JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology.

Abstract

בדיקת רגישות מיקרוביאלית (AST) מתבצעת על מנת להעריך את הפעילות במבחנה של סוכני מיקרוביאלית נגד חיידקים שונים. תוצאות AST, שבאות לידי ביטוי כריכוזים מעכבים מינימליים (מיקרופונים) משמשות במחקר לפיתוח ולניטור מיקרוביאלית של פיתוח עמידות ובהגדרה הקלינית להדרכת טיפול אנטיביוטיה. Dalbavancin הוא סוכן מיקרוביאלית lipoglycopeptide חצי סינטטי שאושר מאי 2014 על ידי מנהל המזון והתרופות אמריקניות (FDA) לטיפול בדלקות עור ומבנה עור חיידקים חריפים הנגרמות על ידי אורגניזמים גרם-חיוביים. היתרון של dalbavancin על טיפולים אנטי-staphylococcal הנוכחיים הוא זמן מחצית החיים הארוכים שלה, המאפשר למינון של פעם בשבוע. יש Dalbavancin פעילות נגד Staphylococcus aureus (כולל שני וmethicillin-רגיש S. aureus [MSSA] methicillin-resistant S. aureus [MRSA]) staphylococci, coagulase-שלילי, סטרפטוקוקוס anginosus, סטרפטוקוקוס β-המוליטית וenterococci רגיש vancomycin. בדומה לסוכנים אחרים האחרונים lipoglycopeptide, אופטימיזציה של שיטות בדיקת רגישות CLSI ומרק ISO כולל את השימוש של sulfoxide דימתיל (DMSO) כממס בעת הכנת פתרונות מניות וpolysorbate 80 (P80) כדי להקל על דבקותו של הסוכן לפלסטיק. לפני המחקרים הקליניים ובפיתוח הראשוני של dalbavancin, מחקרי רגישות לא בוצעו תוך השימוש בP-80 ותוצאות MIC נטו להיות גבוה פי 2-4 ובאופן דומה הגבוה MIC תוצאות שהושגו עם שיטת רגישות הדילול אגר. Dalbavancin נכלל לראשונה בשולחנות מתודולוגיה microdilution מרק CLSI בשנת 2005 ותוקן בשנת 2006 כדי להבהיר שימוש בDMSO ו- P-80. Microdilution מרק ההליך (BMD) מוצג כאן הוא ספציפי לdalbavancin והנו בהתאם לשיטות CLSI ו- ISO, עם פירוט וfoc צעד-אחר-צעדשלנו בשלבים הקריטיים הוסיף לבהירות.

Introduction

Dalbavancin הוא lipoglycopeptide חצי סינטטי שאושר על ידי ה- FDA מאי 2014 לטיפול בדלקות עור ומבנה עור חיידקים חריפים הנגרמות על ידי אורגניזמים גרם-חיובי 1. המטרה העיקרית של שיטה זו מפרטת בפורמט וידאו היא לספק הדרכה ברורה למדענים במעבדה ומחקרים הקליניים לבדיקה ודיווח של תוצאות רגישות dalbavancin מדויקות ושחזור.

הנחישות של סוכן מיקרוביאלית MIC בשיטות מסחריות מבוצעת באופן שגרתי במעבדות קליניות להערכת הפעילות במבחנה של סוכן נגד חיידקים פתוגניים. השיטה המתוארת כאן היא שיטת microdilution מרק כפי שהומלץ על ידי CLSI וISO 2,3,4. מאז dalbavancin שיטות רגישות מסחריות אינן זמינות כעת (בזמן של פרסום זה) ודיפוזיה דיסק ושיטות דילול אגר אינם מומלצים F כרגעאו dalbavancin, שיטות דילול מרק התייחסות הן האפשרויות הזמינות הנוכחיות 12,14. כשיטת התייחסות זו היא לא מסחרית וFDA פינה במבחנה שיטת אבחון, מעבדות קליניות בארה"ב המשתמשת בהליך זה לבדיקת מטופל חייב לציית לדרישות הרגולטוריות לבדיקת מעבדה פיתחה (LDT). זה צפוי כי ככל שעולה שימוש dalbavancin, תהיה יותר מעבדות צורך לבדוק מתחם זה. בדיקות Vancomycin כתחליף לקביעת רגישות dalbavancin של ס aureus אומת 5. עם זאת, dalbavancin עשוי להיות פעיל נגד ס ביניים vancomycin aureus (ויזה) ולכן, רופאים יכולים לבקש תוצאות MIC dalbavancin. בנוסף, תוצאות MIC למיני חיידקים אחרים ניתן לבקש.

נקודת העצירה רגישה FDA לdalbavancin נגד ס aureus כבר נקבע ב≤0.12 מיקרוגרם / מיליליטר. ה- FDA הוקצה רק susceptiהקטגוריה ble בגלל המחסור בנתונים על בידודים עמידים. הפצת MIC הנורמלית בין הסוג בר ס aureus המבודד הוא בין 0.03-.12 מיקרוגרם / מיליליטר, עם MIC מודאלי ברור של 0.06 מיקרוגרם / מיליליטר. וריאציה קלה בתוצאות MIC בשל הבדל בשיטה, בנוסף לוריאצית BMD הטבועה של ± אחד דילול, עלולה להיות השפעה משמעותית על שיעורי הרגישות. 6 דומים לסוכני lipoglycopeptide אחרים, בדיקת רגישות dalbavancin יכולה להיות מאתגרות כתוצאה של מסיסות והגודל גדול יחסית של המולקולה ומאפייניה מחייבים 7,8,9. שיטת BMD ההתייחסות המתוארת כאן כוללת שני צעדים ספציפיים שהנם ייחודיים לסוכנים מסיסים ו / או סוכני lipoglycopeptide: (1) השימוש בDMSO להכנת פתרונות מניות ו( 2) תוספת של 0.002% P-80 בלוח MIC הסופי דילולים. המטרה של פרסום וידאו זה היא לספק בהירות לשיטת BMD dalbavancin ולspecifically להתמקד בצעדים מפתח אלה, כדי להבטיח תוצאות MIC מדויקות ושחזור.

Protocol

הערה: עיין במסמכי CLSI M7-A10 וM100-S25 ו / או ISO / FDIS 20,776-1 לפרטים מלאים של שיטת microdilution מרק ההתייחסות לרגישות מיקרוביאלית 2, 3, 4 שיטות ההתייחסות לאפשר לאפשרויות בחלק מ. נהלים ספציפיים לייצור הכנת הבידוד ופנל MIC כדי להשיג את אותה תוצאה סופית. השיטה המפורטת כאן מתייחסת לסוכן, dalbavancin אחד מיקרוביאלית, וחלק מהצעדים מייצג את אחד עלול להיות כמה דרכים הליך ההתייחסות ניתן לעשות. אמצעי בטיחות מתאימה (בקנה אחד עם רמת בטיחות ביולוגית 2) צריך להיות מנוצל 10. פורמט פנל MIC משמש לצורך פרסום וידאו זה מוצג בטבלה 1.

1. חנות Dalbavancin אבקה

  1. עם קבלת אבקת dalbavancin הכיתה אבחון, חנות ב -20 מעלות צלסיוס בסביבה מיובשת בהקפאת הפשרה שאינה. לפני השימוש, האבקה צריכה לאזן ללהגיע RT לפני הפתיחה.

2. הכן דילולי MIC לוח

  1. הכן פתרון מניות לא נעלה על 1,600 מיקרוגרם / מיליליטר של dalbavancin בDMSO המסודר (הטהור) בצינורות זכוכית או פלסטיק סטרילי, ולהשתמש באותו היום של הכנה או חנות ב -20 לC -60 o או מתחת לשימוש עתידי ב מקפיא ההפשרה אינה. קח בחשבון את העוצמה של dalbavancin כאמור בתיעוד קיבל עם האבקה, כאשר במשקל האבקה (ראה המשוואה 1 לדוגמא 800 מיקרוגרם / הכנת מניית מיליליטר).
  2. לדלל את מניות הדילול דומה לתכנית כפי שמוצג בטור 1 ("ריכוז מקור") בטבלה 2 עם DMSO המסודר בצינורות זכוכית או פלסטיק סטרילי. השתמש pipet אחד למדידת diluent וpipet אחר להוספת מניית dalbavancin הראשונית לצינור הראשון. לכל ריכוז מניית dalbavancin לאחר מכן להשתמש pipet חדש.
  3. הכן concent לוח MIC הסופי 100Xדילולים מנה (ריכוזי ביניים) עם DMSO המסודר. כפי שמוצג בעמודים 2-4 בטבלה 2, לשלב כרכים מתאימים של מקור וDMSO כדי להשיג ריכוז ביניים רצוי (כרכים לשמש יהיו תלוי במספר פנלי MIC להתבצע).
  4. הכן 0.004% P80: הכן פתרון מניות עובד טרי של P80 2% על ידי הוספת P80 0.1 מיליליטר ל -4.9 מיליליטר DH 2 א ' לעקר על ידי עובר דרך פתרון סינון ושימוש 0.22 מיקרון באותו היום של הכנה. הכן 0.004% diluent P80 על ידי הפיכת 1: P80 500 דילול של 2% (לדוגמא, 0.3 מיליליטר של 2% P80 ל149.7 מיליליטר של CAMHB).
  5. בהמשך לדלל את ריכוזי ביניים מוכנים בשלב 2.2 1: 100 במרק קטיון הותאם מולר הינטון (CAMHB) בתוספת 0.004% (V / V) polysorbate-80 (P-80) P-80 ו / או LHB (לסטרפטוקוקוס) הוסיפה בכפול הריכוז הסופי כי תוספת של הבידוד (שלב 4.3) תגרום לדילול 1: 2. ראו עמודים 6 ו -7 בטבלה 2 .

3. להכין פנלי MIC

  1. לוותר 50 μl של כל פתרון dalbavancin מוכן בשלב 2.3 לתוך בארות מתאימות של לוח MIC וכולל תקשורת רק באחד היטב (שליטת צמיחה גם). Pipet רב ערוצית עם טיפים סטרילי יכול לשמש לצעד זה.
  2. השתמש בלוחות מייד או לאטום עם סרט פלסטיק, מקום בשקיות ניילון ומניח מייד במקפיא שאינו הפשרה ב- 20 ≤ o C (רצוי ב- 60 ≤ o C) עד צורך. אם לוחות קפוא משמשים, להסיר חותמות ולמקם את הלוחות בודדים במעבדת ספסל במשך 15-30 דקות (עד שהתוכן גם הם הפשירו) לפני שתמשיכו לחיסון פנל.

4. לחסן פנלי MIC, בצע ספירת טהרה ומושבת ההתקנה

  1. בחר כמה מושבות מבודדות היטב מאגר דם 18-24 שעות או צלחת אגר הלא סלקטיבי אחר. לגעת בחלק העליון של כל מושבה עם לולאה סטרילית או מטלית והעברה לCAMHB מיליליטר 1-5 או שלאלין עד העכירות הוא שווה ערך לסטנדרטי מק 'פרלנד 0.5. להעריך עכירות על ידי השוואה ויזואלית למק 'פרלנד 0.5 או עם מכשיר photometric.
  2. בתוך 15-30 דקות של הכנה, לדלל את הבידוד 1: 100 בCAMHB (10 מיליליטר לCAMHB 100 μl). עבור רוב החיידקים שנבדקו נגד dalbavancin, למעט ס pneumoniae, דילול זה יספק ריכוז גם סופי של 5 x 10 5 CFU / מיליליטר (טווח מקובל הוא 2-8 x 10 5 CFU / ml). לס pneumoniae, ריכוז חיידקים המבוסס על השוואה של עכירות למק 'פרלנד 0.5 הוא בדרך כלל הרבה פחות, ולכן, לדלל את הבידוד 01:25 (400 μl לתוך 10 מיליליטר CAMHB + 10% + LHB).
  3. בתוך 15 דקות לאחר הכנת הבידוד, להעביר 50 μl של הבידוד הסופי היטב כל אחד (עם חריג של שליטת העקרות גם) של לוח MIC מוכן בשלב 3. pipet רב ערוצית באמצעות טיפים סטרילי יכול לשמש לצעד זה.
  4. לבצע בדיקת טוהרעל ידי העברה והפצת aliquot 1-10 μl משליטת הצמיחה החיובית גם באמצעות לולאה סטרילי לאגר סלקטיבי (לדוגמא, אגר סויה trypticase עם 5% דם כבשים).
  5. ספירת מושבה התקנה על ידי הסרת 10 μl משליטת הצמיחה היטב עם pipet ערוץ אחד וקצה סטרילי ולהעביר 10 מיליליטר של תמיסת מלח (1: 1,000 דילול). לערבב ולהעביר עם pipet ערוץ אחד וקצה סטרילי 100 μl למדיום מתאים, לא סלקטיבי אגר (למשל, אגר trypticase סויה עם 5% דם כבשים) ומשתרע על פני השטח אגר כל עם לולאת סטרילי, חוזר פעמיים בכיוונים שונים כדי להבטיח חלוקה שווה של הבידוד (דילול 1:10).

5. פנלי דגירה MIC, מושבה רוזן וצלחות טוהר

  1. לאטום כל פנל או ערימת MIC של לא יותר מ 4 פנלים בשקית ניילון, עם סרט פלסטי או עם כיסוי פלסטיק צמוד לפני דוגרים. לחלופין, למקם את פנל MIC ריק על top של ערימה של לא יותר מ 4 פנלי MIC, למקם מגבת נייר לחה במכל פלסטיק, לוחות MIC המקום במכל הפלסטיק ומכל קרוב מאובטח עם מכסה.
  2. דגירה לוחות MIC בחממת אוויר סביבה ב 35 ° C ± 2 מעלות צלזיוס במשך 16-20 שעות (staphylococci וenterococci) ו20-24 שעות (סטרפטוקוקוס) בתוך 30 דקות של חיסון. דגירה ספירת המושבה וצלחות טוהר תחת אותם תנאים מלבד סטרפטוקוקוס דגירה ב5% CO 2 באינקובטור.

6. קראו MIC ומושבת רוזן צלחות; בדוק פלייט טוהר

  1. קראו MIC כריכוז הנמוך ביותר שמעכב צמיחת חיידקים בבארות כפי שזוהה על ידי בעין בלתי מזוינת לחלוטין.
  2. ספירת מושבות על צלחת ספירת מושבה. הכפל כל מושבה על ידי גורם דילול (1: 10,000) (לדוגמא, 50 מושבות היא שווה ערך ל 5 x 10 5 CFU / ml). טווח מקובל הוא 20-80 מושבות (2-8 x 10 5 CFU / ml) ומשמש כapproקו מנחה ximate.
  3. בדוק צלחת טוהר. אם כל המושבות דומות למושבות משמשות בשלב 4.1, ולאחר מכן את הבידוד יכול להיחשב טהור. אם יש מושבות אחרות בהווה, אז יש פוטנציאל לזיהום להיות נוכח בלוח MIC והבדיקה יש לחזור.

תוצאות בקרת איכות 7. בדוק.

  1. עיין בטבלה 3 לטווחים צפויים של זני בקרת איכות CLSI. לדווח רק תוצאות של בדיקה מבודדת אם תוצאות MIC dalbavancin לאורגניזם בקרת איכות (ים) נמצאות בטווח הצפוי.
  2. אם MIC של ≥0.25 מיקרוגרם / מיליליטר מתקבל לכל ס קליני aureus לבודד, לחזור על בדיקות MIC dalbavancin ו / או לשלוח למעבדה התייחסות לאימות.

תוצאות

שיטות MIC טופל נחוצות כדי לעקוב אחר התפתחות התנגדות, מטרה חשובה של תוכניות מעקב מיקרוביאלית שונות. תוצאות Dalbavancin MIC עבור מבודדים שנאספו באירופה ובארה"ב ב2011-2013 היו <0.25 מיקרוגרם / מיליליטר ל99.9% מS.aureus ושל סטרפטוקוקוס 100% (לוח 4).

כדי להעריך את החשיבות של שימוש טרי (חתום) DMSO, בדיקות שלושה עותקים של מיקרופוני BMD dalbavancin לQC זני ס aureus ATCC 29,213, וא faecalis ATCC 29,212 ולשכפל בדיקות לס pneumoniae ATCC 49,619 בוצע באמצעות (1) DMSO מampules האטום, (2) DMSO מבקבוק 1 ליטר שהיה בתוך את תאריך התפוגה והיה בשימוש בעבר ל 2 שנים ו( 3) aliquot של DMSO מאותו 1 ליטר בקבוק (מדגם 2) שהורש לשבת בכוס פתוחה במשך 72 שעות לפני השימוש. תוצאות MIC Dalbavancin באמצעות לוחות שנעשו עם כל שלוש דוגמאות DMSO היו דומות וwithin טווחי QC המקובלים (לוח 5).

אובדן פעילות dalbavancin בעקבות חשיפה של מניות הפתרון לפלסטיק וללא תוספת של P-80 תועד היטב 7. ב 2 מחקרים נוספים, התוספת של P-80 לפתרונות מניות הראשוניים ובינוניים (לוח 6) והשימוש בצינורות זכוכית או פלסטיק להכנת פתרונות המניות הראשוניים ובינוניים (לוח 7) לא היה השפעה על תוצאות MIC dalbavancin. הייתה גם לא הייתה השפעה על תוצאות MIC dalbavancin כאשר פוליפרופילן ופוליסטירן צלחות משלושה יצרנים שמשו (לוח 7).

הנוכחות של דם סוס lysed בתקשורת המרק לבדיקה של סטרפטוקוקוס הוכחה לי פעילות כמו שטח-, דומה לP-80 7, 8. שיטת התייחסות dalbavancin לסטרפטוקוקוס אינה כוללת הן דם סוס P-80 וlysed ,עם זאת, בניגוד לstaphylococci וenterococci, תוצאות MIC dalbavancin לסטרפטוקוקוס דומות (בתוך +/- 1 דילול) עם וללא התוספת של P-80.

כפי שכבר הוצג בעבר ושמוצג באיור 1, דילול אגר dalbavancin מיקרופונים (AD) הם בדרך כלל 2-8 לקפל גבוה יותר בהשוואה להתייחסות הנוכחית BMD 12, 13, 14. שלא כמו BMD, התוספת של 0.002% P-80 לא על המודעה dalbavancin MIC תוצאות 12.

figure-results-2283
משוואת 1: דוגמא לצעדי הכנת Dalbavancin פתרון במלאי ההכנה 25 מיליליטר של 800 מיקרוגרם / מיליליטר פתרון dalbavancin..

figure-results-2628
איור 1. השוואה של Dalbavancin וVancomycin BMD לספירה. תוצאות של מחקר שהשווה dalbavancin וvancomycin BMD ותוצאות הספירה MIC עבור מבודד חיידקים גראם-חיובי בחר. ממוצע () Dalbavancin ו( ב ') תוצאות Vancomycin מרק Microdilution ואגרו הדילול MIC במיקרוגרם / מיליליטר במשך 15 Staphylococcus aureus, 8 staphylococci שלילי coagulase (CNS), 5 faecalis אנטרוקוקוס ו -14 סטרפטוקוקוס (קבוצות A, B, ו- C). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
DAL 0.002 DAL 0.004 DAL 0.008 DAL 0.015 0.03 דאל DAL; 0.06 DAL 0.12 DAL 0.25 DAL 0.5 DAL 1 DAL 2 קופה Ctrl.
B DAL 0.002 DAL 0.004 DAL 0.008 DAL 0.015 0.03 דאל DAL 0.06 DAL 0.12 DAL 0.25 DAL 0.5 DAL 1 DAL 2 קופה Ctrl.
ג DAL 0.002 DAL 0.004 DAL 0.008 DAL 0.015 0.03 דאל DAL 0.06 DAL0.12 DAL 0.25 DAL 0.5 DAL 1 DAL 2 קופה Ctrl.
D DAL 0.002 DAL 0.004 DAL 0.008 DAL 0.015 0.03 דאל DAL 0.06 DAL 0.12 DAL 0.25 DAL 0.5 DAL 1 DAL 2 קופה Ctrl.
E DAL 0.002 DAL 0.004 DAL 0.008 DAL 0.015 0.03 דאל DAL 0.06 DAL 0.12 DAL 0.25 DAL 0.5 DAL 1 DAL 2 קופה Ctrl.
F DAL 0.002 DAL 0.004 DAL 0.008 DAL 0.015 0.03 דאל DAL 0.06 DAL 0.12 DAL 0.25 DAL 0.5 DAL 1 DAL 2 קופה Ctrl.
G DAL 0.002 DAL 0.004 DAL 0.008 DAL 0.015 0.03 דאל DAL 0.06 DAL 0.12 DAL 0.25 DAL 0.5 DAL 1 DAL 2 קופה Ctrl.
H DAL 0.002 DAL 0.004 DAL 0.008 DAL 0.015 0.03 דאל DAL 0.06 DAL 0.12 DAL 0.25 DAL 0.5 DAL 1 DAL 2 קופה Ctrl.
DAL Dalbavancin
ריכוזים מוצגים במיקרוגרם / מיליליטר לאחר 50 μl / גם חיסון

פורמט פלייט 1. MIC שולחן. המיקום מציג 96 פורמט צלחת היטב של דילולים dalbavancin ובארות שליטה חיוביות משמש כדוגמא בפרסום וידאו זה

1 2 3 4 5 6 7 8
המקור Conc. (מיקרוגרם / מיליליטר) מקור נפח (מיליליטר) DMSO נפח (מיליליטר) ביניים Conc. בDMSO (מיקרוגרם / מיליליטר) נפח ביניים Conc. (מיליליטר) CAMHB נפח 0.004% * + P80 (מיליליטר) 2X Conc. אחרי 1: בCAMHB 100 דילול (מיקרוגרם / מיליליטר) סופי לוח Conc. לאחר חיסון (מיקרוגרם / מיליליטר)
800 1.0 1.0 400 0.02 1.98 4 2
400 0.5 0.5 200 0.02 1.98 2 1
400 0.5 1.5 100 0.02 1.98 1 0.5
400 0.5 3.5 50 0.02 1.98 0.5 0.25
50 0.5 0.5 25 0.02 1.98 0.25 0.125
50 0.5 1.5 12.5 0.02 1.98 0.125 0.06
50 0.5 3.5 6.25 0.02 1.98 0.06 0.03
6.25 0.5 0.5 3.13 0.02 1.98 0.03 0.015
6.25 0.5 1.5 1.5 0.02 1.98 0.015 0.008
6.25 0.5 3.5 0.8 0.02 1.98 0.008 0.004
0.8 0.5 0.5 0.4 0.02 1.98 0.004 0.002
טבלה זו שונה מCLSI M100-S25, לוח 8 3

שולחן תכנית 2. להכנת דילולים של סוכני מיקרוביאלית אינה מסיסים במים לשימוש במרק דילולי רגישות בדיקה. כרכים של פתרונות עובדים dalbavancin חומר מדלל להכנת MIC הסופיפתרונות dalbavancin של .002-2 מיקרוגרם / מיליליטר.

הזנים בקרת האיכות צפוי Dalbavancin MIC (מיקרוגרם / מיליליטר)
S. aureus ATCC 29,213 0.03-.12
א faecalis ATCC 29,212 0.03-.12
ס pneumoniae ATCC 49,619 0.008-.03

טבלת 3. תוצאות צפויות Dalbavancin MIC לבקרת איכות זני 3, 11 תוצאות בקרת איכות. CLSI לזנים הציעו להיבדק יחד עם בידודים קליניים על מנת לוודא המתודולוגיה ראויה

figure-results-9436
הפצת לוח 4. של Dalbavancin תוצאות MIC (מספר בכל MIC) מארה"ב ואירופה 2,011-2,013 Surveillאהה 15 מחקר. תוצאות Dalbavancin MIC ממחקר שפורסם בבידודים קליניים האחרונים כמדד לdalbavancin הנוכחי בפעילות חוץ גופית.

לבודד # Dalbavancin MIC (מיקרוגרם / מיליליטר)
DMSO 1 DMSO 2 DMSO 3
S. aureus ATCC 29,213 0.12 0.06 0.06
0.12 0.06 0.06
0.06 0.06 0.06
א faecalis ATCC 29,212 0.06 0.06 0.06
0.06 0.06 0.06
0.06 0.06 0.06
S. pneumoniae ATCC 49,619 0.015 0.015 0.015
0.03 0.015 0.015
DMSO 1 = להבה שלא נפתחה אטום 10 ampules מיליליטר
DMSO 2 = 1 ליטר בקבוק נפתח ותשובות
DMSO 3 = בקבוק 1 ליטר פתח נפוצות - ישב על ספסל בכוס מכוסה במשך 72 שעות

לוח 5. תוצאות Dalbavancin MIC (מיקרוגרם / מיליליטר) באמצעות צילומים DMSO וחטיבות ביניים דילולי הכנה עם DMSO ממקורות 3. תוצאותיו של מחקר MIC dalbavancin כי בהשוואה השפעה של שימוש בממסי DMSO שונים בהכנת מניית dalbavancin ודילולי ביניים.

לבודד מספר לשכפל מספר Dalbavancin MIC (מיקרוגרם / מיליליטר)
DALB w / P80 בDMSO DALB w / o P80 בDMSO
S. aureus ATCC 29,213 1 0.06 0.06
2 0.06 0.06
3 0.06 0.06
4 0.06 0.06
DP80-002SA הקליני S. aureus 1 0.03 0.03
S. aureus ATCC 700,699 1 0.5 0.5
ס pneumoniae ATCC 49,619 1 0.03 0.015
2 0.03 0.015
3 0.03 0.015
4 0.03 0.015
pyogenes ס קליני:
DP80-004PY 1 0.015 0.015
DP80-005PY 1 0.03 0.03
DP80-006PY 1 0.03 0.015
DP80-007PY 1 0.06 0.03
DP80-008PY 1 0.03 0.015
ס agalactiae קליני:
DP80-009AG 1 0.06 0.12
DP80-010AG 1 0.06 0.03
DP80-011AG 1 0.06 0.06
DP80-012AG 1 0.06 0.06
clini dysgalactiae סקאל DP80-013DY 1 0.03 0.03
ס pneumoniae קליני:
DP80-014SP 1 0.06 0.06
DP80-015SP 1 0.03 0.03
DP80-016SP 1 0.03 0.03
DP80-017SP 1 0.06 0.06

6. תוצאות שולחן Dalbavancin MIC באמצעות צילומים DMSO וחטיבות ביניים דילולי הכנה עם ובלי 0.002% P-80. תוצאותיו של מחקר MIC dalbavancin כי בהשוואה השפעה של הוספת 0.002% P-80 לdalbavancin מניות ודילולי ביניים.

1
לבודד לשכפל מספר מניית דילול צינורות צלחת microtiter (סוג פלסטיק)
פולי-פרופילן, גריינר פוליסטירן
זכוכית פלסטיק 1 שעות פלסטיק 1 שעות פלסטיק / 1 שעות ביניים גריינר קורנינג Nunc
S. aureus ATCC 29,213 1 0.06 0.03 0.03 0.03 0.06 0.03 0.06 0.03
2 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.06
3 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03
א faecalis ATCC 29,212 0.06 0.06 0.06 0.06 0.03 0.03 0.06 0.03
2 0.06 0.06 0.06 0.06 0.03 0.03 0.06 0.03
3 0.06 0.06 0.06 0.06 0.03 0.03 0.06 0.03
ס pneumoniae ATCC 49,619 1 0.015 0.015 0.015 0.015 0.008 0.008 0.008 0.008
2 0.015 0.015 0.015 0.015 0.008 0.015 0.008 0.008
= מניות ראשוניות הזכוכית נעשו בבקבוק זכוכית, המשמשות באופן מיידי כדי להפוך את ריכוז בינייםים בצינורות פלסטיק, המשמשים באופן מיידי כדי להפוך דילולים מרק.
מניית פלסטיק = ראשונית שנעשתה בצינור צנטריפוגות פלסטיק, המשמשת באופן מיידי כדי להפוך את ריכוזי ביניים בצינורות פלסטיק, המשמשים באופן מיידי כדי להפוך דילולים מרק.
שעה 1 = המניה ראשונית פלסטיק בצינור צנטריפוגות פלסטיק, בואו לשבת על ספסל במשך שעה 1 אז נהגה להכין ריכוזי ביניים בצינורות פלסטיק, המשמשים באופן מיידי כדי להפוך את הריכוזים במרק.
1 שעה / שעה 1 = המניה ראשונית פלסטיק ביניים שנעשתה בצינור צנטריפוגות פלסטיק, בואו לשבת על ספסל במשך שעה 1 אז נהגה להכין ריכוזי ביניים בצינורות פלסטיק, בואו לשבת על ספסל במשך שעה 1 אז נהגה להכין ריכוזים במרק.

7. תוצאות שולחן Dalbavancin MIC באמצעות צילומים דילולי הכנה בצינורות פלסטיק וזכוכית וסוגי פלסטיק פלייט MIC. תוצאות ofa dalbavancin MIC מחקר כי בהשוואה השפעה של שימוש צינורות פלסטיק או זכוכית בעת הכנת פתרונות המניות וגם השפעה של שימוש במקורות וסוגי הפלסטיק שונים לצלחות microtiter.

Discussion

פרטי השיטה הבאות מוצגים לשיקולים נוספים בעת הכנה לבדיקת MIC dalbavancin. העיצוב של לוח MIC יהיה תלוי במספר סוכני מיקרוביאלית להיבדק (כלומר., Dalbavancin לבד או סוכנים מרובים) והמינים של חיידקים להיבדק. ריכוזי dalbavancin צריכים להקיף את נקודות העצירה הפרשניות לכל מיני החיידקים שנבדקו ואת כל הטווח של דילולים צפויים לפחות אחד זן QC. סדרת דילול מיקרוביאלית יכולה להיות מאורגנת בשורות או עמודות בהתאם למספר סוכני מיקרוביאלית ו / או מבודד / צלחת ושיטה של ​​חיסון. הנפח של אבקת מרק dalbavancin וצריך להיות מחושב כדי להבטיח שכמויות אופטימליות מיוצרות והפסולת היא מינימאלית. לדוגמא בשימוש בפרסום זה, כרכים מבוססים על הכנת שני פנלי MIC. מרק מילר הינטון קטיון הותאם צריך להיות מוכן וautoclaved לפי אדםההוראות ועקרות של התקשורת של ufacturer מאומתים. לוחות MIC יכולים להתבצע ומשמשים באותו יום של הכנה או שהם יכולים להיבדק עם אורגניזמים בקרת האיכות מתאימים ולוחות תוקף מאוחסנים קפוא לשימוש עתידי. חשוב להשתמש בטכניקות סטרילי לאורך כל ההליך.

אין קריטריונים נוקשים לאימות של ריכוז הבידוד עם ספירת מושבה. ספירת מושבה יכולה להיבדק בתחילה לכל מינים נבדקו ו / או מעת לעת כדי לאמת את צעד הדילול מתבצע בשלב 4.2. חשוב שהתוקף של תקן מק 'פרלנד 0.5 גם בדק באופן שיגרתי עם E. coli ATCC 25922 באמצעות הליך דומה לצעד 4.5. אם התוצאות אינן שווה ערך ל1-2 x 10 8 CFU / ml, יש לקבל סטנדרטי מק 'פרלנד 0.5 חדש. אם ספירת המושבה מבארות MIC נמצא מחוץ לטווח המקובל (2-8 10 5 CFU תוצאות x / מיליליטר וMIC לבודד הקליני (ים) משתנות מהדואר צפוי התפלגות נורמלית (לדוגמא. 0.03-.12 UG / מיליליטר לS. aureus) ו / או תוצאות MIC לבודד בקרת איכות (ים) נמצאות מחוץ לטווח צפוי, בדיקות אימות היא הכרחיות ושינוי שיטה עשוי להיות מוצדקים. הוא הציע כי 0.5 סטנדרטי מק 'פרלנד תוקף משמש לחזור על ספירת המושבה (ים), ואם תוצאות הן שוב מחוץ לתוצאות צפויות, דילול הבידוד כפי שבוצע בשלב 4.2 צריך להיות בהתאם וMIC חוזר ונשנה. שים לב שבדיקת טוהר היא הכרחית גם אם ספירת מושבה מתבצעת כי הליך ספירת המושבה משתמש נפח מדולל שלא בהכרח לזהות ריכוזים נמוכים של אורגניזמים מזהמים.

לבדיקת MIC להיחשב חוקית, צמיחה מקובלת חייבת להתרחש בשליטת הצמיחה גם. עבור רוב החיידקים שייבחנו נגד dalbavancin (כלומר., Staphylococci, סטרפטוקוקוס וenterococci, צמיחה שנראה כמו כפתור (בדרך כלל> 2 מ"מ) ופחות frequently, צמיחה עשויה להופיע כעכירות בבאר. בניגוד לכמה סוכני מיקרוביאלית שעשויה להפגין נגררים השפעת הריכוזים להגדיל, נקודות קצה dalbavancin מוגדרות בדרך כלל היטב. ישנם מכשירים שונים שנועדו להקל על הצפייה בדיקות microdilution הקריאה, אשר עשוי לשמש לקריאת צלחות המכילות dalbavancin כל עוד אין פשרה ביכולת להבחין בצמיחת הבארות.

השלבים הקריטיים בפרוטוקול הקשורות לחלקים של ההליך שאינם קשורים למסיסות של dalbavancin ותוספת של P80. חשוב שאת הריכוז המרבי של dalbavancin משמש הוא לא יותר מ -1,600 / מיקרוגרם מיליליטר, DMSO המשמש כממס וכי ריכוזי ביניים ערוכים DMSO לפני ביצוע דילולים המרק כך שהריכוז הסופי של DMSO בMIC פנל הבארות אינן עולים על 1%. DMSO הוא hygroscopic ולכן, השימוש בבקבוקים ישנים יותר של DMSO היה consideratיון ביחס למסיסות dalbavancin. עם זאת, בעוד שמחקר BMD קטן עם זני בקרת האיכות הוכיח את זה לא כדי להיות משתנה חשוב (ראה סעיף תוצאות), זה תרגול טוב להשתמש בבקבוקים חדשים או שנפתחו לאחרונה של DMSO. כמו כן, חשוב שP80 מתווסף המרק בשלב האחרון של הכנת דילול תרופה והוא בריכוז סופי של 0.002% בMIC כן.

הליך BMD כלול כאן מנצל הכנת לוחות MIC באמצעות 50 μl / גם בdalbavancin ו- P-80 ריכוזים שתי פעמים הריכוז הסופי ותוספת של הבידוד עם 50 μl / כל כך טוב שנפח סופי / גם הוא 100 μl. שיטה זו מאפשרת לפורמט פנל MIC אחד להיות מיוצר לבדיקה של שני ס aureus וס pneumoniae כי דם סוס lysed ניתן להוסיף לבידוד. שיטות אלטרנטיביות להכנת לוחות MIC באמצעות 100 μl / גם עם תוספת של עד 10 μl / גם מתוארות בנהלי CLSI ו- ISO.

נקודת העצירה רגישה dalbavancin לס aureus הוא ≤0.12 מיקרוגרם / מיליליטר (עלון FDA). כפי שמוצג במעקב האחרון, רוב מבודדים מעוכבים על ידי dalbavancin ברמות של 0.06 מיקרוגרם / מיליליטר 15. עם נקודת עצירה רגישה קרוב לMIC מודאלית, כל שינוי בMIC כתוצאה מהבדלים בשיטה יכול להשפיע על שיעורי רגישות. בגלל הליך BMD לdalbavancin כולל כמה שלבים ייחודיים (במיוחד, השימוש בDMSO בהכנת מניות ודילולי תרופת ביניים וP80 0.002% בMIC טוב, זה הכרחי כי השיטה המיושמת בדיוק. האורגניזם S. aureus QC (ATCC 29,213) עם MIC מודאלי dalbavancin מאוד ברור של 0.06 מיליליטר מיקרוגרם /, היה אינדיקטור טוב של וריאציה שיטה ויש להשתמש באופן שיגרתי כדי לאמת את שיטת BMD. אם תוצאות MIC הן עם הטווח הצפוי של .03-.12 מיקרוגרם / מיליליטר, אך במגמה לאו נמוך או HIGצד שעות של טווח זה, אימות נוספת של השיטה היא מוצדקת.

התוספת של P80 0.002% מומלצת לכל היצורים גרם-חיובי רלוונטי (staphylococcci, enterococci, וסטרפטוקוקוס.) עם זאת, ראוי לציין כי זה כבר הראה כי lysed דם סוס פועל בדומה לP-80 ביחס לה אנטי-מחייב יכולת וכי התוספת של P-80 לCAMHB + LHB אין כל השפעה נוספת על תוצאות MIC סטרפטוקוקוס dalbavancin.

אין כרגע שיטת דיפוזיה דיסק לdalbavancin בדיקות ובגלל עניי המתאם של BMD ותוצאות הספירה, בדיקת רגישות של dalbavancin בשיטת הספירה אינו מומלצת 12, 14. שיטת BMD צריכה לשמש להערכה העתידית של רגישות dalbavancin וכתקן זהב לפיתוח בדיקות רגישות מיקרוביאלית מסחריות.

Disclosures

סנדרה מק'קרדי הנו עובד Therapeutics Durata; מומחי מעבדה, Inc, מעסיק של לורה Koeth וJeanna פישר, היה חוזה על ידי Therapeutics Durata להכין את כתב היד. עמלות פרסום לכתבה זו שולמו על ידי מומחי מעבדה, Inc.

Acknowledgements

Prior work with regard to susceptibility testing of dalbavancin has been valuable in development of a standardized methods and acknowledgement for this work is given to JMI Laboratories, Robert Rennie and Beth Goldstein.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
DalbavancinMetrics, Inc.Greenville, NCBI-397
VancomycinSigma-AldrichSt. Louis, MOC5793
Cation Adjusted Mueller Hinton BrothBecton DickinsonSparks, MD212322
Lysed horse bloodCleveland ScientificBath, OH
Dose-it peristaltic pumpIntegra BiosciencesHudson, NH
Multi-channel pipet (Viaflo II)IntegraHudson, NH4164
12 channel pipet (Matrix)ThermoFisher ScientificWaltham, MA
Single channelpPipets (Ovation 10 µl - 100 µl)VistaLabBrewster, NY
96 well microplateGreiner Bio-oneMonroe, NC650161
50 ml flat cap conical bottom centrifuge tubesThermoFisher ScientificWaltham, MA
16x125 mm disposable glass tubesThermoFisher ScientificWaltham, MA
12x17 mm snap cap, polystyrene tubesThermoFisher ScientificWaltham, MA
16 ml centrifuge tubesBioExpressKaysville, UTC-3394-2
Reagent reservoirsIntegra BiosciencesHudson, NH4312
Disposable sterilelLoops (1 µl & 10 µl)BiologixLenexa, KA65-0001,65-0010
Tryptic soy agar + 5% sheep bloodBecton DickinsonSparks, MD
Incubator (ambient)Sanyo
Incubator (5% CO2)Sanyo
Analytical balance ThermoFisher ScientificWaltham, MA
GlovesKimberly-Clark52817
Lab coats

References

  1. Boucher, H. W., et al. Once-weekly dalbavancin versus daily conventional therapy for skin infection. The New England journal of medicine. 370, 2169-2179 (2014).
  2. . . M07-A10. Methods for Dilution Antimicrobial Tests for Bacteria that Grow Aerobically.: Approved Standard. , (2015).
  3. . . M100-S25. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Fifth Informational Supplement. , (2015).
  4. . Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems -- Susceptibility testing of infectious agents and evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices -- Part 1: Reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial agents against rapidly growing aerobic bacteria involved in infectious diseases. ISO/FDIS. 20776-1, (2006).
  5. Jones, R. N., Farrell, D. J., Flamm, R. K., Sader, H. S., Dunne, M. W., Mendes, R. E. Surrogate analysis of vancomycin to predict susceptible categorization of dalbavancin. Diagn Microbiol Infect Dis. , (2015).
  6. Turnidge, J., Paterson, D. L. Setting and revising antibacterial susceptibility breakpoints. Clinical microbiology reviews. 20, 391-408 (2007).
  7. Rennie, R. P., et al. Factors influencing broth microdilution antimicrobial susceptibility test results for dalbavancin, a new glycopeptide agent. Journal of clinical microbiology. 45, 3151-3154 (2007).
  8. Arhin, F. F., et al. Effect of polysorbate 80 on oritavancin binding to plastic surfaces: implications for susceptibility testing. Antimicrobial agents and chemotherapy. 52, 1597-1603 (2008).
  9. Farrell, D. J., Mendes, R. E., Rhomberg, P. R., Jones, R. N. Revised reference broth microdilution method for testing telavancin: effect on MIC results and correlation with other testing methodologies. Antimicrobial agents and chemotherapy. 58, 5547-5551 (2014).
  10. Ribbon Panel, B. l. u. e. Guidelines for Safe Work Practices in Human and Animal Medical Diagnostic Laboratories. MMWR Supplements. 61 (01), 1-101 (2012).
  11. Anderegg, T. R., Biedenbach, D. J., Jones, R. N. Initial quality control evaluations for susceptibility testing of Dalbavancin (BI397), an investigational glycopeptide with potent gram-positive activity. Journal of clinical microbiology. 41, 2795-2796 (2003).
  12. Koeth, L. M., Windau, A. R., Goldstein, B. P. Comparison of Broth Microdilution and Agar Dilution Dalbavancin and Vancomycin MIC Results for 42 Aerobic Gram-positive Bacteria. Poster 132. ASM. , (2012).
  13. Fritsche, T. R., Rennie, R. P., Goldstein, B. P., Jones, R. N. Comparison of dalbavancin MIC values determined by Etest (AB BIODISK) and reference dilution methods using gram-positive organisms. Journal of clinical microbiology. 44, 2988-2990 (2006).
  14. Mushtaq, S., Warner, M., Johnson, A. P., Livermore, D. M. Activity of dalbavancin against staphylococci and streptococci, assessed by BSAC and NCCLS agar dilution methods. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 54, 617-620 (2004).
  15. Jones, R. N., Flamm, R. K., Sader, H. S. Surveillance of dalbavancin potency and spectrum in the United States (2012). Diagnostic microbiology and infectious disease. 76, 122-123 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

103dalbavancinMICmicrodilutionCLSIISO

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved