אחת על השולחן וממשיך לגעת בקיר עם הכפה החופשית - זה לא נחשב כמגע כף. עכברים עשויים אחוריים ולגעת בקיר הגליל עם כף אחת וזה נחשב כמגע כף. הערה: עכבר עשוי גם להזיז את הגוף שלה ברחבי הגליל במהלך אחורי, עושה יותר משני אנשי קשר. מגעים אלה נספרים - אחד לכל מגע בכפו שמאלי ואחד לכל מגע בכפו ימני.
3. לכמת את מספר כפה-שאיפות. התנהגות גרירת כפה שונה מנגיעות כפה נורמליות.
   1. אם אנשי קשר כפת קיר הגליל עם כף יד פתוחה מלאה (איור 6), היא תיפול לאט מהקיר, לעתים קרובות עם רעד קל. התנועה מתחילה בספרות גרירה על קיר הגליל או בכיוון המדיאלי או כלפי מטה, (איור 6 ג) לפני שנפלתי משם completאיליי (איור 6 ד). אז העכבר יהיה לרדת עם הכפה המושפעת (איור 6-ה) לפני שנחת על ארבע (איור 6F). זה נחשב כפת גרירה וצריך לספור במניין.
   2. אם הכפה לא לפנות לקיר הגליל עם כף יד פתוחה באופן מלא, זה יהיה לרעות קיר הגליל עם הספרות שלה לפני שנפל מקיר הגליל. באופן דומה, עכבר עשוי לגרור כפתה כנגד קיר הגליל אך לא לשחרר אותו לחלוטין לפני פירוק. אלה שני נחשבים כפה-גוררת כמו גם נגיעות וצריכה להיחשב כשני במספר נקודות.
   3. הכפה עלולה גם לגרור לאורך קיר הגליל תוך עכבר בוחן את הגליל. במקרה זה, הכפה תעקוב הפיתול של פלג הגוף העליון של העכבר כפי שהוא בוחן שמאלי או ימני של העמדה המקורית שלו (איור 7 א-ד) לפני פירוק (איור 7E). זו אינה נחשבת כפת גרירה, כפי שהוא תלוי בעכבר באופן אקראי בחירהכיוון לחקור ואינו תלוי שבחצי כדור קליפת המוח נפגע.
4. Paw-שאיפות באות לידי ביטוי כאחוז מכפה-גורר למספר כולל של נגיעות כפה במהלך. הגעה מספר כפה-שאיפות כאחוז מאנשי קשר כפה כוללת עבור כל forelimb בנפרד.
5. נגיעות וכתוצאה מכך כף גרירה לספור ככפת גרירה ומגע בו זמנית. לכן, אם עכבר גורר הכפה בכל פעם שהאנשים הקשר שלו כפת קיר הגליל, אחוז גרירה-הכפה מבוטא 100%.

6. הצעות ניסויי עיצוב נוסף

1. כדי למזער את המשתנים חיצוניים:
   1. בדוק את העכברים באותו הזמן בכל יום בדיקה. בדוק את העכברים במהלך המחזור בעקבותיהם. שמירה על עכברים במחזור הפוך אור 12 שעות מאפשרת ביצועים.
   2. עכברים יכולים להיות מסרבים לחקור את הגליל אם הדגיש גם על ידי רעש או סביבת רומן. בדיקת עכברים בחדר שלהם בבעלי החיים החזקות או חדר הם been להכיר עם מפחית את הלחץ. זה יכול להתרחש אם החדר רועש, אם העכבר כבר נדחק לפני כניסת הצילינדר או בשל התרגלות.
      הערה: בדיקה צריכה להתבצע פעם אחת לפני מניפולציה ניסויית לשמש כקריאה בסיסית. לאחר מניפולציה, ימי בדיקה הם בשיקול דעתו של הנסיין, למרות שזה מומלץ להימנע ממספר מופרז של חשיפות לגליל על פני תקופה קצרה של זמן.
   3. עכברים עלולים להיות ששים אחורי אחרי 6-7 חשיפות לגליל. לצורך המחקר הנוכחי, עכברים נבדקו בגליל עבור הסכום כולל של שבע פעמים, לפני איסכמיה ובימים 1, 3, 7, 14, 21 ו -28 לאחר ניתוח.
      הערה: במחקר זה השתמשנו בזן FVBN העכבר. בדקנו בעבר C57Bl / 6 עכברים בגליל ונצפתה התנהגות גרירה-כפה הבאה פציעת איסכמי ET-1 (מידע לא מוצג). עכברי C57BL / 6 היו פעילים יותר מעכברי FVBN כאשר גידול ולעתים קרובות קפצו על החישוק של הגליללפני הטיפוס החוצה. יש להשתמש בגלילים גבוהים אם עכברים מנסים להימלט בקפיצה.

7. מדידות נפח אנדותלין -1 ניתוח והאוטם

1. לבצע ניתוח אנדותלין -1 ומדידות נפח אוטם על פי פרוטוקולים שפורסמו בעבר ^4. כדי למקד את הקורטקס המוטורי forelimb הקדמי, כל עכבר צריך לקבל שלוש ET-1 זריקות בקואורדינטות הבאות: 0.7 (i) anteriorposterior (AP) /1.5 המדיאלי-צדדיים (מיליליטר) / - 1.2 הגבי-הגחון (DV), ( ii) 0.4 AP / 1.25 מיליליטר / - 1.2 DV וכן (iii) 0.1 AP / 1.75 מיליליטר / -1.2 DV ^4.

8. ניתוח סטטיסטי

1. ניתוח מדידות חוזרים דו-כיוונית של שונות (ANOVA) מומלץ לנתח אחוזים לכפות המושפעות ותושפענה על פני נקודות זמן שונות גרירה-כפה.

תוצאות

אנחנו הוכחנו בעבר כי התנהגות גרירה-כפה מופיעה הבאה פציעת איסכמי מוקד לקליפת המוח הסנסורית forelimb והוא אינדיקטור חיובי של נזק ^4. זריקות תוך-המוחיית של ET-1 לקליפת המוח הסנסורית forelimb שמשו כדי לגרום לפגיעת איסכמית (איור 8 א ', ב'). מחקר זה בדק האם גרירה-כפת ה?...

Discussion

נקודות מפתח להקמה כאשר כימות גרירה-כפת התנהגות במבחן הגליל שעוקבים: i) לכמת את מספר הכפה-גורר לעומת נגיעות כפה כוללת עבור כל כפה לפני פגיעה מוחית להקים בסיס; ii) לכמת את מספר כפה-שאיפות לעומת נגיעות כפה כוללת עבור כל כפה הבאה פציעת איסכמי; וiii) להפלות בין כפת גרירה והתנוע?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plexi-glass cylinder			17.5 cm high, 9.5 cm outer diameter, 8.8 cm inner diameter, wall thickness 0.35 cm (or 3.5 mm)
viewing table			54x56x66.5 cm (width x length x height), top of table is a 51x51 cm sheet of plexiglass.
mirror			34x58 cm mirror
video camera	Sony	DCR-SR42	Video camera with onboard storage, SD functionality, 40x optical zoom
computer	Dell	Optiplex 760	Processor: Intel, 3.0 GHz, Memory 4.00GB (RAM)
computer monitor	Samsung	S22C350H
Excel (Microsoft Office Professional Plus)	Microsoft	v14.0.7106.5003
VLC Media Player	Video LAN	v2.1.2	Media player with playback speed modulation and video support
External Hard Drive	Western Digital	WDBAAU0020HBK-01	2 TB