הרחבת בידוד והתרבות של תאי האנדותל גידול ספציפי

Summary

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

Abstract

תאי גידול ספציפי מבודדים טרי אנדותל (TEC) יכולים לשמש כדי לחקור מנגנונים מולקולריים של אנגיוגנזה גידול ולשמש כמודל במבחנה לפיתוח מעכבי אנגיוגנזה חדשים לטיפול בסרטן. עם זאת, לטווח ארוך בהרחבת מבחנה של תאי האנדותל עכברי (EC) הוא מאתגר עקב סחיפה פנוטיפי בתרבות (מעבר אנדותל לmesenchymal) וזיהום עם לא-אירופי. זה נכון במיוחד עבור TEC הoutcompeted בקלות על ידי fibroblasts-מטוהר שיתוף או תאים סרטניים בתרבות. הנה, שיטת בידוד איכות גבוהה שמנצלת העשרת immunomagnetic בשילוב עם מבחר מושבה ובהרחבת מבחנה מתוארת. גישה זו יוצרת שברי EC טהורים שהם חופשיים לחלוטין של זיהום תאי סטרומה או גידול. כמו כן הוא הראה ^שcre Cdh5-לייחס שושלת: העכברים ^{/ ליטר} ZsGreen ^{s / l} כתב, בשימוש עם הפרוטוקול מתואר במסמך זה, הינו כלי רב ערך כדי לוודא תאטוהר כמושבות EC המבודדות מעכברים אלה מראה הקרינה ZsGreen עמידה ומבריקה בתרבות.

Introduction

תאי האנדותל (EC) הם חיוניים במהלך הפיתוח של גידולים מוצקים. מייזום מתג angiogenic בגידולים רדומים להפצה וזריעה של גרורות באתרים מרוחקים, EC ליצור צינורות המספקים דם, חמצן וחומרים מזינים כדי לקיים את צמיחת גידול ^1. כפי שהוצע לאחרונה, EC יש גם פונקציות זלוף-עצמאי ויוצר נישה שתומכת בצמיחה של תאי גזע סרטני ותאי סטרומה גידול אחרים ^2-5. לפיכך, מטוהר ביותר גידול ספציפי EC (TEC) לתרבות במבחנה מאפשר ללימודים תפקודיים שיגרתי שישפוך אור על מנגנונים מולקולריים רומן תיווך אנגיוגנזה גידול ולדבר לחצות עם תאים סרטניים.

EC הם מאוד מיוחדים בהתאם לרקמת המוצא ^6. בשל האופי הטרוגני סוגים שונים של גידול ומייקרו-הסביבה של הגידול, TEC יכול גם להציג תכונות ייחודיות המשקפות את גידול o התמחות ספציפיו בכלי הדם. לדוגמא, יש שונות בולטות בחתימות ביטוי גנים בTEC מבודדות מסוגים או ציונים של גידולי ^7,8 שונים. עם זאת, שיתוף טיהור תכופה של אי-EC, במיוחד fibroblasts הקשורים גידול ותאים סרטניים, עם TEC יכולה לבלבל ביטוי הגנום מנתח. סוגי התאים לא רצויים אלה הם בעייתיים במיוחד במחקרים המסתמכים על טווח ארוך בהרחבת מבחנה של תרבויות TEC.

שתואר כאן היא שיטה באיכות גבוהה שמייצרת באופן עקבי תרבויות EC טהורות מגידולים ורקמות אחרות. בעקבות העשרת עמודת immunomagnetic של שברים EC והסרת מטוהר שיתוף הלא-EC, צעד שיבוט-טבעת נוספת כדי ללכוד מושבות EC טהורות משמשת ^9. כל מושבה ניתן להרחיב בתרבות לקטעים מרובים ללא ההופעה של זיהום שאינו EC. שיטה זו גם תשואות שיבוטים EC מרובים מהליך בידוד יחיד, שהוא אידיאלי ללימוד אנדוההטרוגניות thelial. בנוסף, הוא הראה כי ^cre Cdh5: עכברי הכתב ^{/ L / L} ZsGreen ^שלהם כלי רב ערך ליצירת EC "ממופה גורל" ובל יימחו-מסומן אשר לשמור על הקרינה ZsGreen בתרבות ^10. עם התאמות קלות לפרוטוקול, שיטה זו צריכה להיות להתאמה לסוגי גידולים שונים או רקמות נורמליות.

Protocol

הפרוטוקול הבא מתבצע על פי הנחיות שנקבעו על ידי המחלקה לבעלי חיים במעבדה לרפואה באוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל.

1. מכין את החומר וריאגנטים הבאים לפני שמתחיל

1. הכן תקשורת EC על ידי השלמה הנמוך גלוקוז 400 מיליליטר השתנה בינוני של הנשר (DMEM) עם 50 מיליליטר סרום חום מומת שור עוברי, 50 מיליליטר נו-סרום IV, 5 מיליליטר אנטיביוטיקה antimycotic, (ז 1 / D-גלוקוז או L LG) של Dulbecco וhFGF, VEGF, hEGF, R3-IGF-1, ורכיבי הפרין מהערכה המסחרית.
2. הכן חיץ 500 מיליליטר FACS (BSA 0.5% ו- 2 mM EDTA ב PBS); לסנן באמצעות כוס סינון סטרילי 0.22 מיקרומטר.
3. לעקר או לחטא לנתח לוח.
4. לעקר סיכות לנתיחה, מספריים כירורגיות, ומבתרים.

2. בידוד EC (יום 1, ~ שעה 5)

1. להרדים עכבר עם פחמן דו חמצני או בשיטות אחרות שנינות תואמותמדיניות h ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדית (IACUC).
   הערה: גידולי החלב מרובים משתנים בגודלם (5 - 15 מ"מ קוטר) עלולים לפתח בעכבר מהונדס גנטי בודד כגון C3-תג, כדי להיות בטוח לקצור את כולם לבידוד TEC. אם משתמשים בגידולי הengrafted orthotopically בעכברים, בריכה שתיים עד שלוש 1 סנטימטר ³ גידולים לבידוד EC יחיד. כאן אנו משתמשים גידולי החלב כהפגנה, אבל הפרוטוקול יכול להיות שונה עבור סוגים אחרים של גידולים.
2. לחטא עכבר על ידי ריסוס או לנגב את צד הגחון העכבר עם כמות גדולה של אתנול 75% V / V.
3. לכרות גידולים עם זוג אחד של מספריים ומבתרים תוך שימוש בטכניקות אספטיים במנדף סטרילי או בספסל נקי.
   1. להשתרע ולהצמיד את הגפיים של העכברים על לוח לנתח. לעשות חתך הגחון קו האמצע עם המספריים מבלי לפתוח את הצפק. לנתח רוחבי בין העור והצפק לבלוטות החלב שבו גידולים ממוקמים.אל תפתח את הצפק.
   2. בלו רק רקמת גידול מבלוטות החלב, ומשאיר את שוליים החלב רגילים. לקצץ בזהירות את רקמות שאינן סרטניים כגון עור ושרירים, ולמקם את הגידולים גזור בצינור חרוטי המכילים 30 מיליליטר של LG-DMEM על קרח.
4. להביא דגימות גידול למכסה מנוע תרבית רקמה; לשטוף רקמות עם LG-DMEM סטרילי 1 - 2 פעמים.
5. העברת גידולים מצינור חרוטי לצלחת פטרי רקמות תרבות סטרילי, להוסיף 2 מיליליטר של LG-DMEM בצלחת, ובררו עם זוג המספריים סטרילי לחתיכות <5 מ"מ.
6. הוסף 5 מיליליטר של collagenase (מניות = 2 מ"ג / מיליליטר במאוזן מלח הפתרון של האנק, להלן HBSS), 1 מיליליטר של dispase (מניות = 2.5 U / ml בHBSS) ו -75 μl של deoxyribonuclease (מניות = 1 מ"ג / מיליליטר PBS ) לצלחת פטרי. נפח כולל הוא עכשיו ~ 10 מיליליטר.
7. העבר את תערובת collagenase / רקמות מצלחת פטרי לצינור רקמות Dissociator ולרוץ על Dissociator רקמה למשך 60 שניות פעמיים (שנקבע מראש ניתוק יחסי הציבורogram על Dissociator: 1,270 סיבובים הכולל להפעלה). דגירה עם אור רועד על שייקר במשך 75 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
8. מסנן מתעכל רקמת דרך מסננת תא 100 מיקרומטר על צינור חרוטי 50 מיליליטר. מסנן לשטוף עם 5 מיליליטר של חיץ FACS לשטוף את כל תאים שנותרו. ספין ב 280 XG במשך 5 דקות ולשאוב supernatant בזהירות מבלי להפריע תא גלולה.
9. לדלל 1 מיליליטר של חיץ מניית RBC תמוגה (10x) ב 9 מיליליטר של מים סטריליים. תאי דם אדום Lyse עם 10 מיליליטר של חיץ תמוגה (1x), ומייד ספין 5 דקות ב 280 x גרם. הערה: ניתן לדלג על שלב זה אם הדם קטן גלוי.
10. Resuspend ב 10 מיליליטר של חיץ FACS. מערבבים 10 μl של השעיה תא עם 10 μl של trypan כחול, ולספור תאי חיים באמצעות hemocytometer.
11. Resuspend תאים ב ~ 10 ⁷ תאים / μl 100. הוסף 10 μl של בלוק FCR להשעית תא 100 μl, דגירה על קרח למשך 10 דקות.
12. הוסף נוגדן CD31 עכברוש אנטי עכבר PE-מצומדות פי. לטבלת 1 לדגור על קרח במשך 10 - 15 דקות וצינור קפיצי מדי פעם.
13. להוסיף 10 מיליליטר של חיץ FACS לצינור והספין ב 280 XG במשך 5 דקות. מוציא בזהירות את supernatant, ולשטוף את התא גלולה שוב עם 5 מיליליטר של חיץ FACS. צנטריפוגה לגלולת תאים. לשאוב supernatant ללא תא גלולה מטריד.
14. להוסיף microbeads חיץ ואנטי-PE FACS לפי טבלה 2 לדגור על קרח במשך 10 -. 15 דקות. צינור קפיצי מדי פעם.
15. להוסיף 10 מיליליטר של דגימות חיץ וספין FACS ב 280 XG במשך 5 דקות; לשטוף פעם אחת עם 5 מיליליטר של חיץ FACS ו צנטריפוגות שוב. לשאוב supernatant בלי גלולה מטרידה.
16. תביא נפח 300 μl במאגר FACS. ספין באמצעות 35 דקות צינור 5 כתרים מיקרומטר תא-מסננת ב 280 x גרם. השתמש 2 צינורות ונפח גדול יותר במידת צורך.
17. הגדרת multistand מגנטי ועמודות מגנטיות במכסת מנוע, לצרף לעמודה מפרידה ולאזן את העמודה עם 2 מיליליטר של חיץ FACS.
18. Aspiratדואר supernatant ו resuspend התא גלולה ב0.5-1 מיליליטר של חיץ FACS.
19. להעביר את ההשעיה התא דרך העמודה המגנטית equilibrated.
20. לשטוף את העמודה שלוש פעמים עם 2 מיליליטר של חיץ FACS, ולאסוף זרימה דרך (FT) בצינור 15 מיליליטר (חלק FT).
21. קח את הטור את המפריד וelute עם 2 מיליליטר של חיץ FACS לעוד 15 צינור מיליליטר (חלק eluate). השתמש בוכנה כדי להבטיח את כל התאים מהטור. חזור על elution עוד פעמיים עם 2 מיליליטר של חיץ FACS בכל פעם.
22. ספין eluate ב 280 XG במשך 5 דקות.
23. הסר את supernatant ו resuspend גלולה ב 10 מיליליטר של תקשורת EC.
24. באותה מידה לחלק את חלק eluate (~ 6 מיליליטר) לתוך מנות ג'לטין מצופה 10 סנטימטר. במשך שלושה 1 סנטימטר ³ גידולים, צלחת eluted תאים בלפחות ארבע צלחות. תאים לחלופין, צלחת eluted בריכוזים שונים בצלחות מרובות (לדוגמא., זרע 0.5 מיליליטר, 1 מיליליטר, 1.5 מיליליטר, ו -3 מיליליטר של eluate לארבע צלחות) כדי להבטיח שצלחת לא לפחות אחד זרע בדלילות עם תאי eluted. בדוק שconfluency של התאים המצורפים הוא ב~ 1% ביום שלמחרת (כלומר, 1.0 כ - 2.0 X 10 ⁵ תאים מצורפים).
    הערה: התאים צריכים להיות מצופים דליל כך שמושבות EC יכולות ליצור מבלי שזוהמה על ידי סוגי תאים אחרים.
25. צלחת שבריר FT בצלחת 10 סנטימטר אחד כדי לאפשר לתאים להתאושש O / N. בדוק שהצלחת היא 80 - 100% ומחוברות למחרת. להקפיא את התאים (-80 ° C) בתקשורת 250 μl הקפאת תאים בcryotube ולאחסן אותם בחנקן נוזלי למחרת. הערה: חלק FT יכול לשמש לבידוד תאים סרטניים בשלב מאוחר יותר ו / או כביקורת שלילית לניתוח ביטוי גני EC של השיבוטים EC המבודדים.
26. לשנות תקשורת כל 2 - 3 ימים. מושבות מתחילות טופס לאחר 7 - 10 ימים. ניתן לזהות מושבות EC קטנות כבר ביום 3. מארק המושבות עם סמן עדין קצה בתחתית הצלחת.
27. לגרד ג אינו ספציפיאמות המקיפות את המושבות המזוהות עם קצה pippet 200 μl סטרילי.

3. טבעות שיבוט שימוש מושבה בחירה

1. לשנות תקשורת כל 2 - 3 ימים. טוהר EC ניתן לבדוק על ידי ה- LDL (DiI-AC-LDL) בנוסף על כ 5 - 7 ימים. הוסף 50 μl של LDL לכל 10 מיליליטר בינוני EC ודגירה של 3 - 4 שעות לפני בדיקת התאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
   הערה: LDL מרובה ⁺ השיבוטים EC יכול להיבחן ב~ יום 7.
2. התחל קצירת מושבות EC, כאשר הם מגיעים בקטרים ​​של 3 - 5 מ"מ בגודל. (בחר מושבות גדולות כי הם ארוזים עם LDL תאים ⁺ קטנים לתוצאות הטובות ביותר.)
3. לפני קצירת EC עם טבעות שיבוט, מראש מעיל כמה 6-גם צלחות עם ג'לטין 0.5%. ג'לטין לשאוב, להוסיף 2 מיליליטר של תקשורת EC היטב כל אחד, ולשמור על הצלחות בחממה עד צורך.
4. לגרד את הלא-EC בשולי המושבות כדי לוודא שאין סוגי תאים אחרים יהיה לכוד בתוך טבעת השיבוט.
5. שימושמיקרוסקופ שלב בניגוד (אובייקטיבי 4X או 10X), מתאר בסמן עדין קצה בתחתית צלחת תרבות האזורים המכילים מושבות EC.
6. לשטוף את הצלחת עם 10 מיליליטר של PBS ולהשאיר שכבה דקה מאוד של PBS בצלחת כאשר aspirating. (חשובה: כמות קטנה (~ 0.5 מיליליטר) של PBS ישמור תאי חיים במהלך הליך שיבוט-טבעת; גם, דבק רקמות זקוק למים כדי להתחבר.)
7. בחר טבעת שיבוט של גודל מתאים. השתמש זוג המלקחיים לנתח להרים טבעת, ועם קצה pipet 10 μl באופן שווה להחיל כמות קטנה של דבק רקמות על טבעת השיבוט.
   הערה: השתמש רק בסכום מינימאלי (~ 0.2 μl לטבעת קטנה) של דבק רקמות על טבעות שיבוט, ולהפוך את דבק רקמות בטוח פרוש באופן שווה סביב המשטח התחתון, כדי להבטיח אטימה טובה. דבק רקמות מוגזם מייצר חום ויוצר סרטים שעלולות להרוג את התאים.
8. מניחים את הטבעת על שיבוט המושבה EC. לחץ בעדינות את טבעת השיבוט להדביק ריng לצלחת. ודא שהמושבות לא התייבשו לפני הדבקת הטבעת.
9. מייד pipet 25 μl של פתרון ניתוק תא האנזימטית לזירת שיבוט דגירה דקות ~ 1 או עד שהתאים מחוברים באופן רופף.
10. תאי Pipet בטבעת שיבוט ירידה מבחינת לתוך היטב אחד של צלחת 6 היטב המכילה תקשורת EC המחוממת מראש. (חשוב: אין לטלטל את הצלחת לפזר תאים; EC מעדיף לגדול באשכולות צפופים.) שטוף את טבעת השיבוט עם 50-100 תקשורת EC μl לאסוף תאים רבים ככל האפשר, ולהעביר את כל שטיפות לתוך אותו 6-גם .
11. אם כמה מושבות בצלחת 10 סנטימטר קטנות מדי כדי לקצור, להוסיף 10 מיליליטר תקשורת טרי, תן ​​לגדול המושבות לעוד כמה ימים, ולחזור על התהליך שוב טבעת השיבוט.
12. לגדול מושבות שנקטפו ב6-גם צלחות עד 80 - ומחוברות 100%, והעברת תאים עד 3 בארות של צלחת 6 היטב, לפני הרחבתם בצלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים. לגרד את תאים מזהמים. חזורסיבוב של הליך טבעת שיבוט אחר (שלבי 3.5-3.10) במידת צורך. שמור את התאים יחסית מחוברות (~ 60 - 70%), כאשר הרחבת. EC יכול להפסיק לגדול אם מצופה דליל מדי.
13. לאפיין EC על ידי FACS, צביעה, PCR, וכו 'שים לב שדיל-AC-LDL הוא ניאון ועלול להפריע לPE או נוגדני ניאון אחרים לFACS.

תוצאות

EC מייצג רק קטין חלק מכלל אוכלוסיית התא ברוב הרקמות בוגרות ^11. לכן חשוב לעיכול הרקמה שנקטפו במלואו לתוך השעיה תא בודד שמבטיחה את השחרור המקסימאלי של EC ממטריצה ​​תאית (ECM) ורקמות חיבור. מניסיוננו, בחירת immunomagnetic תיווך CD31 מספקת רק שברי EC מועשר אבל לא טהורים; לכן, עוד צ...

Discussion

בשל הקשיים בהשגת תרבויות TEC העיקרי טהורות, רב במחקרי מבחנה TEC תחליף עם קווים זמינים מסחרי EC או EC העיקרי כגון וריד טבור האנושי EC (HUVEC) ^13. עם זאת, אוכלוסיות אלה EC מרקמות נורמליות יכולות רק לשמש כמדד לTEC אשר נבדלים במידה ניכרת מעמיתיהם הרגילים. לדוגמא, TEC הם phenotypicall...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic-Antimycotic	Sigma-Aldrich	A5955
Dulbecco's Modified Eagle's medium (1 g/L D-glucose) (LG-DMEM)	Gibco	11885-084
EGM-2 Bullet Kit	Lonza	CC4176	Not all components used
Fetal bovine serum (Hyclone)	Thermo Scientific	SH30071.03	Heat inactivated at 56 °C for 30 min
Nu-Serum IV	Corning	CB-51004
Hank's Balanced Salt Solution (HBBS)	Gibco	14175-095
Phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	14190-144
FACS buffer			0.5 % BSA and 2 mM EDTA in PBS, filtered through a 0.22 μm filter
75% v/v ethanol for disinfection
Anti-PE microbeads	Miltenyi Biotech	130-048-801
Bovine serum albumin (BSA) fraction V, 7.5%	Gibco	15260-37
Cell freezing media (Bambanker)	Wako Chemicals	302-14681
Collagenase type II	Worthington Biochemical	LS004176	Make stock concentration 2 mg/ml in HBSS
Deoxyribonuclease I (DNase)	Worthington Biochemical	LS002004	Make stock concentration 1 mg/ml in PBS
Dil-Ac-LDL	Biomedical Technologies	BT-902
EDTA, 0.5M, pH 8.0	Cellgro	46-034-CL
Enzymatic cell detachment solution (Accutase)	Sigma-Aldrich	A6964-100ML
Gelatin, 2% in water, tissue culture grade	Sigma-Aldrich	G1393-100ML	Dilute in PBS to make 0.5% gelatin solution
Mouse FcR Blocking Reagent	Miltenyi Biotech	130-092-575
Neutral protease (Dispase)	Worthington Biochemical	LS02104	Make stock concentration 2.5 U/ml in HBSS
PE-rat anti-mouse CD31 antibody	BD Pharmingen	553373
RBC lysis buffer (BD Pharm Lyse)	BD Pharmingen	555899
Sterile water
Trypan blue, 0.4 %	Life Technologies	15250-061
10 mm tissue culture dishes	Corning
15 ml conical tubes (sterile)	Corning
50 ml conical tubes (sterile)	Corning
6-well tissue culture plates	Corning
Tissue-dissociator tubes (gentleMACS) C tubes)	Miltenyi Biotech	130-093-237
Cell Separator  (MidiMACS)	Miltenyi Biotech	130-042-302
Cell strainer 100 μm	Corning	352360
Cloning rings (assorted sizes)	Bel-Art Products	378470000
Cryotubes	Thermo Scientific
Dissecting board			Sterilize or disinfect with 75% v/v ethanol before use
Dissecting forceps and scissors			Sterilize before use
Dissecting pins 2"			Sterilize before use
FACS tubes with 35 μm filter cap	Corning	352235
Filter cup (Stericup, 0.22 μm)	Millipore	SCGPU05RE
Fine-tip marker
Hemocytometer
LS Columns	Miltenyi Biotech	130-042-401
Magnetic Multistand	Miltenyi Biotech	130-042-303
Tissue adhesive (Vetbond)	3M	1469SB
Centrifuge	Eppendorf	5810R	Or a centrifuge with similar capacity for 15 ml and 50 ml conical tube centrifugation
Tissue culture hood
Tissue dissociator (gentleMACS)	Miltenyi Biotech	130-093-235	Preset program "m_impTumor_01" used for tissue dissociation
Liquid nitrogen freezer
Microplate or rotary shaker
Phase contrast light microscope