דור של, Nanocomposites יחס Scalable מתכתי גבוהה היבט בביולוגי נוזלי בינוני

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול לסנתז רומן, biocomposites יחס גבוה היבט בתנאים ביולוגיים ובתקשורת נוזלית. Biocomposites קנה מידה מננומטרים למיקרומטר בקוטר ואורך, בהתאמה. חלקיקי נחושת (CNPs) ונחושת גופרתית בשילוב עם ציסטין הם המרכיבים העיקריים לסינתזה.

Abstract

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את הסינתזה של שני biocomposites רומן עם מבני יחס גבוה היבט. Biocomposites מורכב מנחושת וציסטין, גם עם חלקיקי נחושת (CNPs) או נחושת גופרתית תורם הרכיב המתכתי. הסינתזה מתבצעת בנוזל בתנאים ביולוגיים (37 מעלות צלזיוס) וצורת מרוכבים עצמיים התאספו לאחר 24 שעות. ברגע שנוצר, חומרים מרוכבים אלה הם מאוד יציבים בשתי תקשורת הנוזלית ובצורה יבשה. חומרים מרוכבים בקנה מידה מננו למייקרו טווח אורך, ומכמה מיקרונים עד 25 ננומטר בקוטר. מיקרוסקופ אלקטרונים סורקים פליטת שדה עם ספקטרוסקופיה רנטגן נפיצה אנרגיה (EDX) הוכיח כי הגופרית הייתה נוכחת במבנים ליניארי נגזר-NP, בזמן שהוא נעדר מחומר CNP מתחיל, ובכך אישר ציסטין כמקור של גופרית בnanocomposites הסופי . במהלך סינתזה של ננו ומיקרו-חומרים מרוכבים ליניארי אלה, במגוון הרחב של אורכים של structures נוצר בכלי הסינתזה. Sonication של התערובת הנוזלית לאחר הסינתזה הודגם לסייע בשליטה בגודל ממוצע של המבנים על ידי צמצום האורך הממוצע עם זמן מוגבר של sonication. מאז המבנים נוצרו הם מאוד יציבים, לא מצבר, ונוצרים בשלב נוזלי, צנטריפוגה עשויה לשמש גם כדי לסייע בריכוז והפרדת חומרים מרוכבים נוצרו.

Introduction

Copper is a highly reactive metal that in the biological world is essential in some enzyme functions ^1,2, but in higher concentrations is potently toxic including in the nanoparticulate form ^3,4. Concern over copper toxicity has become more relevant as CNPs and other copper-based nanomaterials are utilized, due to the increased surface area/mass for nanostructures. Thus, even a small mass of copper, in nanoparticle form, could cause local toxicity due to its ability to penetrate the cell and be broken down into reactive forms. Some biological species can complex with and chelate metal ions, and even incorporate them into biological structures as has been described in marine mussels ⁵. In studying the potential toxic effects of nanomaterials ⁴, it was discovered that over time, and under biological conditions used for typical cell culturing (37 °C and 5% CO₂), stable copper biocomposites could be formed with a high-aspect ratio (linear) structure.

By a process of elimination, the initial discovery of these linear biocomposites, which occurred in complete cell culture media, was simplified to a defined protocol of essential elements needed for the biocomposites to self-assemble. Self-assembly of two types of highly linear biocomposites was discovered to be possible with two starting metal components: 1) CNPs and 2) copper sulfate, with the common biological component being cystine. Although more complex, so called “urchin” and “nanoflower” type copper-containing structures with nanoscale and microscale features have been previously reported, these were produced under non-biological conditions, such as temperatures of 100 °C or greater ^6-8. To our knowledge, synthesis of individual, linear copper-containing nanostructures that are scalable in liquid phase under biological conditions has not been previously described.

One of the starting materials utilized for synthesis of nanocomposites, namely CNPs, has been reported previously to be very toxic to cells ⁴. It has recently been reported that after the nanocomposites are formed, these structures are less toxic on a per mass basis than the starting NPs ⁹. Thus, the synthesis described here may be derived from a biological and biochemical reaction that has utility in stabilizing reactive copper species, both in the sense of transforming the NP form into larger structures and in producing composites less toxic to cells.

In contrast to many other nanomaterial forms which are known to aggregate or clump upon interaction with biological liquid media ^10,11, once formed, the highly linear composites described here avoid aggregation, possibly due to a redistribution of charge which has been previously reported ⁹. As detailed in the current work, this avoidance of aggregation is convenient for the purposes of working with the structures once formed for at least 3 reasons: 1) composite structures once formed may be concentrated using centrifugation and then easily dispersed again using vortex mixing; 2) formed structures can be decreased in average size by sonication for different periods of time; and 3) the formed linear structures may provide an additional tool for avoiding the recently described “coffee ring effect” ¹² and thus provide a dopant for creating more evenly distributed coatings of materials, especially those containing spherical particulates.

Protocol

1. תכנון של ניסויים

1. לקבוע את עוצמת הקול של nanocomposites הנחושת נחוץ לסינתזה. על בסיס זה, לבחור מספר צלוחיות הקטנות נפח (25 סנטימטר ^2), או צלוחיות גדולות יותר כמפורט להלן בהכנת חומרים.
2. לסינתזה זו, השתמש 37 ° C חממה עם 5% CO ₂ ולפחות 40% לחות. ודא שחממה כזה יהיה זמינה ושזה לא יפריע שוב ושוב על פני תקופה של סינתזה (כ 24 שעות).
   זהירות: פתיחה חוזרת וסגירה של החממה תהיה בהחלט לגרום לתנודות טמפרטורה שעלולה לגרום לסינתזת שינה של מבני nanocomposite.

2. הכנת חומרים

1. הכן את כל החומרים טריים לפני תחילת ניסוי, על ידי הוספת חומרים מוצקים לממסים ממש לפני הסינתזה היא להתחיל. שמירה על פתרונות מניות של חומרי ציסטין והתחלת נחושת בנוזל לפעמים ב ארוכהefore הניסוי אינו מומלץ ועלולים להוביל לתוצאות משתנים. פתח פעם אחת מהספק, ממשיך מתחיל חומרים יבשים על ידי עטיפה העליונה של המכל עם Parafilm.
   הערה: הפרוטוקול הבא משמש כדוגמא לתגובה בבקבוק תרבות ² תא 25 סנטימטר באמצעות 7 μl של ציסטין, 6,643 μl של מים סטריליים, ו -350 μl של CNPs.
2. הכן פתרון 2 מ"ג / מיליליטר של חלקיקי נחושת על ידי שקילה החוצה לפחות 2 מ"ג של CNPs. ללבוש כפפות חד פעמיות בשלב זה כדי למנוע מגע אפשרי של CNPs עם עור. מניחים את חלקיקים בבקבוקון זכוכית ריק מיליליטר 16 סטרילי.
   1. לבקבוקון המכיל CNPs, להוסיף מים ללא יונים סטרילי בנפח המתאים לעשות 2 מ"ג / מיליליטר פתרון ומערבולת הפתרון במשך 20 שניות כדי לספק פיזור של חלקיקים לפני תחילת סינתזה (נפח כולל לפחות 1 מיליליטר מומלץ). אין למלא יותר ממחצית דרך הבקבוקון עם מים כמו זה לעכב ערבוב על ידי vortexing. Wil CNPsl להתיישב במהירות לתחתית של הבקבוקון ויופיע בצבע כהה (אפור לשחור).
   2. Sonicate פתרון CNP במשך 17 דקות ב RT לספק פיזור מקסימאלי של CNPs לפני תחילת הסינתזה. מעת לעת לבדוק כדי לוודא שCNPs ערבוב בשל sonication. לאחר sonication מוצלח, CNPs להישאר תלוי בפתרון לפחות 30 דק 'והפתרון יהיה כהה בצבע.
3. לשקול את מסה מספקת של ציסטין לעשות פתרון / מיליליטר 72.9 מ"ג לסינתזה. מאז ציסטין הוא לא ישירות מסיס במים, הנח את ציסטין שקל בכלי במשקל אנטי-סטטית.
   1. לציסטין כלי במשקל המכיל, להוסיף נפח מספיק של סטרילי, 1 M NaOH, כך שציסטין מתמוסס לחלוטין. לדוגמא, לפזר 7.29 מ"ג של ציסטין לחלוטין בשל 1 M NaOH 100 μl, כדי להפוך את פתרון 72.9 מ"ג / מיליליטר.
   2. כדי לשמור על תנאים סטריליים, לבצע צעד זה במנדף תרבות זרימת רקמות סטריליים.
      זהירות: NaOHבריכוז 1 M הוא קאוסטית, כך ללבוש כפפות חד פעמיות בשלב זה כדי למנוע מגע של NaOH המרוכז עם עור
4. העבודה בברדס רקמת סטרילית תרבות, להוסיף 7 μl של ציסטין עם 6,643 μl של מים סטריליים לבקבוק סטרילי הסינתזה הראשונה, ולתת דגירה במשך 30 דקות בחממה על 37 מעלות צלזיוס עם כובע הבקבוק פרק (רופף) כדי לספק יעיל ערבוב. Resuspend 2 מ"ג / מיליליטר פתרון CNP ידי vortexing למשך 30 שניות, מאז CNPs יהיה התיישב אחרי צעד sonication.
   1. להוסיף פתרון CNP מספיק כדי בקבוק הסינתזה (באמצעות טכניקה סטרילית) כדי לשמור על יחסי הרכיב הבאים: לשלב ציסטין 1 חלקים, 50 חלקים CNPs, וחלקי 949 מים סטריליים בבקבוק תרבות ² תא 25 סנטימטר להתחיל הסינתזה. לדוגמא, עבור 7 מיליליטר סינתזת נפח, לשלב 7 μl של פתרון מניות ציסטין, 350 μl של CNPs, ו6,643 μl של מים סטריליים. החלף את הכובע על הבקבוק ולהדק כך שזה securדואר.
   2. לאחר שילוב כל הרכיבים לסינתזה, לערבב בעדינות בבקבוק על ידי מתערבל 4-5 פעמים. הנח בקבוק בחממת CO ₂ ולפרוק את הבקבוק על ידי שחרור הכובע כדי שיהיה חילוף גזים ובמתוך הבקבוק במהלך סינתזה.
5. לאפשר סינתזה לרוץ בחממה במשך כ 24 שעות. במהלך סינתזה, ניתן לראות, עם מיקרוסקופ ועל ידי עין, היווצרות של חומרים מרוכבים ליניארי מאוד.
   הערה: תהליך ההיווצרות של המבנים עלול לקרות פתאום במובן זה שהם מבנים בתחילה קשה לזהות, אז ההופעה ממשיכה במהירות להגדלת צפיפות. היווצרות לכן עשויה להתרחש לפני 24 שעות. התהליך יכול גם להיות שנצפה על ידי העין פעם המבנים הפכו גדולים יותר והעלייה בצפיפות שלהם. בעוד דור של המבנים ניתן לראות לאורך זמן מתחת למיקרוסקופ ולפי העין בנקודות זמן מאוחר יותר, ברציפות להפריע תנאי הסינתזה וטמפרטורה תוביל לענייםתוצאות סינתזה.
6. לסיים סינתזה של biocomposites ידי חוזקה מכסת בקבוק הסינתזה ואחסון הכלי במקרר (4 מעלות צלזיוס). המבנים, שנוצרו פעם אחת, יישארו יציבים בצורה זו לשנה לפחות. תווית הבקבוק עם תנאי סינתזה, כוללים רכיבים מנוצלים, תאריך של הסינתזה, וזמן דגירה של הסינתזה לפני הסיום.

3. סינתזה באמצעות נחושת גופרתית

1. לבצע סינתזת הרכבה עצמית על ידי החלפת CNPs עם מלח נחושת גופרתי. באמצעות טכניקה סטרילית, לפזר לפחות 2 מ"ג של נחושת גופרתית בנפח מספק של מים ללא יונים סטרילי כדי להפוך את פתרון 2 מ"ג / מיליליטר. גבישי נחושת גופרתי בקלות ללכת לפתרון בריכוז זה, אבל מערבולת הבקבוקון במידת צורך, ולבדוק על ידי העין על מנת להבטיח את כל הגבישים מתמוססים.
2. לאחר ההכנה של הנחושת גופרתית, לבצע סינתזה כפי שתואר לעיל, אך החלפת CNPs עם הנחושת גופרתית.
   הערה: nanocomposites התאסף עצמי באמצעות נחושת גופרתית כחומר מוצא נמצאו להיות הרבה יותר עקבי בצורה סופית מאשר למבנים מסונתזים מCNPs.
3. לסיים את הסינתזה של biocomposites נחושת גופרתי כלרוכבי CNP (שלב 2.6) ולאחסן אותם לטווח ארוך על 4 מעלות צלזיוס.

4. אפיון וטיפול בbiocomposites פוסט-סינתזה

1. לאפיין biocomposites נגזר מCNPs ומנחושת גופרתית על ידי מיקרוסקופ אור הלבנה ⁹ ועל ידי מיקרוסקופי אלקטרונים ^9.
   1. לאפיון ובדיקה של biocomposites פוסט-סינתזה ידי מיקרוסקופ אור הלבנה, להשתמש מיקרוסקופ הפוכה כחומרים מרוכבים יישבו למשטח התחתון של הבקבוק תוך כמה של הנחת הבקבוק שטוח דקות, ולאחר מכן ניתן הביא אל מוקד. השתמש בהגדרת השדה בהירה במיקרוסקופ כדי למקסם את הניגוד בין biocomposites והמדיום הנוזלי. חומרים מרוכבים הנגזרים מCNPs ושוטרלסולפט שניהם מופיעים ברורים לאטום בצבע, אבל אגרגטים CNP unreacted יופיעו כהים מאוד בצבע.
      1. השתמש במצלמה דיגיטלית המחוברת למיקרוסקופ כדי ללכוד תמונות של חומרים מרוכבים. מגוון של אורכים למבנים הבודדים יקויימו.
   2. לאפיון ובדיקה של biocomposites הודעה סינתזה ולאחר האחסון ב 4 ° C, לאפשר צלוחיות להגיע לRT לפחות 15 דק 'כצלוחיות יהוו עיבוי תחילה על ההסרה ממקרר, שלטשטש יעיל תוך התמקדות בעת ביצוע הדמיה מיקרוסקופית. לאחר מאפשר איזון לRT, לנגב את המשטחים העליונים ותחתונים של הבקבוק עם מגבת נייר נקייה על מנת למקסם את איכות הדמיה מיקרוסקופית.
   3. כאשר עובדים עם או הדמיה מרוכבים שאוחסנו לטווח ארוך, מערבולת הבקבוק למשך 30 שניות כדי לנתק גושים של חומרים מרוכבים היוצרים בזמן במקרר. לאחר vortexing, לבדוק את המבנים עם מיקרופון הפוךroscope כדי להבטיח שאגרגטים שניתקו, וחזור vortexing צורך.
   4. השתמש במיקרוסקופ אור הלבנה הפוכה כדי להעריך את היעילות של הסינתזה לניסוי נתון באמצעות CNPs. לדוגמא, לתעד את הנוכחות או עדר של CNPs unreacted בצלוחיות סינתזה המשמשות לbiocomposites נגזר CNP מצלוחיות עם פרמטרים שונים כגון זמן של סינתזה.
      הערה: פרט CNPs הם קטנים מדי כדי לצפות במיקרוסקופ אור, אבל CNP unreacted צובר יופיע כעגולה צורה וחפצים כהים, בניגוד לCNP-מרוכבים מסונתזים בהצלחה שיש יחס גבוה היבט, טופס ליניארי, ו יהיה מגוון של אורכים שונים. להתחמק מביצוע סינתזה במשך זמן רב מדי של זמן לפני הסיום, כמו זה יגרום מסועף מאוד מבנים מסוג "קיפודים", שהם קשים לפיזור למבנים בודדים יצרו פעם.
   5. השתמש במיקרוסקופ אור הלבן הפוכה להעריך את היעילותשל הסינתזה לניסוי נתון באמצעות נחושת גופרתית. מאז נחושת גופרתית הולך באופן מלא לפתרון באמצעות פרוטוקול זה, הפתרון יופיע פחות כהה מאשר הפתרון מסינתזה באמצעות CNPs. לתעד את הגודל ומידה של חומרים מרוכבים נחושת גופרתית על ידי השוואת צלוחיות עם תנאי סינתזה שונים כגון זמן של סינתזה לפני הסיום.
      הערה: חומרים מרוכבים מסונתזים בהצלחה יציגו מגוון של אורכים שונים. להתחמק מביצוע סינתזה במשך זמן רב מדי של זמן לפני הסיום, כמו זה יגרום באגרגטים מסועפים מאוד של חומרים מרוכבים, שחלקם יהיו "כמו קיפודים-" במבנה, ואשר קשים לפיזור למבנים בודדים שנוצרו ברגע ש .
2. להתרכז biocomposites הודעה סינתזה-, פתרונות צנטריפוגות של חומרים מרוכבים בצינור צנטריפוגות. הוסף 6 מיליליטר של או מבנים נגזר CNP או מבנים הנגזרים נחושת גופרתית לצינור צנטריפוגות 15 מיליליטר. צנטריפוגה למשך 10 דקותב XG 500 ב RT לצורה כדורית. עבור אמצעי אחסון קטן יותר, להוסיף 500 μl של מבנים בפתרון 0.6 מיליליטר צינורות בגודל. צנטריפוגה XG ב 2000 ב RT לפחות 10 דקות כדי ליצור גלולה.
   1. לאחר צנטריפוגה למספיק זמן (לפחות 10 דקות לmicrofuges), להציל את הכדור לצפייה בחלק התחתון של הצינור שבו המבנים מרוכזים על ידי הסרת נוזל supernatant מעל גלולה בזהירות. מבני biocomposite נגזרים מנחושת גופרתית מופיעים בצבע כחול ומבנים הנגזרים מCNPs כהים (אפורים לשחור).
   2. הוסף עוד חומרים מרוכבים לצינור זה ולחזור על התהליך באותו הצינור להתרכז מבנים אם תרצה בכך. כדי לפזר את כדורים מרוכזים, להוסיף נפח הרצוי של פתרון לצינור, ומערבולת למשך 10-30 שניות.
3. מבני Sonicate יצרו פעם אחת, כדי להעביר את הגודל הממוצע אוכלוסייה (אורכים) של המבנים להורדת ערכים. מבני מקום במים סטריליים deionized וsonicate בleAST 10 דקות. באמצעות תהליך זה, לאורך זמן, המבנים הופכים למפוצלים וקטנים יותר באורך ממוצע (ראה איור 6 של הטקסט). שינויים במסמך בגדלים מורכבים עם פעמים sonication שונות באמצעות מיקרוסקופ הפוכה אור לבנה ומצלמה דיגיטלית.

תוצאות

איור 1 מציג תרשים זרימה סכמטי של הצעדים כדי ליצור סינתזת biocomposites יניארי המתואר בעבודה זו. CNPs או נחושת גופרתית כמתחיל חומרים בשילוב עם מים סטריליים כדי ליצור פתרון 2 מ"ג / מיליליטר, פתרון זה הוא מעורב וsonicated לספק אפילו תערובת, ופתרון נחושת זה הוא מעורב אז ביחס ...

Discussion

תוך הערכת השפעות רעילות פוטנציאליות של ננו כולל CNPs, זה היה ציין כי בטווח הארוך, CNPs הפכו מהפצת חלקיקים בתחילה יותר מפוזרת לצורה גדולה יותר, מצטברת (איור 2). במקרים מסוימים, תצורות מצטברות מאוד אלה שיוצרו בצלחת תרבית תאים, בתנאים ביולוגיים, יצרו תחזיות ליניארי ב?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mini Vortexer	VWR (https://us.vwr.com)	58816-121
CO2 Incubator Model # 2425-2	VWR (https://us.vwr.com)	Contact vendor	Current model calalog # 98000-360
Eppendorf Centrifuge (Refrigerated Microcentrifuge)	Labnet (http://labnetinternational.com/)	C2500-R	Model Prism R
Cell Culture Centrifuge Model Z323K	Labnet (http://labnetinternational.com/)	Contact vendor	Current model Z206A catalog # C0206-A
Sonicator (Ultrasonic Cleaner)	Branson Ultrasonics Corporation (http://www.bransonic.com/)	1510R-MTH
Balance	Sartorius (http://dataweigh.com)		Model CP225D similar model CPA225D
Olympus IX51 Inverted Light Microscope	Olympus (http://olympusamerica.com	Contact vendor
Olympus DP71 microscope digital camera	Olympus (http://olympusamerica.com	Contact vendor
external power supply unit - white light for Olympus microscope	Olympus (http://olympusamerica.com	TH4-100
10X, 20X, and 40X microscope objectives	Olympus (http://olympusamerica.com	Contact vendor
Scanning Electron Microscope	Hitachi (http://hitachi-hitec.com/global/em/sem/sem_index.html)	model S-4800
Transmission Electron Microscope	Zeiss (http://zeiss.com/microscopy/en_de/products.html)	model Libra 120
Table Top Work Station Unidirectional Flow Clean Bench	Envirco (http://envirco-hvac.com)	model PNG62675	Used for sterile cell culture technique