מישורי צבע מערכת דיפוזיה לחקירת Chemotaxis בקולגן מטריקס 3D

Summary

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Abstract

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Introduction

התנועה העדיפה תאי כיוון מפל ריכוזים, הידוע בשם chemotaxis, ממלאת תפקיד חשוב בתהליכים פתולוגיים ופיסיולוגיים בגוף. דוגמאות כאלה הן ריפוי עור ורירית פצע ^1, המורפוגנזה ^2, דלקת ^{3, ו4,5} צמיחת גידול. כמו כן, הוכיח כי תאים סרטניים יכולים לנדוד דרך שתי אסטרטגיות תא-ההגירה האישיות וקולקטיביות ^6. יתר על כן, מנגנוני חוסר יציבות diffusional יכולים לגרום להפרדה של תאים בודדים או התקבצו מגוף / אובייקט tumorous ואז יכול לעלות לכיוון מקור של חומרים מזינים ובכך לפלוש אזורים ורקמות ⁷ רחבים יותר.

יתר על כן, הוכיח כי מנגנוני הגירה מגוונים יכולים להיות פעילים ב2D וב3D, בשל תפקידים שונים של מולקולות הידבקות ^8. לכן, מעבר לרלוונטי מבחינה פיזיולוגית במבחני מבחנה לחקור תנועתיות תא בmeasureablדואר ודרך פשוטה הוא בעל משמעות בהבנת תנועת תא תופעות ^9. למרבה הצער, הקושי בניתוח נדידת תאים, assay chemotaxis כימות מקיף בדרך כלל דורש שיטה מייגע ארוכה, שנוסדה על המדידה של דגמי תנועתיות תא ותופעות תחבורה נטולי פניות.

גישות ניסיוניות עבר לחקור chemotaxis תא כוללות תא וידן ¹⁰ ומתחת assay agarose ^11. עם זאת, בתוך מבחני המוקדמים אלה, ניסויי נדידת תאים לא לפקח על התנועה בכבוד לעת. יותר, וחשוב, הדרגתיים ריכוז המשמש לניסויים אינם מוגדר היטב או מובן לחלוטין תוך שמירת האיתות ללא יותר מכמה שעות בלבד. יתר על כן, ניסיונות קאמריים chemotaxis מוקדם מוגבלים נדידת תאים לשני ממדים ולא לאפשר אחד כדי לפקח על קינטיקה של הגירה ^12. מסתכל על חדר בוידן, assay נקודות קצהלא יאפשר לחוקר לבחון הגירה מבחינה ויזואלית ולא יכל להבחין ישירות chemotaxis (תנועה כיוונית) מchemokinesis (תנועה אקראית). בנוסף, מספר משתנה-הבדלים בגודל הנקבובית ועובי של קרומי תוצרת קאמריים קשה מאוד לשחזר בקלות והסתירו את התגובה של תאים זרות לכמוקינים ^13,14.

עם ההבנה החדשה של מיקרופלואידיקה, תאים חדשים ומיקרו-מכשירים נחקרו ככלי לחקור תנועת תא תחת תנאי זרימת ביניים או Chemotaxis ^15,16. תחת מכשירים החדשים אלה, מדדי תא חדשים הוכנסו ונחקרו, כמו ההשפעה של לחץ גזירה על תא ^17,18. לרוע המזל, תאי chemotaxis microfluidic עבר ובהווה מוגבלים מחקרים של נדידת תאים למצעים-2D נסיגה חשובה שכן רבים תהליכים ביולוגיים, כוללים פלישת תאים סרטניים וגרורות, וimנדידת תאי mune, כרוכה הגירת 3D.

תאים-בי תצפית ישירה פתרון chemoattractant הוא במגע עם ג'ל 3D המכיל תאים יש גם דיווחו גם ^19,20. יש תאים אלה שני תאים, אחד המכיל chemoattractant ואחד המכיל תאים, הם הצטרפו לצד אחד את השני בצורה אופקית ²¹ או כטבעות קונצנטריות ^22. מערכות אלה הצביעו בכיוון הנכון, אבל לא שומרות מערכת chemotaxis לתקופה ארוכה של זמן.

יתר על כן, חוקרים בחנו גם diffusivity דרך קרומי תאי קולגן בדיאליזה, כמו גם דיפוזיה של מולקולות נותב דרך דגימות קולגן נתון ללחץ ההידרוסטטי ^23-25. ניסויי דיפוזיה חלק בג'ל קולגן להסתמך על שינויים פיזיים וכימיים של ג'ל באמצעות שדות מגנטיים והתאגדות כימית ^26. שיטה פופולרית לדוגמנות diffusivity בcollaרקמות genous מסתמכת על ההדמיה הקרינה של photobleaching נקודה הרציף. שיטה זו חשפה אנאיזוטרופיה במקדמי דיפוזיה של מולקולות גדולות ברקמות collagenous בכיוון. ובכל זאת, photobleaching נעשה שימוש בסחוס במפרק ולא קולגן מטריצות. בעוד דומה, חייבים להתבצע ניסויי דוגמנות צורך בהבנה במיוחד מקדם דיפוזיה של ג'ל קולגן. וחשוב יותר, המערכות לא לנצל שיטה למדידת דור כוח התא.

למרבה הצער, רוב המערכות נראות חסרות מרכיבים מרכזיים אחד או שתיים למערכת אידיאלית: מאפשרים מעקב של תא, הבנת שיפוע דיפוזיה עם גורם chemotactic באמצעות המטריצה, להגדיר פשוט יחסית עם הקלות של שחזור, מזעור תאי תאים אינטראקציות, ואת היכולת למדוד יחידות ממדיות לכימות (כלומר, מהירות, כוח, ריכוז ספציפי). Moghe et al. ²⁷ הציע מערכת שמלאה את רוב הדרישות אלה שבתאים היו בתחילה מפוזרים בג'ל ולא התרכזו בשטח המסנן, אבל היה קשה למדוד כוחות שהתא מייצר.

למטרה זו, אנו מציגים מערכת דיפוזיה השיפוע מישוריים לחקור chemotaxis במטריצת קולגן 3D, המאפשר לאדם להתגבר על מגבלות תא דיפוזיה מודרניות של מבחני קיימים, המבוסס על מיקרוסקופיה זמן לשגות, בשילוב עם טכניקות ניתוח תמונה למדוד תא כוחות בסביבת 3D. פרוטוקול זה מספק דרך פשוטה, עדיין חדשנית של יצירת תא דיפוזיה פשוטה 3D שיכול לשמש כדי לחקור chemotaxis 3D בתאים שונים.

Protocol

עיצוב עובש 1. 3D וחלקים

1. עובש
   1. לפני העבודה, לקבל ערכת אלסטומר סיליקון, חדר הדמיה תא חי, coverslip זכוכית 22 מ"מ, וקוביית מתכת אלומיניום במכונה עם ממדים 10.07 מ"מ x 3.95 מ"מ x 5.99 מ"מ. הכן את חדר ההדמיה תא החי לדפוס על ידי הצבת coverslip בבעל תחתית והרכבה שאר הקאמרית בבימויו של כספק.
   2. בשלב הבא, באמצעות מלקחיים, למקם את קוביית מתכת ואלומיניום במכונה באמצע דיור תא ההדמיה תא החי ועל גבי coverslip, ולאחר מכן מניח בצד.
   3. מערבבים פתרונות אלסטומר סיליקון על פי הפרוטוקול של היצרן לעשות 5 מיליליטר של אלסטומר.
   4. , בעזרת מרית מעבדה חד פעמית לשפוך פתרון אלסטומר סיליקון להתקנת תא הדמיה תא חי ולהבטיח שלא להזיז קוביית מתכת ואלומיניום במכונה ממוקמת. הנח את המערכת על ספסל המעבדה, בO בטוח מיקום / N לריפוי.
   5. למחרת בבוקר, לפרקחדר ההדמיה תא החי, כפי שהומלץ על ידי היצרן ולשלוף עובש באמצעות מלקחיים. בעזרת מלקחיים, לחלץ בזהירות קוביית מתכת ואלומיניום במכונה מעובש. עבור לכיור ולשטוף את התבנית עם מים ללא יונים. מניחים את התבנית על מגבת נייר לייבוש.
   6. לאחר יבש, באמצעות סכין שירות תחביב, לחתוך חריצים באמצעות העובש, במרווחים של 2.34 מ"מ מכל צד אורך, בתוך תבנית סיליקון. ודא שהיות העובש במקום בטוח ויבש עד שיהיו מוכנים לבנות המערכת לניסוי.
2. הידרופילי והידרופובי זכוכית Coverslips הכנה
   1. כדי לאפשר את מטריצת קולגן לדבוק פני השטח, ליצור coverslips הידרופילי:
      1. בעזרת פיפטה חד פעמית, למדוד את 150 μl של 3-aminopropyl-trimethoxysilane ויוצקים פתרון בצינור 50 מיליליטר. להוסיף 30 מיליליטר של אתנול 100% לצינור 50 מיליליטר עם טפטפת חד פעמי שני ולסגור את המכסה. מערבולת הפתרון עבור 2 דקות, כדי להבטיח ערבוב מלא. Pהפתרון שלנו בצלחת פטרי מזכוכית ומניח בצד.
      2. יוצקים 15 מיליליטר של 100% אתיל אלכוהול בצלחת פטרי שנייה ומניח בצד (לוודא לתייג מנות).
      3. בעזרת פיפטה חד פעמית חדשה, למדוד את 30 מיליליטר של מים ללא יונים ויוצקים פתרון לתוך צינור 50 מיליליטר. בשלב הבא, באמצעות מדד פיפטה חד פעמי חדש מתוך 1,875 μl של glutaraldehyde ויוצקים פתרון לתוך צינור 50 מיליליטר ולסגור את המכסה. מערבולת הפתרון עבור 2 דקות, כדי להבטיח ערבוב מלא. יוצקים את התערובת לתוך צלחת פטרי שלישית, ומניח בצד.
      4. בעזרת מלקחיים, להוציא coverslip זכוכית עגולה 22 מ"מ אחד ולשטוף שני הצדדים עם 100% תערובת אתנול באמצעות פיפטה חד פעמית.
      5. מניחים coverslip זכוכית שטף לתוך 3-aminopropyl-trimethoxysilane עם 30 מיליליטר של 100% אתנול צלחת פתרון ולאפשר לשבת בפתרון במשך 5 דקות.
      6. עם מלקחיים, להוציא coverslip זכוכית ולשטוף שוב עם 100% פתרון אתנול עם פיפטה חד פעמית.
      7. זרוק coverslip זכוכית שטוף ל1,875μl של glutaraldehyde ו -30 מיליליטר של תערובת מים ללא יונים ומניחים בצד למשך 30 דקות.
      8. לאחר 30 דקות, להסיר את coverslip זכוכית עם מלקחיים ולשטוף עם מים ללא יונים ומניח על גבי O רקמה היבש / N לייבוש על RT.
      9. טבילה חוזרת coverslip ומרגש עבור coverslips לפי צורך עם הפתרונות שנוצרו זהים.
   2. הפוך coverslips הידרופובי על ידי הפרוטוקול נתון.
      1. הוסף 500 μl של tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl, של חומצה אצטית 100 μl ו19.4 מיליליטר של הקסאן בצינור 50 מיליליטר ומערבולת למשך 2 דקות. יוצקים פתרון בצלחת פטרי מזכוכית ומניח בצד.
      2. בעזרת מלקחיים נקיים, להוציא coverslip כוס אחת ושחרר לפתרון מעורב הכין עבור 2 דקות. לאחר 2 דקות חלפו, להוציא coverslip זכוכית עם מלקחיים ולשטוף עם מים ללא יונים באמצעות coverslip פיפטה והמקום הפנוי על O רקמה היבש / N לייבוש על RT. coverslip חנות בצלחות פטרי פלסטיק עד שימוש.
      3. DIPP coverslip חזורing ומרגש עבור coverslips לפי צורך עם הפתרונות שנוצרו זהים.

עצרת 2. עובש

1. לפני שימוש בתבניות, באמצעות פיפטה חד פעמית לשטוף את התבנית עם 90% אתיל אלכוהול על מיכל פסולת כימי. בשלב הבא, למקם את התבנית בצלחת פטרי מלאה במים ללא יונים ולאפשר לשבת O / N.
2. קח עובש מהפתרון באמצעות מלקחיים ומניחים על מגבת לייבוש באוויר לפני שמתחיל ההרכבה העובש.
3. בעוד העובש הוא אוויר ייבוש, לחתוך את coverslips הידרופילי הריבוע לשני מלבנים מעט הגדול יותר 3.95 מ"מ x 5.99 מ"מ באמצעות כלי scribing יהלומי דיוק גבוה. להחליק כל coverslip מלבן לחתוך לתוך החריצים לחתוך לתוך תבנית סיליקון.
4. הפוך את התבנית הפוכה ולמרוח משחה ואקום לאורך תחתית תבנית סיליקון באמצעות פיפטה חד פעמית. בשלב הבא, להפוך את התבנית בחזרה בצד ימני ולחץ על תחתית התבנית על גבי מכסה הזכוכית הידרופילי המעגלימס שפות כדי ליצור חותם.
5. עם כפפות חד פעמיות, להרים את העובש התאסף ומקום לתוך צלחת פטרי חד פעמית ולאחר מכן ליו-מכסה המנוע. הפעל מנורת יו-ברדס UV במשך שעה 1 לעקר את התבנית לפני ניסויים מתרחש.

3. תערובת קולגן ו3D מטריקס

1. לפני הכנת תערובת קולגן, הכתם ולהכין תאים להדמיה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים ^28.
2. באמצעות שימוש בטכניקות מעבדה סטנדרטית ופרוטוקולים ^29,30, ביו-מכסה המנוע, לערבב תקשורת סלולארי וchemoattractant בצינור 15 מיליליטר לריכוז chemoattractant רצוי. פיפטה 5 מיליליטר של תמיסת ריכוז תאים ספציפית מדיה-chemoattractant לתוך צינור 15 מ"ל ולהעביר את הפתרון לתוך אמבט מים מחומם.
3. בעזרת פיפטה, לחלץ 5 מיליליטר של תקשורת סלולארי רק לתוך צינור 15 מיליליטר שני ומקום באמבט מים מחומם כדי לחמם את הפתרון לניסויים במיקרוסקופ.
4. ביו-למכסה המנוע, 30 μl פיפטה של ​​10x חיץ פוספטפתרון אד (PBS) לתוך צינור צנטריפוגות מיקרו. הוסף 6 μl של הידרוקסיד נתרן 1 N (NaOH) לאותו צינור צנטריפוגות מיקרו ומערבולת למשך 15 שניות.
5. השג פתרון זנב עכברוש אני קולגן מהמקרר ולעבור ליו-מכסה המנוע תוך שימוש בטכניקות מעבדה סטנדרטית ופרוטוקולים ^29. ודא קולגן הוא עדיין קר. פיפטה 168.3 μl של קולגן לאותו צינור צנטריפוגות מיקרו.
6. לאחר מכן, להוסיף 18 μl של microspheres-שונה carboxylate ניאון צהוב-ירוק בעזרת פיפטה לאותו צינור צנטריפוגות מיקרו. מערבולת צינור צנטריפוגות מיקרו עם כל הפתרונות למשך 30 שניות.
7. להוסיף 77.7 μl של תערובת מדיה-תא תא רצוי (כ 2 x 10 ⁶ תאים / מיליליטר ריכוז) לצינור צנטריפוגות מיקרו ולערבב באמצעות קצה פיפטה במשך 20 שניות. במידת צורך, לשנות את צפיפות המטריצה ​​על ידי ביצוע תערובת קולגן המותאם אישית מותאמת לתוספת של חרוזי ניאון ושולחן כדאיות תא (טבלה 1).
8. פיפטה 300 & #181; L של תערובת קולגן תאים למרכז היטב (גם מס '2) של ההרכבה העובש מוכנה. מניחים את התבנית על צלחת פטרי חד פעמית ולהעביר אותו לחממה סטנדרטית עבור 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO _2.
9. הסר מערכת מהחממה ולמקם בחזרה ליו-מכסה המנוע. בעזרת מלקחיים, להסיר את שני התלושים לכסות הידרופובי על ידי כיווץ על החלק העליון של כל coverslip ומושך כלפי מעלה והרחק מהתבנית.
10. הזז את המערכת כולה למיקרוסקופיה ותמונה הרצויות על מנת להבטיח צדדים עובש קולגן עדיין ישר, כדי לאפשר שיפוע דיפוזיה מישוריים.
11. עם המערכת עדיין מתחת למיקרוסקופ, באמצעות פיפטה ערוץ יחיד 100 μl, להוסיף מדיה תא 100 μl ולמס '1. בשלב הבא, בעזרת פיפטה ערוץ יחיד 100 μl להוסיף של תקשורת תא עם ריכוז chemoattractant רצוי 100 μl ולמס '3.
12. מייד לאחר הוספת פתרונות לשתי הבארות, להתחיל הדמיה.

4. הדמיה ודיפוזיהדוגמנות

1. אם אחד לא רוצה למצוא את מקדם הדיפוזיה לצפיפות קולגן הספציפי כדי לחשב את הריכוז המסוים, בצע את הפרוטוקול שלהלן:
   1. בצע את הפרוטוקול שניתן לעיל תחת הכותרת "תערובת קולגן ו3D מטריקס," במקום לייצר תקשורת תא עם ריכוז chemoattractant רצוי, לעשות rhodamine 5 מיקרומטר בצינור 15 מיליליטר באמצעות חישובים ופרוטוקולים סטנדרטיים ^30.
   2. תמונת מטריצות קולגן 3D עם מערכת confocal רכובים על מיקרוסקופ הפוכה באמצעות לייזר ארגון (488 ננומטר) כדי ללכוד את הקרינה. תמונה כל שניות 2 או 3 עד 7 שעות.
2. לדוגמנות דיפוזיה: שימוש במודל המתמטי שמוצג להלן, לכתוב קוד תוכנה חישובית לעיבוד וניתוח בצעדים הכלליים אלה.
   
   1. יבוא תמונות לתוך תוכנה חישובית לrescaling ונרמול ידי inten המרביסיטי. המרת תמונות לצבע מפה אפורה של התמונה כדי לבחור את הקצה. בחר ציר לאורך מרכז התמונה, מימין למרכז ושמאלה מהמרכז.
   2. שימוש בקוד התוכנה חישובית, העלילה העצמה המנורמלת, יחד עם עוצמת האמיתית וההבדל בין שתיים.
   3. בשלב הבא, קלט הפרמטרים הדרושים להרכבה (ריכוז, זמן, ואורך).
   4. עלילה הריכוז המנורמל לעומת זמן ופרופיל הריכוז על פני ציר x עם פולינום לנכון את הנתונים.
   5. לחשב את מקדם דיפוזיה באמצעות קוד התוכנה חישובית.

5. מדידות ניסויי

1. בהתייחסו בחזרה למשוואת דיפוזיה, לשכתב את המשוואה כדי למצוא את הריכוז הספציפי בכל מקום במערכת כפי שמוצג בהמשך.
   
   איפה:
   L = אורך של המטריצת קולגן דואר
   x = מיקום תחת חקירה
   D = מקדם דיפוזיה
   t = זמן שחלף
2. במהלך ניסויי chemotaxis, להבטיח להקליט זמן המסוים שchemokine הרגע התווספה למערכת. ברגע שתנועת נדידת תאים נמצאת, להבטיח להקליט הקלטת הזמן לשגות confocal, ושים לב לזמן מסוים ומיקום מהקצה שבו התרחש הדמיה.
3. במהלך ניתוח הנתונים, לחבר את ציין שחלף הזמן, מיקום ומקדם דיפוזיה לתא הספציפי למשוואה כדי למצוא את הריכוז הספציפי המנורמל בכל נקודה בתוך קולגן עבור דיפוזיה וניסויים תא.

6. נדידת תאי מעקב ניצול TFM

1. כדי לעקוב אחר נדידת תאים תוך שימוש בטכניקות TFM / DVC לעקוב אחר הפרוטוקול להלן:
   1. לאחר התוספת של ריכוז chemoattractant רצוי ולמס '3, להתחיל הדמיה מטריצות קולגן 3D עם מערכת confocal רכובה על MICR הפוךoscope למצוא תא לחקור.
   2. ברגע שתא נע נמצא, למקם את התא באמצע שדה הראייה ולנצל מנוע פיזואלקטריים (לתמונה בציר z), תמונה כל דקות 1 או 2.
   3. לחישוב דור כוח התא ועיוות, ליצור קוד חישובית כדי למצוא את ההתקות של חרוזים הקרינה הבאים פרוטוקולי TFM / DVC ^31.

תוצאות

היכולת של assay זה להעריך את ההגירה של התאים במדויק מסתמכת על הגדרה טובה של המערכת. לכן, זה קריטי עבור לוודא לעצב את תבנית מערכת דיפוזיה מדויקת ודואגים גדולים בהצבת coverslips שני הידרופובי והידרופילי, כפי שמודגם באיור 1. אם המערכת מתוכננת כראוי ובשלב דוגמנות דיפוזי...

Discussion

השלבים הקריטיים ביותר לניסויי דיפוזיה מוצלחים עם או בלי תאים הם: כראוי הקמת ההרכבה העובש; פיתוח המיומנות הידנית הנחוצה כדי למנוע נזק במהלך החילוץ של coverslips הידרופובי; הבטחה למצוא קו זינוק ליניארי טוב מאוד כדי לחשב את מקדם הדיפוזיה כראוי; לתקן חישובים ניסיוניים של שני ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silicone elastomer kit	Dow Corning Corp	182 SIL ELAST KIT .5KG	a two-part misture with a 10:1 mix
Live cell imaging chamber	Live Cell Instrument	CM-B18-1	CMB for 18 mm round coverslips
22 mm Glass Coverslip	Fisher Scientific	NC0180281	Neuvitro Corp. cover slip 22 mm 1.5
Machined aluminum metal cube
Hobby utility knife	X-Acto	X3201
3-(aminopropyl) trimethoxysilane	Sigma-Aldrich	281778-5ML
Glutaraldehyde	Polysciences, Inc	00216A-10	Glutaraldehyde, EM Grade, 8%
50 ml tube	Fisher Scientific	14-432-22	Standard floor model and tabletop centrifuges
Glass Petri dish	Fisher Scientific	08-747A	Reusable Petri Dishes: Complete (60 x 15 mm)
Forceps	Fisher Scientific	22-327-379	Fine Point Forceps
Cover glasses	Fisher Scientific	12-518-105A	Rectangle; 30 x 22 mm; Thickness No. 1
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl	Gelest	SIT8174.0
Acetic acid	Sigma-Aldrich	320099	Acetic acid ACS reagent, ≥99.7%
Hexane	Sigma-Aldrich	296090	anhydrous, 95%
Ethyl alcohol	Sigma-Aldrich	E7023	200 proof, for molecular biology
High-precision diamond scribing tool	Lunzer	PV-081-3	Straight extended tip scribe, .020" (.50 mm) diameter by .200" (5.0 mm) tip length
Vacuum grease	Dow Corning	14-635-5C	High-Vacuum Grease
15 ml tube	Fisher Scientific	14-959-49D	15 ml conical centrifuge tubes with hydrophobic, biologically inert surface
10x phosphate buffered solution	Fisher Scientific	BP399-500	1.37 M Sodium Chloride, 0.027 M Potassium Chloride, and 0.119 M Phosphate Buffer
1 N sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	38215	Sodium hydroxide concentrate
Collagen I, rat tail	BD Biosciences	354236	Rat tail
Micro centrifuge tube	Fisher Scientific	02-681-332	Volume: 2.0 ml; O.D. x L: 13 x 40 mm; sterile; single-wrapped
[header]
Carboxylate-modified microspheres	Invitrogen	F-8813	Carboxylate-modified microspheres, 0.5 µm, yellow-green fluorescent (505/515), 2% solids
Rhodamine	Sigma-Aldrich	83689	Rhodamine B for fluorescence