באתרו איתור של חיידקים בתוך רקמות מוטבעות-פרפין באמצעות DNA בדיקה שכותרת Digoxin מיקוד 16S rRNA

Summary

Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled 16S rRNA-targeting DNA probes has been described. This protocol can be applied to study the role of bacteria in various diseases such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

Abstract

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been reported using various methods, including electron microscopy, immunohistochemistry or immunofluorescence using bacteria-specific antibodies, and fluorescent in situ hybridization (FISH) using a fluorescence-labeled oligonucleotide probe. Nevertheless, these methods are not widely used due to technical limitation or difficulties. Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled DNA probes has been introduced. The paraffin-embedded tissues are the most common form of biopsy tissues available from pathology banks. Bacteria can be detected either in a species-specific or universal manner. Bacterial signals are detected as either discrete forms (coccus, rod, fusiform, and hairy form) of bacteria or dispersed forms. The technique allows other histological information to be obtained: the epithelia, connective tissue, inflammatory infiltrates, and blood vessels are well distinguished. This method can be used to study the role of bacteria in various diseases, such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

Introduction

חיידקים לשחק תפקיד באטיולוגיה של מחלות פה שונות כגון חניכיים, דַלֶקֶת הַמוֹך, pericoronitis, צלוליטיס, ודלקת עצם. על מנת להבין את תפקידם של חיידקים בפתוגנזה של מחלה ולעקוב אחר ההשפעה של טיפולים, לוקליזציה של חיידקים בתוך הרקמה חשובה. הנוכחות של חיידקים בתוך רקמת חניכיים מחולים עם מחלת חניכיים הוכחה בשיטות שונות, כולל מיקרוסקופ אלקטרונים ^1,2, אימונוהיסטוכימיה וimmunofluorescence באמצעות חיידקים ספציפיים נוגדנים ^3-7, וניאון הכלאה באתר (דגים) ⁸ באמצעות fluorescence- הבדיקה oligonucleotide שכותרתו מיקוד rRNA 16S. עם זאת, שיטות אלה אינן בשימוש נרחב בשל מגבלה או קשיים טכניים. לעומת נוגדנים, בדיקות מיקוד rRNA 16S קלות לייצר ולהשיג מינים-סגוליות. FISH הוכיח להיות כלי מצוין להדמיה של התרהeria בסביבתם הטבעית כגון biofilm שלט. עם זאת, יישום של דגים לדגימות רקמה מוגבל בשל autofluorescence של רכיבי רקמות שונים. לדוגמא, autofluorescence החזק של תאי דם אדומים לעתים קרובות מעכב את היישום של טכנולוגית הקרינה לרקמות מודלקות כשהם כרוכים בדימום ^9.

כדי למקם חיידקים בתוך רקמות החניכיים המודלקות, ולכן, באתר שיטת הכלאה באמצעות digoxigenin (DIG) הבדיקה DNA -labeled פותחה ומיושמת בהצלחה ^10,11. כאן פרוטוקול מפורט ללוקליזציה של חיידקים בתוך רקמות מוטבעים פרפין באמצעות פ בדיקות eubacterial -specific והאוניברסליות gingivalis תוארו. הוא התמקד בעיקר בסטנדרטיזציה של השיטה כדי שניתן תהיה לשכפל תוצאות דומות במעבדות אחרות. פרוטוקול זה מאפשר לוקליזציה של חיידקים בתוך ההקשר היסטולוגית שלהם וresuLTS הם מאוד לשחזור. הפרוטוקול המתואר ניתן להשתמש כדי למקם חיידקים או באופן מינים ספציפיים או אוניוורסלי ברקמות שונות. הבדיקה האוניברסלית שימושית במיוחד כדי לזהות חיידקים במחלות polymicrobial וללמוד את תפקיד פוטנציאלי של חיידקים במחלות שבי התפקיד של חיידקים מסוימים אינו ידוע.

Protocol

1. בדיקה הכנה

1. ההגברה PCR של החללית
   1. לפ הבדיקה -specific gingivalis, להגביר קטע DNA 343-נ"ב של פ rRNA 16S gingivalis על ידי PCR באמצעות הדנ"א הגנומי של פ gingivalis ופריימרים הבאים: 5'- TGC AAC TTG CCT TAC AGA GG-3 'ו5'- ACT CGT ATC GCC CGT TAT TC-3' ^10. בצע amplifications עם תנאי המחזור הבאים: 35 מחזורים ב 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ו -72 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות 20 שניות אחרי ארכה 5 דקות ב 72 מעלות צלזיוס ^10,11.
   2. להגביר את הבדיקה eubacterial באמצעות 70-נ"ב קטע DNA (5'-CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAG
      TCCCGCAACGAGCGCAACCC-3 ') מסונתזים כoligonucleotide ופריימרים הבאים: 5'-CAG GTR CTG CMT GGY-3' ו5'-AGG GTT GCG CTC ¹¹ 'GTT-3. בצע amplifications עם תנאי המחזור הבאים: 40 מחזוריםבשעה 9 4 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו 72 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות 20 שניות אחרי ארכה 5 דקות ב 72 מעלות צלזיוס ^11,12.
   3. לזרז את מוצרי ה- PCR (≥500 μl) על ידי הוספת 3 נתרן אצטט M (pH 5.2) ואתנול 100% (ב- 10: 1: 2 יחס) ודוגרים ב -20 ° C לשעה 2.
   4. צנטריפוגה את התערובת על 14,000 XG במשך 15 דקות, resuspend גלולה במאגר TE 100 של μl, ולמדוד את ריכוז ה- DNA על ידי צפיפות אופטית ב 260 ננומטר.
2. DIG-תיוג באמצעות ערכת תיוג וזיהוי DIG DNA
   1. לערבב 3 מיקרוגרם של הבדיקה עם מים לנפח סופי של 15 μl.
   2. לפגל את ה- DNA על 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולצנן במהירות על קרח.
   3. הוסף 2 μl של 10x תערובת hexanucleotide, 2 μl של תמהיל dNTP תיוג, וμl 1 של אנזים Klenow 15 μl של ה- DNA מפוגל.
   4. לערבב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות עד 48 שעות ולעצור תגובה על ידי חימום על 65 מעלות צלזיוס.
3. בדוק את הרגישות של הבדיקה שכותרת DIG באמצעות ערכת תיוג וזיהוי DIG DNA
   1. ידני 1 טען μl של דילולים סדרתי של חללית הבקרה החיובית המסופקים בערכה וng 1 של החללית שכותרת DIG על קרום הניילון ויבש במשך 5 דקות על RT.
   2. בקצרה להשרות את הקרום במאגר 2x SSC (0.3 M NaCl, 30 נתרן ציטרט מ"מ, pH 7.0) ו דגירה הקרום על 80 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 כדי לשתק את ה- DNA.
   3. בקצרה להשרות את הקרום במאגר חומצת maleic (MAB, 0.1 מ 'חומצת maleic, 0.15 מ' NaCl, pH 7.5) ו דגירה עם אנטי DIG phosphatase (AP) נוגדן -conjugated המדולל בסיסי (1: 5,000) ב 6 מיליליטר של תמיסת חסימה סיפק בערכה ב RT למשך 30 דקות.
   4. לשטוף את הממברנה עם MABT (MAB המכיל 1% Tween 20) ולהחיל 40 μl של פתרון NBT / BCIP מעורב עם חיץ 2 מיליליטר זיהוי (0.1 מ 'טריס HCl, 0.1 מ' NaCl, 0.05 M MgCl _2, pH 9.5) על גבי קרום 1 דקות. אם את הרגישות של הבדיקה שכותרתו היאאינו מספק, חזור על שלבים מ1.1.3 ל1.3.4.
   5. מדוד את ריכוז ה- DNA של החללית שכותרתו (OD260) ולהתאים את הריכוז עד 100 ng μl ^-1.
4. בדקו את הספציפיות של הבדיקה שכותרת DIG
   1. לפגל דגימות הדנ"א הגנומי (25 ng 3 μl ^-1 לכל דגימה) ממיני חיידקים שונים, כוללים החיידק הממוקד על ידי הבדיקה הספציפית, על 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולצנן במהירות על קרח.
   2. ידני לטעון את ה- DNA מפוגל על ​​קרום הניילון ויבש במשך 20 דקות ב RT.
   3. בקצרה להשרות את הקרום במאגר 2x SSC ודגירת הקרום על 80 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות כדי לשתק את ה- DNA.
   4. חסום את הממברנה עם פתרון חסימה ב RT עבור שעה 1.
   5. לדלל את הבדיקה בng 1 μl ^-1 במאגר הכלאה, לפגל בדיקות מדוללים, ולהחיל על הממברנה.
   6. דגירה הקרום ב 45 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
   7. לשטוף את הממברנה שלושפעמים עם חיץ 2x SSC.
   8. בקצרה להשרות את הקרום בMAB.
   9. דגירה עם הנוגדן אנטי DIG AP-מצומדות המדולל (1: 2,000) ב 6 מיליליטר של פתרון חסימה ב RT עבור שעה 1.
   10. לשטוף את הממברנה עם MABT ולהחיל 40 μl של פתרון NBT / BCIP מעורב עם חיץ זיהוי 2 מיליליטר.
   11. כאשר הבדיקה אינה משיגה את הספציפיות הצפויות, להגדיל את טמפרטורת ההכלאה עד הסגוליות הוא ציין.

2. הכלאה באתר

שים לב: כדי למנוע ייבוש של הדגימות וחומרים כימיים, לבצע את כל incubations בתא humidified המרופד במגבות נייר רטובות.

1. דה-paraffinization והתייבשות של חלקי רקמות
   1. הכן 4 מיקרומטר סעיפי רקמות עבים מלוקים מוטבעים פרפין. פורמלין, paraformaldehyde, ומקבעים מבוסס אבץ בקנה אחד עם פרוטוקול זה.
   2. הכן את כל חומרים כימיים במי DEPC שטופל.
   3. שקופיות חום בתנור יבש ב 60 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות ודגירת שקופיות ב RT למשך 30 דקות.
   4. לטבול את השקופיות בקסילן 100% במשך 5 דקות שלוש פעמים; להשתמש קסילן הטרי בכל פעם.
      הערה: האם הליך השעווה-דה זה במנדף כימי.
   5. לטבול את השקופיות באתנול 100% במשך 5 דקות פעמיים, תוך שימוש באתנול טרי בכל פעם, ורעננותם דגימות ב -90% סדרתי, 80% ופתרונות אתנול 70% במשך 5 דקות כל אחד.
   6. לטבול את השקופיות במי DEPC שטופל דקות 1 ולשטוף שקופיות בPBS (pH 7.4) DEPC שטופל במשך 6 דקות.
2. Pretreatments של סעיפי רקמות
   1. לטבול את השקופיות ב 0.1 N חומצה הידרוכלורית עבור 20 דקות ולשטוף במי מגלשות DEPC שטופל למשך 30 שניות.
   2. לצייר מחסום הידרופובי סביב דגימות באמצעות עט שעווה.
      הערה: הגודל של המחסום הידרופובי תלוי בגודל של דגימות. לכן, הכרכים של חומרים כימיים המשמשים בשלבים הבאים משתנים בהתאם לגודלו של דגימות אבל צריכים למלא הי"דמחסום drophobic (50 μl לדגימות קטנות וμl 400 לדגימות גדולות).
   3. פנק את הדגימות עם 50-400 μl של proteinase K (1 עד 10 מיליליטר מיקרוגרם ^-1 בPBS DEPC שטופל) בתנור יבש על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולשטוף בשקופיות PBS 1x DEPC שטופל דקות 1.
   4. משרים שקופיות בparaformaldehyde 4% ב- ​​PBS DEPC שטופל במשך 10 דקות, ולאחר מכן לשטוף בשקופיות PBS DEPC שטופל דקות 1.
   5. משרים שקופיות ב 0.1 M triethanolamine-HCl (pH 8.0) המכיל 0.5% אנהידריד אצטית עבור 20 דקות ולשטוף במי מגלשות DEPC שטופל למשך 30 שניות.
3. הכלאה עם בדיקה ושטיפה
   1. לטבול את השקופיות במאגר SSC 2x במשך 20 דקות.
   2. לדלל את הבדיקה בng 1 μl ^-1 במאגר הכלאה (4x SSC, 50% [כרך / כרך] פוראמיד, הפתרון של 1x Denhardt, 10% [כרך WT /] סולפט dextran, 0.1% [כרך WT /] נתרן גופרתי dodecyl, 0.4 מיליליטר מ"ג ^-1 DNA זרע סלמון). עבור פקדים שליליים, לערבב את החללית שכותרתו עםסכום עודף של פי 10 מבדיקה שכותרתו שאינה.
   3. לפגל הבדיקות מדוללים ולהחיל 50-400 μl על סעיפי רקמות. במקום להחליק כיסוי בשקופית וחותם עם לק.
   4. שקופיות חום בPCR מכונה על 90 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ומגלשות דגירה בO תא humidified / N ב 45 ° C או בטמפרטורה אופטימלית נקבעו בצעד 1.4.11.
   5. לקרר את השקופיות על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, להסיר את המכסה מחליק, לטבול את השקופיות במאגר SSC סידורי כמו הדברים הבאים: 4x SSC במשך 10 דקות, (45 ° C) 2x SSC מראש התחמם במשך 20 דקות, 2x SSC במשך 10 דקות, ו0.2X SSC במשך 10 דקות.
4. זיהוי עם נוגדן אנטי DIG AP-מצומדות
   1. לשטוף שקופיות בMABT במשך 5 דקות.
   2. לחסום עם 50-400 μl של חסימת פתרון עם 1% Tween 20 במשך 20 דקות.
   3. להוסיף 50-400 μl של נוגדן אנטי DIG-AP מדולל חסימת פתרון (1: 1000) anld לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות.
   4. לשטוף שקופיות בMABT במשך 10 דקות.
   5. לטבול שקופיות במאגר זיהוי המכיל 1% Tween 20 במשך 5 דקות.
   6. פנק עם 50-400 μ של levamisole 1 מ"מ (במאגר זיהוי המכיל 1% Tween 20) במשך 5 דקות כדי להשבית phosphatase אלקליין אנדוגני.
   7. להפיץ 50-400 μl של הפתרון המעורבב מראש NBT / BCIP (בדילול במאגר זיהוי בשעה 1: 100) על כל דגימה ודגירת שקופיות בתא humidified ב RT עבור 2 עד 3 שעות עד האות פיתחה היא משביעת רצון.
   8. יש לשטוף את שקופיות עם מים מיוננים להפסיק הדמיה ולהחיל 50-400 μl של 0.05% [כרך WT /] ירוק מתיל ככתם דלפק על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
   9. יש לשטוף את שקופיות עם מים מיוננים, ליבש באתנול 100%, ולטבול בקסילן.
   10. החל 80 μl של פתרון הרכבה על כל שקופית ולכסות עם מכסה מחליק.

תוצאות

מופעי איור 1 dot סופג של בדיקות שכותרת DIG לעומת הבדיקה הבקרה החיובית המסופקת בערכה כדי לקבוע את רגישותם. 343 נ"ב פ הבדיקה -specific gingivalis היא 25 פעמים יותר רגישה מבדיקת eubacterial 70 נ"ב. איור 2 מראה הכלאה באתר של רקמות חניכיים המתקבלות מחולים עם ...

Discussion

הנה פרוטוקול למקם חיידקים בתוך רקמות מוטבעים פרפין באמצעות בדיקה DNA שכותרת DIG תואר. הבדיקה מתמקדת במולקולות ה- DNA או RNA של גן 16S rRNA חיידקים, ויכולות להיות מתוכננות בדיקות 16S rRNA המיקוד כמו גם מינים ספציפיים או אוניוורסלי. הכלאה מסוימת של פ הבדיקה -specific gingivalis לפ gingival...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic anhydride	Sigma	6404
50% Dextran sulfate solution	Millipore	S4030
50X Denhardt’s solution	Sigma	D2532
DEPC	Sigma	P159220
DIG DNA labeling and detection kit	Roche	11 093 657 910
Formamide	Sigma	F9037
ImmEdge™ Pen	Dako	H-400
Levamisole	Vector	SP-5000
Magnesium chloride	Sigma	246964
Maleic acid	Sigma	M0375
Methyl green	Sigma	M6776
Paraformaldehyde	Sigma	P1648
Permount	Fisher	SP15-500
Salmon sperm DNA solution	Invitrogen	#15632-011
Sodium chloride	Sigma	S9625
Sodium citrate	Duksan	D1420
Sodium dodecyl sulfate	Amresco	227
Triethanolamine-HCl	Sigma	90279
Tris-HCl	Research organics	3098T