הערכת היעילות של<em&gt; H. פילורי</em&gt; חלבון HP-NAP ככלי טיפולי לטיפול בסרטן שלפוחית ​​השתן בדגם Murine Orthotopic

Summary

Here the method to establish a syngeneic mouse model of orthotopic bladder tumour to evaluate the anti-tumour efficacy of the bacterial protein HP-NAP is described.

Abstract

Bladder cancer is one of the most common malignancies of the urogenital tract. Intravesical injection of Bacillus Calmette-Guérin (BCG) is the gold standard treatment for the high-grade non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC). However, since the treatment-related side effects are relevant, newer biological response modifiers with a better benefit/side effects ratio are needed.

The tumour microenvironment can influence both tumour development and therapy efficacy. In order to obtain a good model, it is desirable to implant tumour cells in the organ from which the cancer originates.

In this protocol, we describe a method for establishing a tumour in the bladder cavity of female mice and subsequent delivery of therapeutic agents; the latter are exemplified by our use of Helicobacter pylori neutrophil activating protein (HP-NAP). A preliminary chemical burn of the mucosa, followed by the injection of mouse urothelial carcinoma cell line MB49 via urethral catheterization, enables the cells to attach to the bladder mucosa. After a period, required to allow an initial proliferation of the cells, mice are treated with HP-NAP, administrated again via catheterization. The anti-tumour activity of HP-NAP is evaluated comparing the tumour volume, the extent of necrosis and the degree of vascularization between vehicle- and HP-NAP-treated animals.

Introduction

סרטן שלפוחית ​​השתן הוא אחד מסוגי הסרטן הנפוצים ביותר במערכת ואברי המין, עם כמעט 75,000 מקרים חדשים בכל שנה בארה"ב ^1. שיעור גבוה של הישנות דורש מעקב לכל החיים, מה שהופך את סרטן שלפוחית ​​השתן אחד מסוגי הסרטן היקרים ביותר לטיפול. הטיפול הסטנדרטי הזהב לדרגה הגבוהה NMIBC הוא כריתת טרנס-שופכה, ואחריו טיפול חיסוני שלפוחית ​​עם BCG. למרות שהמנגנון המדויק של הפעילות אנטי-הסרטני של BCG נותר הובהר במלואו, הוא קיבל את זה ההפעלה של תגובה חיסונית של תאים מועשרים בעוזר T (Th) 1 ורעיל לתאי T (TC) 1 תאים חיונית ל ההצלחה של הטיפול ^2.

למרות העובדה כי BCG נשאר טיפול הבחירה בNMIBC, שיעור גבוה של חולים אינם מגיב לטיפול; יתר על כן, זה יכול לגרום למספר תופעות לוואי: כ -70% מגידולים שטופלו יחזרו אחרי כמה זמן ו~ התקדמות 15% לטופס השריר פולשנית שלמחלה. תופעות לוואי אחרים הקשורים לטיפול BCG כוללים dysuria, דלקת שלפוחית ​​השתן ודלקת כליות ^3-6.

פיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשניות חייב לקחת בחשבון את השימוש במודלים פרה-קליניים, הבא במבחנה הערכה ראשונית; זה רלוונטי במיוחד בגידולי מייקרו-סביבה שיכול להשפיע באופן משמעותי לפיתוח והיענותם לטיפול.

בעשור האחרון, יש לנו לטפל בהיבטים שונים של פעילות הוויסות החיסונית של HP-NAP, חלבון היוצר על ידי החיידק הליקובקטר פילורי, בתחילה זוהה כמסוגל לקדם הידבקות האנדותל של תאי polymorphonuclear (PMNs) ^7. מבחינה מבנית, HP-NAP שייך לחלבון הגנה-DNA בתנאים מורעבים משפחה (DPS) ⁸ וכולל 12 יחידות משנה זהות מסודרות בקליפת dodecameric.

אנחנו הוכחנו כי HP-NAP הואקולט-כמו אגרה (TLR) 2 אגוניסט, עם פעילות ויסות-חיסונית חזקה אחראית לנהיגת הבידול של T לימפוציטים כלפי פנוטיפ Th1, הן במבחנה in vivo ^9-10. בכוחה של פעילות זו, HP-NAP יכול להפנות את התגובה החיסונית Th2 לתגובת Th1 מועיל יותר במודל עכברי של אסתמה אלרגית ^11.

כדי להעריך את הפוטנציאל אנטי-הסרטני Th1 תלוי של HP-NAP, נצלנו מודל עכבר של סרטן שלפוחית ​​השתן שפותח לפני מספר שנים על ידי O'Donnel ועמיתים ¹² להערכת ההשפעה של ממשל BCG.

עם פרוטוקול זה, אנו מראים כי HP-NAP יש פוטנציאל אנטי-סרטני חזק נגד סרטן שלפוחית ​​השתן ושהיעילות של ממשל HP-NAP מקביל להצטברות המשמעותית, בתוך בלוטות הלימפה אזורית וגידול, של שני לימפוציטים מסוג Th1 וTc1 ייצור אינטרפרון ( IFN) -γ ¹³ . גידולים מבודדים מעכברים שטופלו-HP-NAP הראו יותר נמק ופחות כלי דם מאשר עמיתו שלא טופל.

הדו"ח הנוכחי מספק פרוטוקול stepbystep, המפרט את ההכנה של בעלי החיים, צנתור שופכתם, השריפה הכימית הנדרשת לחיבור של תאי רירית שלפוחית ​​השתן, וההזרקה של התאים הסרטניים. אנו גם מתארים את הממשל המקומי של HP-NAP שיכול להיחשב כאב טיפוס של כל סוכנים טיפוליים שפותחו לטיפול בסרטן שלפוחית ​​השתן. הראיות שהושגו על ידי השוואת גידולים מבודדים משליטה וHP-טופל NAP בעלי החיים מדגישה לא רק את העובדה שHP-NAP יכול להיות מועמד טוב לטיפול חיסוני בסרטן שלפוחית ​​השתן, אלא גם את היעילות הכללית של הניסוי להגדיר.

Protocol

כל הנהלים לטיפול בבעלי חיים אושרו על ידי משרד בריאות האיטלקי (DM 204/2011-B).

1. בעלי חיים

1. לגדול נקבות עכברי C57BL6 / י עד 8 שבועות של גיל בכלובים מאווררים בנפרד עם מסנני microisolation.
   הערה: נקבות הם העדיפו כי קונפורמציה האנטומי של מנגנון uro באיברי המין החיצוני שלהם הופכת את הצנתור קל יותר מאשר בגברים.

תרבות 2. תא

1. לשמור על קו urothelial עכבר תא קרצינומה MB49 במדיום RPMI 1,640 בתוספת 10% בסרום שור עוברי חום מומת ו -50 מיקרוגרם / מיליליטר גנטמיצין על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO ₂ humidified.
2. לגדל תאי MB49 בT-75 צלוחיות למפגש 80%. Trypsinize וגלול ברמה של 0.5 × 10 ^5-0.5 × 10 ⁶ תאים לכל 150 μl של PBS לפני ההשתלה בעכברים.

3. השלפוחית ​​Tumour שתל

1. הרדימי עכברים באמצעות שילוב של zoletil ההרדמה וxylor (33 מ"ג / קילוגרם ו -20 מ"ג / קילוגרם, בהתאמה), הזריק intraperitoneally.
2. הנח בעלי חיים במצב שכיבה ולתקן את הרגליים האחוריות למשטח עם נייר דבק. כפות יש להפריד מספיק כדי להבהיר meatus השופכה גם הגלוי ונגיש להחדרת הצנתר.
3. הערה: הצנתור, צנתר ורידי ילדים 24 G מתאים לעכברים 8 עד 10 שבועות-ישנים. הבחירה של צנתר היא מאוד חשובה כדי למנוע דליפה של נוזל בין קיר השופכה וקטטר. צנתרים שעם גדולים יותר יש להשתמש לעכברים גדולים יותר או מבוגרים יותר.
4. באמצעות זאטוט קטן, לצבוט קצה אחד של חלק החיצוני של שופכה ולסובב אותו בעדינות רבה לכיוון "סוף הראש" של העכברים. פעולה זו חושפת את meatus השופכה.
5. הסר את המחט הפנימית של הצנתר והכנס את האחרון בשופכה בזווית של 45 מעלות, מעט אוריינטציהלקראת "הזנב" של העכברים. אל תכריח את הכניסה של צנתר; במקרה של התנגדות, פשוט לסובב את הקטטר מאוד בעדינות, עד שהוא מחליק בתוך השופכה. כאשר על 0.5-0.8 סנטימטר של הצנתר הוא בשופכה, בזהירות במקום מקביל קטטר לזנב של העכברים והכניסו אותו לחלוטין.
6. באמצעות מזרק 1 מיליליטר, המחט שיש להיות מוכנסים בקטטר, לשטוף את שלפוחית ​​שתן משייר על ידי הזרקת 200-300 μl של PBS סטרילי ולשאוב את כל הנוזל משלפוחית ​​השתן.
7. הערה: כאשר הזרקת PBS, השלפוחית ​​תתמלא ונפיחות תהיה גלויה בין הרגליים האחוריות של העכברים; זה מאשר כי הצנתור הוא נכון. רוב הצנתרים נפח מת שיש לקחת בחשבון בעת ​​חישוב נפח ההזרקה.
8. באמצעות מזרק 1 מיליליטר סטרילי, להזריק 200 μl של 0.1 N HCl. מלא את השלפוחית ​​כדי לשרוף כל הקיר שלה. לאחר 10 שניות, להסיר את כל החומצה ומייד neutralize ידי הזרקת 200 μl של 0.1 N NaOH עם מזרק סטרילי. במקרה של הזרקה של המספר הגבוה ביותר של תאים (0.5 × 10 ^6), לא נדרש צעד החמצה.
9. כל הנוזל שיורית לשאוב ומייד לשטוף את החלל עם 300 μl של PBS סטרילי.
10. רוקן את שלפוחית ​​השתן על ידי שאיפה, ולהזריק 150 μl של PBS המכיל תאי MB49 (טווח 0.5 × 10 ^5-0.5 × 10 ⁶⁾ לשלפוחית ​​השתן. השאר את המזרק התאסף לקטטר כדי למנוע הדליפה של תאים. עדיף להבטיח את המזרק על ידי תיקון אותו למשטח עם נייר דבק.
11. אחרי שעה 1, בעדינות לחלץ את הקטטר מהשופכה, ולמקם את העכברים בכלוב, תחת מנורת ליבון עד שהם מתעוררים: זה קורה בדרך כלל בין 1 ל 2 שעות לאחר תום הטיפול.

4. משלוח שלפוחית ​​של HP-NAP

1. הערה: לפחות 3 ימים לאחר החדרת תא, אפשר להתחילטיפול.
2. קטטר כמתואר בצעדים 3.1-3.4. בשלב זה, אין צורך לשרוף את קיר שלפוחית ​​השתן עם HCl.
3. באמצעות מזרק 1 מיליליטר, לשטוף את שלפוחית ​​שתן משייר על ידי הזרקת 200-300 μl של PBS סטרילי ולשאוב את כל הנוזל משלפוחית ​​השתן.
4. הזרק 50 מיקרוגרם של HP-NAP לμl 150 PBS לתוך שלפוחית ​​השתן. השאר את המזרק המצורף לקטטר כדי למנוע דליפה של פתרון החלבון. אבטח את המזרק על ידי תיקון אותו למשטח עם נייר דבק.
5. אחרי שעה 1, בעדינות לחלץ את הקטטר מהשופכה ולמקם את העכברים בכלוב, תחת מנורת ליבון, עד שהם מתעוררים.

5. Tumour Explants וניתוח היסטולוגית

1. בסופו של הטיפול, להקריב בעלי החיים, למקם אותם בעמדות שכיבה ולתקן את הרגליים האחוריות למשטח עם נייר דבק.
2. באמצעות אזמל כירורגי, לעשות חתך אנכי ארוך על 1.52 סנטימטר דרך העור והצפק, מתחיל בדיוק מעל איברי מין חיצוניים ל" סוף הראש "של העכברים. כדי למזער את הסיכון של פגיעה בשלפוחית ​​השתן, להקדיש תשומת לב מיוחדת לעומק של החתך.
3. שלפוחית ​​השתן ימוקם במרכז-השמאל של הקיצוץ והגידול יהיה גלוי כגוש ורוד / סגול כהה. על כריתתו, למקם את כל שלפוחית ​​השתן בכלוב היסטולוגית ולתקן ב 10% פורמלין שנאגרו לפני ההטבעה בפרפין.
4. להיסטולוגית וניתוח histochemical חיסוני, להכין חלקים סידוריים של שלפוחית ​​השתן (46 עובי מיקרומטר) באמצעות microtome סטנדרטי.
5. להכתים את החלקים עם haematoxylin / eosin ולהמשיך בחישוב של גודל גידול (D XD ²⁾ וקביעת אחוז הנמק לשטח חתך באמצעות נתח תמונה בעזרת מחשב.
6. לספירת כלי, להמשיך על ידי צביעת החלקים לCD31 סמן אנדותל / PECAM, תוך שימוש בטכניקת פרוקסידאז סטנדרטית. סרוק את הסעיפיםt חשמל נמוך (4 ×) כדי לזהות את האזור של צפיפות כלי דם הגבוהה ביותר. בתוך אזור זה, לספור microvessels בודדת בחמישה תחומים נפרדים אקראיים בהספק גבוה (20 ×).

תוצאות

איור 1 מציג את טכניקת הצנתור; עכבר צינתור והחדיר עם 0.5 × 10 ⁶ תאים MB49. טיפול עם HP-NAP הוא התחיל 3 ימים לאחר ההזרקה של תאים סרטניים, כדי לאפשר להם לצרף אל קיר שלפוחית ​​השתן ולהתרבות. כל בעלי החיים המשתייכים לקבוצת השליטה לפתח הגידול; חלק מהם עלול למות לפני תום...

Discussion

רוב ההתקדמות בטיפול בסרטן דורשים בדיקות במודלים של בעלי חיים לפני שמתחיל ניסויים קליניים. האפשרות ללמוד ביולוגיה גידול in vivo, מנצל מודלים של בעלי חיים, מהווה כלי חיוני לחוקרים חוקרים פתוגנזה של הסרטן, המאפשרים ההערכה של גישות טיפוליות שונות. דגמי orthotopic יישארו סט?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
C57BL/6J female mice	Harlan Italy (Udine, Italy)
MB49 Cells			Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA
RPMI	Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)	R8758
FBS	Sigma-Aldrich	F7524
PBS	Sigma-Aldrich	D1408	10X, to be diluted in apyrogenic water
Flask	Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA)	353135
Syringe 1ml	Becton Dickinson	301358
Trypsin	Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA)
Gentamycin	Life Technologies	15710-049
Xilor	Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy)		2% Xylazin
Zoletil	Virbac (Carros, France)	359713301992	5% Zolazepam + 5% Tiletamine
24G Catheter	Terumo (Rome, Italy)	SR+DM2419PX
HCl	Carlo Erba Reagents (Milano, Italy)	403871	Liquid
NaOH	JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA)	10095011	Powder
Equipment
Surgical Scalpel	Albion Surgical Limited (Sheffield, England)
Microtome	Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany)	RM2235
Microscope Slides	VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA)	631-0108
Image Analyzer	Zeiss (Jena, Germany)	Cyres System