כוח האטומי מיקרוסקופית הדמיה וחיל ספקטרוסקופיה של bilayers שומנים הנתמכים

Summary

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Abstract

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force.

The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

Introduction

מיקרוסקופית כוח אטומי (AFM) מייצר תמונה של פני השטח על ידי סריקה על פני שטח של המדגם באמצעות שלוחה עם קצה חד מאוד ^1. התנועה של שלוחה חוקרת את הטופולוגיה של מדגם המשטח. AFM כבר מיושם באופן נרחב למולקולות ביולוגיות - כוללים חלבונים, DNA, וקרומים, בשל צדדיות שלה בניתוח דגימות קבועות באוויר או מצב כמעט טבעי בנוזל ^2-5.

מלבד יכולת ההדמיה ברזולוציה הגבוהה שלה בטווח ננומטר, שלוחה AFM פועלת כקפיץ לחקור כוחות אינטראקציה (הידבקות ודחייה) ותכונות מכאניות של המדגם ^5,6. התופעה זו ידועה בכח ספקטרוסקופיה. במצב זה, החללית מתקרבת ראשונה המדגם ומפעילה כוח על זה, ואז הוא חזר עד שהוא מאבד קשר עם המדגם (איור 1 א). עקומות שנוצרו להראות כוח כפונקציה של מרחק של שלוחה לשתי האפליקציהמקק והכחשה. מספר נכסים כוללים מודולוס האלסטיות למדוד את הנוקשות של חומר, וניתן לגזור כוחות ההידבקות.

bilayers שומנים הנתמכים הם קרומים ביולוגיים מודל שוכבים על גבי תמיכה מוצקה - בדרך כלל נציץ,, סיליקה הזכוכית בורוסיליקט התמזגה, או חמצון סיליקון ^7. הם מוכנים תוך שימוש בטכניקות שונות כמו בתצהיר שלפוחית, שיטת אנגמיור-באגט וספין-ציפוי ^8,9. ההדמיה AFM נעשתה שימוש כדי לעקוב אחר היווצרות bilayers הנתמכות הבאות ^10, ולחקור מבנים שונים שהוקמו על ידי קרומים של קומפוזיציות שונות ^11-15.

ביצוע כוח ספקטרוסקופיה על תוצאות bilayers נתמכות בשיא בעקומת הגישה. שיא זה מצביע על הכוח הדרוש כדי לחדור את bilayer, והוא נקרא כוח פריצת דרך. עובי bilayer גם ניתן למדוד באמצעות כוח העקומה ^6. כוח הפריצה האופייני של bilayersטווח שבין 1-50 ננ ^6. מאפיינים אלה תלויים באריזת שומנים (שלב נוזלי או ג'ל) ומבנה (אורך שרשרת acyl ומידת unsaturation) ושונה על ידי סוכני קרום פעיל ^16. התאוריה מאחורי הקרע הוסברה ¹⁷ ופרמטרים ניסיוניים אחרים כגון רכות שלוחה, רדיוס קצה ומהירות גישה משפיעים גם על כוח פריצת הדרך ^15,16,18. ספקטרוסקופיה הכוח נעשתה שימוש כדי לנתח את התכונות של שלבים שונים שומנים ^11,19, שינויי הרכב תלוי ^12,20, כמו גם השפעות של מולקולות ביולוגיות אחרות, כמו פפטידים, ביציבות של הקרום ^21.

הנטייה השטוחה של bilayers נתמכת היא יתרון עבור שילוב AFM עם שיטות אחרות כגון מיקרוסקופיה תהודת ²² וקרינת המשטח plasmon ^11,19 לאפיין מבנה ותכונות של ממברנות טובות יותר.

פרוטו וידאו מפורט זהcol נועד להכין bilayers שומנים נתמכים באמצעות תצהיר שלפוחית ​​ולנתח אותם עם AFM והכח ספקטרוסקופיה. בעוד שלפוחית ​​בגדלים שונים ניתן להשתמש כדי להכין bilayers, פרוטוקול זה מתמקד בשלפוחית ​​unilamellar קטנה וגדולה. bilayers נתמכת ששלב להפריד לנוזל הורה _(o L) ושלבים נוזליים סדר _(ד L) התאפיינה ^11,15. הקרום מורכב מdi-oleoyl-phosphatidylcholine (dOPC), sphingomyelin (SM), וכולסטרול (חול) בשעה 2: יחס 1: 2. דגמי הרכב זה רפסודות השומנים בדם, אשר הציעו להתנהג כפלטפורמות חשובות לסחר בחלבון ומיון, איתות תא ותהליכים תאיים אחרים ^23,24.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הכנת bilayers שומנים הנתמכים (SLB) ^11,12,21

1. הכנת תערובת שומנים והשעיות שלפוחיות Multilamellar
   1. הכן את המאגרים הבאים מראש.
      1. הכן חיץ PBS בריכוזים של 2.7 מ"מ KCl, 1.5 מ"מ KH ₂ PO _4, 8 מ"מ Na ₂ HPO _4, ו -137 מ"מ NaCl, pH 7.2.
      2. הכן SLB חיץ (bilayer שומנים הנתמכים) בריכוזים של 150 מ"מ NaCl, 10 מ"מ HEPES, pH 7.4.
      3. הכן פתרון של 1 M CaCl _2.
   2. ממיסים את השומנים הבאים בכלורופורם בריכוז רצוי: למשל, די-oleoyl-phosphatidylcholine (dOPC) במינון 25 מ"ג / מיליליטר, sphingomyelin (SM) במינון 25 מ"ג / מיליליטר וכולסטרול (חול) בשעה 10 מ"ג / מיליליטר.
   3. קח 18.38 μl של dOPC, 17.10 μl של SM ו11.30 μl של חול כדי להפוך פתרון עם 1 מ"ג של שומנים כולל של 2: 1 dOPC: 2 יחס טוחנת חול: SM. להשתנות הכרכים בהתאם מבוסס על concentrations של השומנים שהוכנו ב1.1.2. עם זאת, לשמור על היחס טוחנת ב -2: dOPC 1: ​​2 SM: החול, כמו שינוי היחס טוחנת ישנה את מאפייני השלב של הקרום ^25.
   4. מערבבים את הפתרון לחלוטין על ידי vortexing. הוסף צבע lipidic ניאון ב0.05% מול אם רוצה לדמיין את bilayer על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
      הערה: המשפחה של dialkylcarbocyanines ארוכת שרשרת, כמו שעשו, וDiI DIO span מגוון רחב של אורכי גל וניתן להשתמש בו באופן אידיאלי לתייג ממברנות שומנים בדם. לחלופין, שומנים שכותרתו fluorescently, כמו rhodamine-phosphatidylethanolamine או BODIPY כולסטרול ניתן להשתמש. בכל מקרה, את הריכוז של הצבע צריך להיות מותאם על פי הגדרת מיקרוסקופיה, תוך התחשבות כי ריכוזים גבוהים של fluorophore חייב השומנים יכולים לשנות את ההתנהגות ¹⁹ השומנים.
   5. ייבש את כלורופורם באמצעות גז ₂ N (או כל גז אינרטי זמין כגון Ar והוא).
   6. לא יבש נוסףהוא השומנים תערובת תחת ואקום במשך שעה לפחות 1.
      הערה: אם אחסון תערובת שומנים זו, לטהר אוויר עם גז אינרטי (N _2, Ar או הוא) ולאחסן ב -20 ° C. Aliquot שומנים ב-כלורופורם עודפים לתוך צלוחיות קטנות וחום. מייבש אותם באופן דומה לתערובת השומנים בדם, לעקור אוויר עם גז אינרטי (N _2, Ar או הוא) ולאחסן ב -20 ° C.
   7. ממיסים את השומנים המיובשים במאגר PBS לריכוז של 10 מ"ג / מיליליטר.
   8. מערבולת את התערובת במרץ לכ -20 שניות עד 1 דקות כדי לקבל השעיה מעונן, המכילה שלפוחית ​​multilamellar. ודא שאין סרטי שומנים דבק הצדדים של הבקבוקון.
   9. להפיץ השעיה זו ל -10 aliquots μl (1 מ"ג של שומנים בדם גורם 10 aliquots).
   10. חנות ב -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
2. הכנת Unilamellar שלפוחית
   הערה: בגדלים שונים של שלפוחית ​​unilamellar יכולים להיות מוכנים תוך שימוש בשיטה sonication או השיטה שחול. Sonication משתמש יםound אנרגיה כדי להתסיס את התערובת ולהפריד את השכבות של ההשעיה multilamellar. זה מסומן על ידי ניקוי מההשעיה המעורפלת. החול מאלץ את שלפוחית ​​multilamellar לעבור דרך מסנן קרום עם גודל נקבובית מובהק.
   1. שיטת Sonication
      1. קח 10 μl של מתלי שומנים multilamellar ולהוסיף 150 μl של חיץ SLB.
      2. מעבירים את התערובת ל( 2 מיליליטר) בקבוקונים קטנים כתרים זכוכית וחותם עם Parafilm.
      3. Sonicate את התערובת בטמפרטורת החדר בsonicator אמבטיה במשך 10 דקות או עד שיתברר להניב שלפוחית ​​unilamellar קטנה (רכבי שטח, מתחת ל -50 ננומטר בקוטר).
   2. חול שיטה
      1. קח 10 μl של מתלי שומנים multilamellar ולהוסיף 150 μl של חיץ SLB.
      2. מעבירים את ההשעיה לתוך צינור קירור.
      3. להקפיא את ההשעיה שומנים על ידי השריית צינור הקירור לכמה שניות בחנקן נוזלי.
      4. להפשירהשעיה שומנים על ידי השריית צינור הקירור באמבט מים בטמפרטורת חדר או 37 מעלות צלזיוס במשך כמה דקות. חזור על השלבים להקפיא להפשיר לפחות 10 פעמים.
      5. כדי extrude ההשעיה השומנים בדם, להשתמש קרום פוליקרבונט עם 200 גודל נקבובית ננומטר (גודל נקבובית אחר זמין כמו, 100 ננומטר או 400 ננומטר) ומכשיר שחול מסחרי ^26.
         הערה: נכון לעכשיו, יש שני מכשירי מכבש זמינים מסחרי: מכבש ידני זמין עבור נפחים קטנים (200 μl לכמה מיליליטר). במקרה זה, המדגם הנמתח דרך הממברנה על ידי לחיצה על ההשעיה ידנית הלוך ושוב בין שני מזרקים. בהתאם ליצרן, aliquots שומנים היה צריך להיות בשילוב להגיע נפח מינימאלי של להגדיר. עבור אמצעי אחסון גדול יותר (עד 50 מיליליטר) מכשירים מתוחכמים יותר משמשים בי ההשעיה נאלצה דרך קרום פוליקרבונט באמצעות גז דחוס. תנאי הגדרה וחול יכולים להשתנות בהתאם לmodאל. עיין בהוראות של היצרן לפני השימוש. פרוטוקול זה מתייחס למכבש הידני לנפחים קטנים.
      6. לאזן את מכבש במים על ידי העברת מים דרך מכבש. לטבול את הקרום במים.
      7. מניחים את הקרום בין שתי הבוכנות, להרכיב את המכשיר ולאזן במאגר, על ידי העברה למאגר דרך מכבש, ממזרק אחד למשנהו. שלב זה מאפשר גם בדיקת הדליפות במערכת. אם הוא דולף, לפרק ולהרכיב מחדש את זה שוב משתנה הקרום.
      8. קח את ההשעיה השומנים באמצעות מזרק אחד מכבש ("צד מלוכלך").
      9. צרף את המזרק המכיל את ההשעיה שומנים בתא אחד ומזרק הריק בתא היריב.
      10. לדחוף את המזרק בקצה אחד. להעביר את הפתרון דרך הקרום ולתוך המזרק היריב. זה עובר 1 ^st.
      11. להעביר אותו דרך הקרום עבור הסכום כולל של 31 פעמים כגוןכי הפתרון בסופו של על המזרק היריב ("צד נקי").
          הערה: בדוק את הקרום לאחר extruding. אם זה נשבר, אז תהליך שחול לא היה מוצלח וצריך להיות חוזרים ונשנים.
      12. רוקן את המזרק לתוך צינור קטן. שלפוחית ​​גדולה unilamellar ("'לאב') הן יציבה במשך 1-2 ימים, אם כל הזמן על 4 מעלות צלזיוס.
3. הכנת נציץ וCoverslips
   1. לשטוף coverslips הראשון במים ולאחר מכן באתנול. אוויר יבש.
   2. קח דיסקים נציץ ולקלף את השכבה החיצונית באמצעות נייר דבק.
   3. צרף את הדיסק נציץ על coverslip. דבקים אופטיים שקופים הם אופטימליים, כך שאפשר לבדוק את bilayers עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
   4. צרף צילינדרי פלסטיק (קוטר 2.5 סנטימטר חיצוני, קוטר פנימי 2 סנטימטר, וגובה 0.5 סנטימטרים) באמצעות דבק / גריז אופטי. לוודא שהכל סגור ושאין נזילות. השתמש גריז כאשר רוצה להשתמש שוב בלונים כפי שהם יכולים להיות בקלות מנותק מהcoverslip דואר ורחץ. הממדים של גלילי הפלסטיק תלויים בגודלו של בעל שלוחה AFM וצריכים להיות בהתאם.
4. בתצהיר של Unilamellar שלפוחית ​​על תמיכה מוצקה
   1. Pipet פתרון liposome כל ישירות על גבי נציץ. הוסף עוד חיץ SLB להגיע נפח של 300 μl.
   2. להוסיף 0.9 μl של פתרון כלוריד M סידן 1 להגיע לריכוז סופי של 3 מ"מ Ca ^{2 +.}
   3. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ולאחר מכן ב 65 מעלות צלזיוס במשך לפחות 10 דקות. תמיד לכסות את bilayers עם חיץ. לתקשר עם בועות אוויר והאוויר יהיה להרוס אותו. במהלך דגירה, להוסיף עוד חיץ במידת צורך, במיוחד אם דוגרים בטמפרטורות גבוהות.
      הערה: טמפרטורות דגירה משתנות בהתאם לתערובות השומנים והשלבים הנדרשים. יש צורך בזמן דגירה של לפחות 10 דקות כדי ליצור bilayers נתמך, אבל זה יכול להיות ארוך יותר, תלוי בטמפרטורה ובהרכב.
   4. לשטוףbilayer עם (C ° 65) החם חיץ SLB 15-20 פעמים כדי להסיר סידן ושלפוחית ​​unfused. קח טיפול נוסף במהלך שלבי הכביסה לשמור bilayer תחת חיץ והעדינות pipet פתרון הכביסה כדי למנוע הרס bilayer.
   5. bilayers מגניב נתמכת לטמפרטורת חדר לפני מדידות AFM. זה נחוץ כדי ליצור את השלבים השונים של הקרום, כמו גם למזער סחיפה תרמית במכשיר.

2. מדידות מיקרוסקופית כוח אטומי ^11,12

1. הדמיה
   הערה: בצע הדמיה במיקרוסקופ כוח אטומי במצב קשר או הקשה מצב. bilayers תמונה נתמכת בפתרון; אינו מאפשר פתרון ללהתאדות לחלוטין כמו זה יהרוס את bilayers. כפי שניתן היה לעבוד עם חיץ, אנא הקפד על אמצעי זהירות בטיחות ובלוודא כי כל חלק AFM מוגן מנשפך נוזל.
   1. בחר שלוחה רכה (להלן 0.2 קבוע קפיץ N / מ 'מומלץ) ולהעלות אותו כדי לאהוא AFM. הבחירה של שלוחה נוקשות היא קריטית יותר לכוח ספקטרוסקופיה (וזה יידון בהמשך).
   2. הר המדגם על הבמה AFM ולוודא שכל המודולים רטט-הבידוד מופעלים. חכה לפחות 15 דקות כדי לאזן ולהפחית סחיפה תרמית של המערכת. בהתאם להגדרת AFM, מפרטי כוונון והדמיה עשויים להשתנות. התייעץ עם המדריך של היצרן.
   3. מתקרב למדגם עם קצה AFM עד ליצירת קשר.
   4. מאז bilayers השומנים הם בדרך כלל 4 ננומטר בגובה, להשתמש Z-הטווח של המכשיר שייתן לי הרזולוציה Z-הגבוהה ביותר (לדוגמא 1.5 מיקרומטר).
   5. בחר אזור לתמונה. כדי לקבל סקירה כללית של bilayer השומנים, 50 מיקרומטר x 50 מיקרומטר או 25 מיקרומטר x 25 מיקרומטר אזור יהיה נקודת התחלה טובה לתמונה. אם תכונות קטנות יותר מופיעות, תמונה יכול אחד באזורים קטנים יותר (10 מיקרומטר x 10 מיקרומטר, או 2 מיקרומטר x 2 מיקרומטר). הבחירה של אזור ההדמיה תלויה גם בr עובדAnge של הסורק פיזואלקטריים. אנא עיין במדריך למכשיר זה.
   6. כbilayers הן מאוד שבירה, להתאים את נקודת קצה AFM הסט במהלך הדמיה כדי לשמור על הכוח במינימום ונכון לסחיפה תרמית, תוך שמירה על קשר עם המדגם. במצב קשר, למזער את נקודת הסט. בהקשת מצב, למקסם את נקודת הסט.
   7. תמונות תהליך על ידי התאמת כל שורת סריקה לפונקציות פולינום פילוס. בצע הסר קו לסריקות שמאבדים קשר עם הקרום באמצעות תוכנת הקניינית של החברה לייצור AFM.
2. חיל ספקטרוסקופיה
   1. כייל את שלוחה ביצוע ההוראות על פי הפרוטוקול של היצרן. כיול מאפשר המרה של האות החשמלית של פוטודיודות לכוח (איור 1).
      1. לכייל את הרגישות של הקצה למדוד סטייה כתנועה Z-piezo (ביחידות של אורך) במקום אות חשמלי בוולט.
         הערה: AFM מזהה שינויים בסטייה של שלוחה באמצעות לייזר משתקפים בחלק האחורי של שלוחה. הלייזר מגיע photodiode שיכול לזהות מרחבית העמדה של נקודת הלייזר. שינוי בסטייה של שלוחה כפי שמתכופף במגע עם המדגם הוא זוהה על ידי photodiode זה כמו "סטייה אנכית", ואת זה הוא ביחידות של מתח. מאז שלוחה מועברת על ידי Z-piezo, ההטיה האנכית קשורה לתנועה בZ-piezo. היחס בין סטייה האנכית וZ-התנועה נקרא רגישות וממיר את המתח למרחק.
      2. חשב את קבוע קפיץ שלוחה בשיטת תדר רעש התרמית, בדרך כלל שולבה בתוכנת AFM. בשיטה זו, עלילה משרעת של רטט מרעש ביחס לתדירות של תנודה, יצירת עלילת צפיפות ספקטרלית כוח. עלילה זו תציג שיא סביב תדר התהודה. התדירות שבי אני משרעתזה הגדול ביותר הוא תדר התהודה. להתאים פונקציה הלורנצית סביב השיא לחשב את קבוע הקפיץ באופן אוטומטי על ידי התוכנה. כמה משאבים שימושיים לתאוריה של שיטת הרעש התרמית ניתנים באזכור ^27-30.
   2. לאחר ההדמיה על שטח של bilayer, בחר אזור x 5 מיקרומטר מיקרומטר 5 בbilayer לבצע כוח ספקטרוסקופיה.
   3. הגדרת AFM, כך שהוא לוקח עקומות כוח ב16 x 16 רשת של אזור זה. התוצאה היא 256 עקומות כוח לאזור. החלל שבין שתי נקודות הסמוכות צריך להיות מספיק כדי למנוע את זה באזור הקרום שחקר בנקודה אחת היה עולה בקנה אחד עם הנקודה הבאה. זה תלוי ברדיוס הקצה. מרחק 100 ננומטר בין שתי נקודות יהיה אידיאלי. לחלק x 5 אזור מיקרומטר מיקרומטר 5 ל- 16 x 16 רשת. בהתאם לגודל של השלב, ניתן לבחור אזור קטן יותר או גדול יותר, ולאחר מכן להתאים את גודל הרשת בהתאם.
   4. עקירת Z-piezo מוגדר400 ננומטר. זה קובע את הטווח המרבי של תנועה של Z-piezo. זה צריך להיות גדול מספיק כדי לוודא כי שלוחה חזרה בי משם באופן מלא מהמדגם בין מדידות.
   5. להגדיר מהירות גישה ל -800 ננומטר / sec ולחזור במהירות 200 ננומטר / sec. השתמש מהירות גישה בין 400 ל -6,000 ננומטר / sec תלוי בהרכב bilayer ושלב שומנים להיחקר ^6,16.
   6. לאחר הגדרת כל הפרמטרים, לרכוש עקומות כוח, על ידי לחיצה על הכפתור "הפעל" של תוכנת AFM.
   7. להציל את עקומות כוח ככוח מול עקומות גובה (מדד לתנועת Z-piezo). זה לא לוקח בחשבון את הכיפוף של שלוחה בעת מגע עם המדגם. במהלך שלב עיבוד הנתונים, התוכנה מאפשרת AFM תיקון לשלוחת כיפוף כדי לקבל כוח מול עקומות הפרדת קצה מדגם (איור 1 ג), אשר תיתן ערכים ראויים לעובי bilayer. ערכי התיקון בדרך כלל משולבים בcalibrני, שנשמר עם כל עקומת כוח. לחשב הפרדת קצה מדגם על ידי הפחתת ההטיה האנכית מתנועת piezo בנקודה מסוימת.
      הערה: השיא בעקומת כוח הגישה (ערך הכוח יורד גם אם תנועת שלוחה היא עדיין במחזור הגישה) הוא כוח פריצת הדרך של הקרום, ואילו ההבדל בין העמדה של שיא זה והמיקום של הנקודה שבו הכוח מתחיל לעלות שוב מספק העובי של הקרום.
   8. לרכוש לפחות 500 עקומות כוח לכל תנאים כדי לקבל נתונים סטטיסטיים טובים. העלילה היסטוגרמה של הערכים באמצעות תוכניות כמו מקור או Matlab, ולהתאים את היסטוגרמות להפצת גאוס כדי לקבל את השיא ורוחב של ההפצה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

bilayers נתמכת שומנים מורכבים מdOPC: SM: חול (2: 2: 1) היו צילם בAFM (איור 2 AC). בגלל הרכב השומנים בדם, _o L SM / חול עשירה ושלבי _ד L dOPC העשירים נצפו. פרופיל הגובה מהדמית AFM יכול לספק מידע חשוב על מבנה הקרום. על ידי הסתכלות על פרופיל הגובה, עובי bilayer ניתן למדוד בנוכחות של...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

SLBs המורכב מdOPC: SM: חול (2: 2: 1) נוצרו על נציץ לאחר ספיחת שלפוחית ​​וקרע שנגרם על ידי סידן כלורי. הרכב שומנים בדם זה מופרד לשלבי _ד L _וo L. שלב _o L מועשר בsphingomyelin וכולסטרול, והוא / (איור 1 א) נוזל צמיג פחות יותר מאשר שלב _ד L ^11. הפרדת _o L משל?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids, Inc.	850375P	Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Sphingomyelin (Brain, Porcine)	Avanti Polar Lipids, Inc.	860062P	Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Cholesterol	Avanti Polar Lipids, Inc.	700000P	Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Sodium chloride (NaCl), 99.8%	Carl Roth GmbH + Co. KG	9265.1
Potassium chloride (KCl), 88%	Sigma	P9541
Sodium hydrogenphosphate (Na2HPO4), >99%	AppliChem GmbH	A1046
Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4), 99%	Carl Roth GmbH + Co. KG	3904.1
Calcium chloride dihydrate (CaCl2), molecular biology grade	AppliChem GmbH	A4689
HEPES, molecular biology grade	AppliChem GmbH	A3724
Glass coverslip, 24 x 60 mm, 1 mm thickness	Duran Group	2355036
Punch and Die Set	Precision Brand Products, Inc	40105
Optical Adhesive	Norland Products, Inc.	NOA 88	Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light.
[header]
Mica blocks	NSC Mica Exports Ltd.		These are mica pieces at least 1 sq. inches in area and thickness ranging from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set.  Always handle mica with gloves or tweezers.
Laboratory Equipment Grease	Borer Chemie AG	Glisseal N
Liposome Extruder	Avestin	LiposoFast-Basic	As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc.
Adhesive Tape	3M	Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch)
Bath Sonicator	Bandelin Sonorex Digitec	DT-31	No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. (Data sheet)
Silicon Nitride AFM Cantilever	Bruker AFM Probes	DNP-10	Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60 nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m.
AFM	JPK	JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200