זריקות לשריר לאורך צלחות מוטוריות סיום: גישה פולשנית להסעות קליעים נותבים ישירות לתוך מנוע נוירונים

Summary

The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

Abstract

מחלות התוקפות את השלמות של תאי עצב מוטוריים בחוט השדרה הן בין תנאי נוירולוגיות המתישות ביותר. בעשורים האחרונים, בפיתוח של מספר מודלים של בעלי חיים של הפרעות העצבית-שרירית אלה סיפק את הקהילה המדעית עם תרחישים טיפוליים שונים שמטרתם לעכב או היפוך ההתקדמות של תנאים אלה. על ידי ניצול של המכונות המדרדר של נוירונים, אחד מהגישות אלה היה למקד את שרירי שלד כדי גנים טיפוליים הסעות למתאימות הנוירונים מוטוריים בחוט השדרה. למרות שפעם אחת מבטיח, ההצלחה של גישת מסירת גן כזה כבר הקשתה על ידי המספר תת-אופטימלי של תאי עצב מוטורי transduced זה עד כה הוכיח להניב. צלחות הסוף מוטורי (חברי הפרלמנט האירופי) הן אזורים מאוד מיוחדים על שרירי השלד שנמצאים בקשר הסינפטי ישיר לחוט השדרה α הנוירונים מוטוריים. בהקשר זה, חשוב לשים לב כי, עד כה, המאמצים לretrogradelyגני העברה לתוך הנוירונים מוטוריים נעשו ללא התייחסות למיקומו של אזור MEP בשרירים הממוקדים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט 1) כדי לחשוף את המיקום המדויק של חברי הפרלמנט האירופי על פני השטח של שרירי שלד ו- 2) להשתמש במידע זה כדי להנחות את המשלוח תוך שרירית והתחבורה מדרדר אופטימלית הבאה של קליעים נותבים מדרדר לתוך הנוירונים מוטוריים. אנו מקווים לנצל את התוצאות מניסויי התחקות אלה במחקרים נוספים לחקירת תחבורה מדרדר של גנים טיפוליים לנוירונים מוטוריים בחוט השדרה באמצעות המיקוד של חברי הפרלמנט האירופי.

Introduction

אובדן השליטה של ​​תנועה רצונית, הנובעת מבעיות נוירולוגיות כגון מחלת הנוירון מוטורי ושדרה, כמו גם ניוון שרירים דושן הוא מצב של חולשה שיש השפעה מתמשכת גבוהה וארוכה בחייו של כל יום של אנשים מושפעים. בעשור האחרון, מאמצי מחקר במטרה לעצור או לפחות לעכב את ההשפעות המזיקות של מחלות העצבית-שרירית אלה היו בראש סדר עדיפויות לרופאים רבים ומדען ברחבי העולם. בהקשר זה, הדור האחרון של מודלים של בעלי חיים המחקים מחלות עצבית-שרירית אלה כבר סייעו בהשגת תובנות בסיסיות למנגנונים הפיסיולוגיים העומדים בבסיס ההתפתחות וההתקדמות של תנאים אלה ^1-13. טיפול במחלה העצבית-שרירית אלה דורש גישה ישירה לחוט השדרה ויכולה להיות מושגת על ידי זריקות חוט השדרה ^14,15. גם התקדמות בטיפול גנטי ממוקדת השרירים המשורטטים של העליון וגפיים התחתונים לגנים טיפוליים הסעות לתאי העצב המוטוריים α המתאים, הממוקמים בתוך קרן הגחון של חוט השדרה ^1,9-13. עם זאת, אסטרטגיה פעם מבטיחה זה לא הצליחה לשפר את התוצאה של תנאי נוירולוגיות אלה. אמנם זה הוגן להסיק שתוצאות גרועות אלה יכולים להיות, לפחות בחלקו, להיות מיוחס ליעילות הנמוכה של גני מגן אלה, אחד לא יכול לשלול את היעילות הנמוכה של שיטות משלוח גן אלה.

צלחות הסוף מוטורי (חברי הפרלמנט האירופי) הן אזורים מיוחדים של myofibres שלד שמסוכסך על ידי מסופי האקסון של סיבים מוטוריים היקפיים גדולים שמקורם α הנוירונים מוטוריים. יחד, קצות עצבי סיבים ההיקפיים וחברי הפרלמנט האירופיים מהווים את הצומת העצבית-שרירית, כלומר, האתר שבו דחפים הסינפטי מופעלים על ידי שחרור אנטרוגרדית של מוליך עצבי, אצטילכולין. חשוב לציין, את מערכת היחסים בין סיבי עצב היקפיים וחברי הפרלמנט האירופיים היא דו-directional, למרות שמנועים שונים אחראים להובלה של מולקולות ואברונים כיוון, כמו גם מתא העצב somata ^16-18. לאור שיקולים אנטומיים אלה, חברי הפרלמנט האירופי להיראות המטרות של בחירה עבור המשלוח והתחבורה מדרדר הבאה של חומר גנטי לתאי העצב המוטוריים המקבילים. בהקשר זה, אין זה מפתיע שההצלחה של התמרה הנוירון מוטורית מאוד תלויה במרחק בין הזריקה תוך שרירית של וקטורים ויראליים וחברי הפרלמנט אירופי של השריר ^19-20. באופן מפתיע, עם זאת, את המיקום המדויק של אזורי חבר הפרלמנט האירופי על myofibres של עכברוש המעבדה ועכבר, שני המינים של בחירת מודל מחלות עצבית-שרירית, לא היו זמינים עד לאחרונה.

יש לנו יצרנו מפות מקיפות של אזור חבר הפרלמנט האירופי לכמה שרירי forelimb בחולדה והעכבר ^21-22. לאחרונה, שהראינו את הפרטים של הארגון של r חבר הפרלמנט האירופילאגיון לכמה שרירים של hindlimb העכבר ²³ ואנחנו כרגע ניתוח התכונות של חברי הפרלמנט האירופי בhindlimb החולדה. בידיים שלנו, זריקות לשריר של קליעים נותבים מדרדר מופנים לכל האזורים חבר הפרלמנט האירופי, בשרירים אלה הולידו הנוירונים מוטוריים יותר שכותרת המשתרעים על פני מגזרי חוט השדרה יותר מאשר דווח בעבר. כאן אנו מציגים את הפרוטוקול שפותחו בשנים האחרונות כדי לחשוף את המיקום של חברי הפרלמנט האירופי על פני השטח החיצוניים כמו גם ברחבי עומק hindlimb וforelimb שרירים בשני העכבר והחולדה.

Protocol

כל הליכי הניסוי המתוארים כאן עמדו בועדה לטיפול בבעלי חיים והאתיקה של UNSW אוסטרליה ובוצעו בהתאם לבריאות הלאומית ותקנות המועצה למחקר רפואי של אוסטרליה לניסויים בבעלי חיים. כל הנהלים בפרוטוקול זה צריכים להתבצע בהתאם לדרישה של ועדת טיפול בבעלי חיים ואתיקה הרלוונטית.

1. acetylcholinesterase histochemical מכתים

1. מכין את תערובת תגובת acetylcholinesterase
   1. להוסיף 290 מ"ג של יודיד Acetylthiocholine 200 מיליליטר של 0.1 מ 'חיץ פוספט (PB). מערבבים עם בוחש מגנטי ב 900 סל"ד.
   2. להוסיף 600 מ"ג של גליצין בבחישה מתמדת.
   3. לאט לאט להוסיף 420 מ"ג של גופרת נחושת לתערובת התגובה תחת בחישה מתמדת עד שהמוצר הוא נמס לגמרי.
2. הסר את העור על פגר החיה (שהושג באמצעות שיתוף רקמות) על ידי ביצוע חתכיםלתוך העור של עכברים או עכבר perfused, לתפוס את העור מאזור הצוואר ומושך את זה בעבר רגליה. ודא שfascia מכסה כל שריר הוא או שהוסר או מחורר באופן משמעותי כדי להבטיח חשיפה נרחבת של סיבי השריר לפתרון התגובה.
3. לטבול את כל הגוף או איבר של עניין לתערובת תגובת דגירה O / N ב 4 ° C.
4. שטוף את הפגר למשך 2 דקות במים מזוקקים. הערה: בשלב זה, את שרירי תערוכה צבע כחול וצלחות סוף מנוע (חברי הפרלמנט האירופי) ניתן לראות בנקודות הלבנות.
5. לחשוף את הפגר לפתרון גפרתי אמוניום 10% במשך 3-5 שניות.
   הערה: סיבי השריר במהירות יהפכו חומים וחברי הפרלמנט האירופיים יהיו נצפים כנקודות מנומרות שחורות. אם התגובה מתרחשת מהר מדי, והסיבים השריר מוכתמים כהים מדי להבחין בין חברי הפרלמנט האירופי והסיבים השריר מנסים באמצעות ריכוזים נמוכים יותר של פתרון אמוניום גפרתי (למשל, 5%). זמן התגובה כדי לקבל אתלעומת זאת אופטימלי בין חברי הפרלמנט האירופי והסיבים השריר משתנה ממדגם אחד למשנהו. לכן קשה להגדיר את זמן חשיפה המדויק למגיב. התגובה צריכה להיות במעקב הדוק ועצרה כאשר לעומת זאת נחשב נאות.
6. שטוף את הפגר שתי פעמים, עם תסיסה במים מזוקקים וללטף בעדינות היבשה הפגר.
7. צילום שני היבטים לרוחב והמדיאלי של הגפה, על מנת להבטיח כי חברי הפרלמנט האירופי לכל השרירים של עניין נלכדים.

2. תוך שרירית זריקות בצלחות מוטורית הסוף

1. משוך micropipettes זכוכית עם חולץ micropipette (השימוש בmicropipettes מדורג עם בוכנות מומלצת). בעזרת מיקרוסקופ לנתח, לשבור את הטיפים של micropipettes עם זוג המלקחיים כך שהקוטר הפנימי של לומן של micropipette הוא כ 0.5 מ"מ.
2. ודא שכל מכשירי הניתוח נעשו בם שימוש טרי autoclaved והבאזור הניתוח הוא סטרילי.
3. מלא את micropipettes עם Fluoro-זהב (5% במים מזוקקים).
4. לגרום לְאַלחֵשׁ בבעלי החיים בתא אינדוקציה עם isofluorane (4% בO _2). בדוק ליישר רפלקס ולהבטיח היעדרו לפני הסרתו מתא האינדוקציה. Secure חרטום על החוטם של החולדה ולספק isofluorane (2% בO ₂₎ לתחזוקה של הרדמה. לצבוט את אצבעות רגליו של בעל החיים ולגעת בעדינות את העין של בעלי החיים על מנת להבטיח ששתי נסיגת הדוושה ורפלקסים קרני נעדרות. הערה: גם תערובת של קטמין וxylazil יכולה לשמש (80 ו -10 מ"ג / קילוגרם בהתאמה, נמסרו intraperitoneally). קטמין הוא לוח זמנים 8 ("מבוקר") סמים ופרוטוקולים נחוצים הקשורים לרכישה, שימוש, האחסון וסילוק של התרופה יהיה חייב להיות דבק.
5. החל סיכה עין כדי למנוע התייבשות של העיניים במהלך ההליך.
6. לגלח את tאיבר argeted וגזת שימוש כדי לנגב את האזור המגולח עם שלושה סקראבס לסירוגין של chlorhexidine ואלכוהול 70%. מעבירים את החיה לאזור הניתוח.
7. מניחים את החיה על underpad נקי ולמקם אותו כראוי, כדי להבטיח גישה טובה לשריר (ים) הממוקד.
8. השתמש זוג מלקחיים עם נקודות אחיזה שן להרים מהשרירים הבסיסיים העור מעל השריר הממוקד ולעשות חתך בעור עם מספריים כירורגיות. ודא שהחתך הוא גדול מספיק כדי לחשוף את השריר (ים) של עניין לחלוטין. ודא שיש הפרעה מזערית לfascia.
9. השתמש בתמונות MEP ללשרבב נפשי מיקום וצורה של האזור חבר הפרלמנט האירופי על השריר (ים).
   הערה: סמן הרגיש בסדר יכול לסייע לשחזר את אזור MEP מהתצלום על גבי השרירים (ים) של עניין.
10. לבצע זריקות מרובות לאורך כל אורכו של אזור חבר הפרלמנט האירופי (לFluoro-זהב, 3 עד 4 זריקות של 1-2 μl כל זהhould יספיק). נגב בעדינות את השרירים (ים) כדי להסיר כל חלחול.
11. להביא את שני הקצוות של העור חרות קרוב יחד עם מלקחיים בוטים ולסגור את הפצע עם קליפים כירורגית. לחדור 0.1 מיליליטר Bupivacaine (0.5% במים) (או הרדמה מקומית אחרת) לאורך כל תוחלת של הפצע.
12. כבה את מכשיר ההרדמה ומלפקח על בעלי החיים עד שהוא התאושש לחלוטין מן ההרדמה.
13. חכה 14 ימים בין הממשל של זריקות תוך-שרירי והטפטוף של בעלי החיים.

3. זילופים

1. לנהל מנה קטלנית של פתרון נתרן pentobarbitone (למשל Lethabarb; 150 מ"ג / קילוגרם) לבעלי החיים על ידי זריקת intraperitoneal.
   1. באופן הדוק לפקח על בעלי החיים עד שהגיעה לרמה עמוקה של הרדמה, כפי שאושר על ידי היעדר נסיגת הדוושה ורפלקסים של הקרנית.
2. מקם את החיה על הגב שלה על לוח לנתח ממוקם מעל perfusioכיור n.
3. השתמש זוג מלקחיים עם נקודות אחיזה שן להרים את העור המכסה את הבסיס של עצם החזה. לעשות חתך קטן בעור עם זוג מספריים כירורגיות חזקים מייד מתחת לעצם החזה ולאחר מכן להשתמש במלקחיים כדי אחיזת סחוס xiphoid של עצם החזה. בעוד מחזיק את סחוס xiphoid, להגדיל את החתך בשני הצדדים של חלל החזה, מעצם החזה לבתי השחי.
4. חותך את הסרעפת כדי לחשוף את הלב.
   1. הזרק 0.ml של הפרין ישירות לשיא של הלב כדי למנוע קרישה של הדם.
   2. חותך את השיא כדי לאפשר ההחדרה של צינורית לתוך החדר השמאלי, ולאחר מכן מהדק במהירות את הצינורית במקום בעזרת haemostat.
   3. עושה חתך באטריום תקין עם זוג המספריים קנס ומייד להתחיל את משאבת peristaltic. Perfuse עם 0.1 מ 'PB עד שהנוזלים זורמים החוצה של אטריום הוא כמעט חופשיים של דם והצבע של הכבד הופך חום בהיר. לאחר מכן, perfuse עם solution של paraformaldehyde (4% ב 0.1 M PB) עד שכל גופו של בעל החיים הופך להיות נוקשה.

4. חוט השדרה הצווארי Dissection והכנה להיסטולוגיה

1. הנח את פגר החיה על הבטן שלה.
2. חותך את העור בקו האמצע של הגוף עם אזמל ולשקף אותו מבסיס הגולגולת עד לרמה של עצם הכסל.
3. לחתוך ומשקפים את השרירים ליד חוליות עמוד השדרה על מנת לחשוף את היבט הגב של עמוד השדרה.
4. זהה את תהליך spinous הגרמי של אטלס, מגזר צוואר הרחם השני (כלומר, C2), ולהסיר אותו עם זוג rongeurs או מלקחיים כירורגיים לאתר את השורש הגבי מקביל יסוד.
   1. זהה את שורש C2 תקין על ידי צביעתו עם סמן הרגיש קבוע.
   2. הסר את החוליות הבאות בזה אחר זה ולסמן את שורשי גב תקין עם צבעים מתחלפים (כלומר, C2, C4, יכול להיות בצבע C6, וC8 בירוק וC3, C5, C7, T1 יכול להיות colכבדתי בכחול).
5. שימוש במחט כירורגית קטנה (למשל, 30 G מחט מד) לעדינות פירס דרך הדורה המכסה את הקצה התחתון של חוט השדרה. עם השיפוע של המחט פונה כלפי מעלה, להרים את הדורה מהכבל תוך כדי תנועת המחט rostrally לעשות חריץ אורכי.
   1. משקף את הדורה.
6. חותך את חוט השדרה transversally לגושים אחת או שתיים קטע עם להב סכין מנתחים חדש.
   1. השאר את מגזרי חוט השדרה באתר ו, עבור כל בלוק, להפוך בזהירות סימן fiducial קטן בצד השמאל של כל בלוק עם מחצית דרך להב סכין מנתחים בין שני שורשים סמוכים. ודא שסימן fiducial הוא עמוק מספיק דרך הרקמה כלהיות גלוי מהיבט הגחון של בלוקים. הפוך את סימן fiducial בזווית של 45 מעלות כ, מצביע גם anteriorly או בדיעבד ביחס לאנטומיה של בעלי חיים, כדי לסייע בכיוון של מגזר הרקמה הבא לנתיחה.
7. לאסוף את אבני הפרט לבקבוקים קטנים, שכותרתו ברורה המכילים פתרון של paraformaldehyde (4% ב 0.1 M PB) ולהשאיר על RT O / N.
8. העבר את אבני לתוך בקבוקים נקיים, שכותרתו ברורה המכילים פתרון של סוכרוז (30% ב 0.1 M PB) ולשמור על 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות יומיים.
9. מניחים את הפלחים בcryo-תבניות וכיסה אותם במדיום הקפאת רקמה. להכנת היסטולוגית אורך, כוון את הלוקים בהיבט הגב פונה כלפי מעלה ולהשתמש בסימן fiducial כדי לכוון את הבלוק בcryo-התבניות.
10. להקפיא את cryo-התבניות ב -20 ° C ולחתוך עם cryostat ב -50 סעיפים מיקרומטר בעובי. הערה: החלקים יכולים להיות מותקן ישירות על שקופיות מיקרוסקופ ההידבקות והשאירו לייבוש O / N. לחלופין, ניתן ריחפו הסעיפים ב 48-גם צלחות מלאות ב0.1 M PB ולאחר מכן רכובים באמצעות סימן fiducial כדי לכוון את סעיפי רקמות על השקופיות.

5. מותני השדרה CoRD Dissection והכנה להיסטולוגיה

1. הנח את פגר החיה על זה בחזרה.
2. לבצע חתך קו האמצע לאורך הבטן של החיה ולהסיר את הקרביים. לנתח את השרירים של דופן בטן האחורית לחשוף את היבט הגחון של עמוד השדרה.
3. אתר את הצלע הקצרה הזנב-ביותר וחולית T13 הסמוך בי שורש הגחון T13 יוצא העצם.
   1. ברצף להסיר אחד אחד מקורי שתיים או שלוש חוליות לT13 (כלומר, T12, T11 ו, במידת הצורך, T10) עם rongeurs כירורגית העדין לעקוב שורש הגחון T13 עד הנקודה של כניסה בהיבט הגחון של חוט הגחון ו לסמן אותו עם סמן הרגיש קבוע.
   2. מנקודה זו ואילך, לחזור על אותה הפרוצדורה לזהות את המיקום של נקודות כניסת שורש הגחון לL1, L2, L3, L4, L5, S1 וL6, צביעתם עם צבעים מתחלפים.
4. בצע את אותו ההליך כאמור בסעיף 4.5-4.10 ללוםבר נתיחת חוט השדרה.

תוצאות

צביעת histochemical acetylcholinesterase חושפת את המיקום של צלחות סוף המנוע לרוחב של השרירים. איור 1 מדגים את התוצאות של מכתים כזה מבוצע על forelimb עכברוש כולה. הוא הציע כדי לייעל את הריכוז של הפתרון גפרתי אמוניום (למשל., 5-7% במקום 10%), כמו גם את זמן הדגימה היא שקועה בפתרון אם מ...

Discussion

מיקוד תוך שרירית והעברת מדרדר הבאה של transgenes הטיפולי לתאי העצב המוטוריים α המתאימים לטיפול הניסיוני של מצב עצבית-שרירית אינה אסטרטגיה חדשה. לדוגמא, שיטת משלוח זו נעשתה שימוש כדי לעכב ניוון עצבית-שרירית בשלבים שונים של התקדמות ALS בSOD1 לעכברים וחולדות ^1,9-12 כמו גם בע...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluoro-Gold	Fluorochrome, LLC	Nil	Diluted to 5%
Drummond PCR Micropipets 1-10 µl	Drummond Scientific	5-000-1001-X10	accompanied with plungers
Acetylthiocholine Iodide	Sigma Life Science	A5751-25G
Copper(II) Sulfate Anhydrous	Sigma-Aldrich	61230-500G-F
Tissue-Tek O.C.T Compound	Sakura Finetek	25608-930
Glycine	Ajax Finechem	1083-500G
Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin	Life Technologies	D-3312	Diliuted in distilled water
Isothesia	Provet	ISOF00	1000 mg/g Isoflurane inhalation vapour
Autoclip 9 mm Wound Clips	Texas Scientific Instruments, LLC	205016
Lethabarb Enthanasia Injection	Virbac (Australia) Pty Ltd.	LETHA450
Formaldehyde Solution	Ajax Finechem	A809-2.5L PL
SuperFrost Plus glass slides	Menzel-Glaser	J1800AMNZ
Ammonium Sulphide	Sigma-Aldrich	A1952	Diluted to 10%
Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride)	Astrazenca		Diluted to 0.25%