קביעת העדפות Ultrasonic ניקוד בעכברים באמצעות מבחן השמעה דו בחירה

Summary

Ultrasonic vocalizations (USVs) in mice differ depending on age, sex, condition, and genetic background. Using two ultrasound emitters broadcasting simultaneously in different locations, this two-choice test can evaluate murine recognition and preference responses to different characteristics of USVs.

Abstract

Mice emit ultrasonic vocalizations (USVs) during a variety of conditions, such as pup isolation and adult social interactions. These USVs differ with age, sex, condition, and genetic background of the emitting animal. Although many studies have characterized these differences, whether receiver mice can discriminate among objectively different USVs and show preferences for particular sound traits remains to be elucidated. To determine whether mice can discriminate between different characteristics of USVs, a playback experiment was developed recently, in which preference responses of mice to two different USVs could be evaluated in the form of a place preference.

First, USVs from mice were recorded. Then, the recorded USVs were edited, trimmed accordingly, and exported as stereophonic sound files. Next, the USV amplitudes generated by the two ultrasound emitters used in the experiment were adjusted to the same sound pressure level. Nanocrystalline silicon thermo-acoustic emitters were used to play the USVs back. Finally, to investigate the preference of subject mice to selected USVs, pairs of two differing USV signals were played back simultaneously in a two-choice test box. By repeatedly entering a defined zone near an ultrasound emitter and searching the wire mesh in front of the emitter, the mouse reveals its preference for one sound over another. This model allows comparing the attractiveness of the various features of mouse USVs, in various contexts.

Introduction

בעלי חיים רבים משתמשים בקולות לתקשורת intraspecific. במאסכאלאס העכבר, סוג אחד חשוב של אות תקשורת הוא קולות קוליים (USVs), שיש לי תדרים גבוהים יותר מ -20 קילו-הרץ. USVs נפלט על ידי עכברים נחשב מרכיב של הכרה חברתית בזכר-נקבת ^1-4, נקבה-נקבה ^{1, 5,} וגבר-גבר ^{1, 6} אינטראקציות. USVs גם נפלטים על ידי גורים כשהם מבודדים מאמם, אשר מגדיל אחזור-גור התנהגותה, ולכן כלבון הישרדות ^7. למרות דיווחים רבים ניתחו ומסווג USVs עכבר ^{8, 9,} תגובות התנהגותיות ומנגנונים עצביים של בעלי החיים שקיבלו כבר פחות מתועד ^{10, 11.} האחרון הוא צורך להבהיר את המשמעות הביולוגית של המאפיינים השונים של USVs. לחשוף מנגנונים אלה, ניסוי ההשמעה הוא שיטה יעילה. מחקרי השמעה לאחרונה עולים כי נקבהעכברים נמשכים ¹² USVs, וכי הם מעדיפים USVs מזכרים שהם שונים מהוריהם ^{13, 14.}

מאמר זה מסביר את מבחן ההשמעה משמש להערכת העדפת USV בעכברים. תיבת מבחן דו-בחירה פותחה באשר ניתן לשחק שתי USVs שונה בחזרה בו זמנית בשני תאים של מתחם בדיקה, כפי שמוצג באיור 1. סוג זה של תיבת המבחן מונע זיהום צליל על ידי חלוקת אזור הבדיקה בשלושה תת-תאים , באמצעות קירות עופרת. קרינת אולטרא-סאונד נמצאות מחוץ לכל חדר. בקיר שבין החדרים וקרינת אולטרא-סאונד חורים מכוסים ברשת תיל. עכברים יכולים לנוע בחופשיות בשלושה חדרים, ולהראות התנהגות "חיפוש ברשת", כאילו כדי להגיב לUSVs שיחק בחזרה על ידי קרינת אולטרא-סאונד. בבדיקה זו, עכברים להישאר לתקופות של משך שונה קרוב לפולט קול אחד או אחר. יכולים להיות מחוברים פרמטרים אלה כדי להשיג measu רגיש מחדש של העדפת קול.

כדי שתוכל לשחק USVs בחזרה, קרינה תרמו-אקוסטי סיליקון nanocrystalline (כלומר, "NC-סי פולט") שימשה כבמחקרים קודמים ^15-17. התקנים אלה מורכבים מהאלקטרודה סרט דק דוד, שכבת סיליקון ננו-נקבובי, ופרוסות סיליקון חד גבישיים. קובץ הקול הדיגיטלי מומר לאות אנלוגי ולאחר מכן עבר דרך אלקטרודה דוד. המכשיר ממיר את אותות תרמית מתח תלוי וכתוצאה מכך ללחץ קול משמעותי עם עיוות נמוכה. מכשיר זה הוא ייחודי בכך ש, שלא כמו מחוללי צליל משותפים שתלויות בתנודות מכאניות, זה יכול להתרבות קול ללא הצורך בסרעפת. הפולט מציג רמת לחץ קול שטוחה בתדרי 20-160 קילו-הרץ (איור 2), ויכול להתרבות USVs עכברי נרשם דיגיטלי מאוד מדויק במונחים של זמן, תדירות, ורמת צליל לחץ ^{15, 18, ​​19.}

ve_content "> בניסוי נציג מוצג באיור 3, / 6 נקבות C57BL (B6) הורשו לבחור בין BALB / ג (BALB) USVs זכר ורעשי רקע. בנוסף, איור 4 מראה את הבחירה של נקבות B6 וBALB בין פלייבקים USV בו זמנית מBALB וזכר B6, כפי שדווחו במחקר קודם ^14. המאפיינים של USVs הגברי שונים בין B6 וBALB זני ^20. כפי שניתן לראות בתוצאות אלה, את האטרקטיביות של USVs ניתן להעריך בפרוטוקול הנוכחי, שבו צלילים נרשמים מאדם חי, ניתחו אקוסטית, ושיחקו בחזרה לאנשים אחרים.

Protocol

כל ההליכים אושרו על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת Azabu. כל הניסויים בוצעו בתא אטום לרעש.

1. הכנת בעלי החיים

1. זכרים להקלטה
   1. להשיג עכברי זכרים מגיעים לבגרות מינית חוו בהזדווגות.
2. נושאים נקבה
   1. להשיג נקבות עכברי בתולה שכבר שוכנו עם 2 עד 5 להמלטה לכלוב (בדרך כלל 8 - 12 שבועות).
   2. להשיג מריחות נרתיק יומי כדי לקבוע את השלב של מחזור הייחום לפני הבדיקה, לפי מקלין ^21. יש להקפיד למזער את הגירוי בנרתיק כדי למנוע pseudopregnancy.
   3. להכתים את המריחות עם Giemsa, ולקבוע שלב של מחזור הייחום מבוסס על הנוכחות או עדר של כדוריות דם לבנות, תאי האפיתל cornified, ותאי אפיתל גרעיני, על פי ²² נלסון.

2. מכשירים (איור 1)

_content ">
איור 1. סכמטי של מבחן התיבה והתקנים דו בחירה. עכברים יכולים לגשת חדרים ו- B דרך השערים הקטנים הממוקמים ביניהם לבין האזור הניטרלי. התיבה דו-הבחירה ושני משדרי אולטרסאונד מונחים על רצפת חדר אטום לרעש. המיקרופון מושעה בתוך החדר אטום לרעש. קיצור:. מחשב, מחשב אישי אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

1. להקלטה
   1. חבר מיקרופון הקבל קולי למחשב באמצעות ממיר A / D USB.
   2. הגדר את רמת הרווח של ממיר A / D ל" 7 ".
   3. נתונים אקוסטיים רשומות בקבצים בפורמט של 16 סיביות עם קצב דגימה של 400 kHz באמצעות תוכנה ללכידה אודיו.
2. עבור השמעה
   1. חבר D / ממיר למחשב באמצעותממשק USB.
   2. חיבור שני מגברים לD / ממיר באמצעות מחליש. (המכשיר האחרון משמש כדי למנוע עומס יתר.)
   3. חבר פולט אולטרסאונד לכל מגבר.

3. USV הקלטה

1. הנח עכבר זכר ב( 17 x 10 x 11 סנטימטר) קטן או כלוב בגודל בינוני (21 x 14 x 13 סנטימטרים) עם חור בקוטר 6 סנטימטר בדפנות והחור מכוסה ברשת תיל 0.5 סנטימטר. בעת שימוש בכלוב בגודל בינוני, לבנות מחיצה מעבר למרכז הכלוב לצמצם את השטח.
2. אין להשתמש במצעים בכלוב, כדי למנוע רעשי רשרוש שיכול לזהם את ההקלטות.
3. מניחים מיקרופון ליד הרשת.
4. בגין ניטור ניקוד קולי עם הגדרת ההקלטה מוצגת בשלב 2.1.
5. הנח עכבר נקבה לבגרות מינית בשני metestrus או diestrus בכלוב עם עכבר הזכר.
6. שיא USVs במשך 3 - 5 דקות.

4. Test תיבה

1. לבנות תיבת הבדיקה באמצעות לוח אקריליק (איור 1).
   הערה: תיבת הבדיקה (35 x 20, וx 20 סנטימטר) מחולקת בשלושה מדורים: אזור ניטראלי (15 x 20 סנטימטרים), וחדרים ו- B (20 x 10 סנטימטר, כל אחת). חדרים ו- B כל יש חור 4 סנטימטר בקוטר שמכוסה ברשת תיל 0.5 ס"מ. החורים והרשת נמצאים בכל קצה של חדרים וב הפוך שערים (5 X 5 סנטימטרים כל אחת) בין האזור הניטרלי וחדרי A ו- B.
2. כדי למנוע דליפת קול לבודד כל פולט אולטרסאונד, פרט לצד הפונה לרשת, באמצעות צלחות גומי, איטום אותם לתיבה מסביב לכל רשת.
3. חותמות להוביל מקום בשני הצדדים של הקיר בין החדרים ו- B לבידוד קול.

5. הכנה לקול ניגון

1. יצירת צלילי פלייבק
   1. ללכוד קטע 20 שניות של USV מהקובץ המוקלט באמצעות תוכנה לעריכת אודיו דיגיטלית.
   2. בחר וללכוד רקע לאISE (0.35 שניות) מקובץ 20 שניות קטע USV. צור קובץ רעשי רקע 20 שניות על ידי חזרה על קטע הרעש.
   3. כדי לנגן את שני קבצי הקול בו זמנית, לייצא אותם כקובץ צליל סטריאו אחת, עם קובץ אחד ל" אוזן שמאל "וקובץ האחר ל" אוזן ימין."
   4. סנן את קבצי קול באמצעות כמסנן גבוה לעבור עם הפסקת של 40 קילוהרץ.
   5. להפחית את הרעש באמצעות הכלי להפחתת רעשים בתוכנה שלאחר עיבוד. בחר וללכוד קטע של הקובץ שמכיל לא USVs כפרופיל להפחתת רעשים, ולהפעיל הפחתת רעש עם רמה 40.
2. כיול של צלילי פלייבק
   1. ודא שהמרחב בין קרינת אולטרא-סאונד ומיקרופון הוא 10 סנטימטר.
   2. כדי לכייל את רמות לחץ קול מקרינת אולטרא-סאונד, לבצע ניטור קולי באמצעות התצורה המתוארת בשלב 2.1. מדוד את רמת לחץ קול על ידי המיקרופון בדציבלים (dB).
   3. Using המחליש ומגברים, להתאים את עוצמת הקול של USVs שנוצר על ידי קרינת אולטרא-סאונד לאותה רמת לחץ הקול כUSVs הזכר שנרשם בשלב 3.
   4. בעת השימוש בשני משדרי אולטרסאונד וקובץ קול מורכב מUSVs ורעשי רקע, לאשר כי שני משדרי אולטרסאונד תערוכה באותה רמת לחץ קול באמצעות קול כיול (למשל, צליל טהור 75-kHz) לפני ביצוע הבדיקה התנהגותית.
   5. כאשר מתרבה קובץ קול מורכב משני זרמים של USVs, להתאים שתי רמות לחץ קול שנוצרו באותה הרמה, לפני הבדיקה.

6. מבחן דו-בחירה

1. מניחים את קרינת אולטרא-סאונד מאחורי משתלב בתיבת הבדיקה.
2. סגור את השערים לחדרים ו- B עם לוח אקריליק, ולהרגיל את הנקבה בכפוף לאזור הניטרלי למשך 30 דקות. לכסות את התיבה עם אקריליק לוח כדי למנוע שהעכבר יכול לברוח.
3. התחל הקלטת וידאו באמצעות CCהמצלמה D רכובה מעל לתיבה. המצלמה (לא מוצג באיור 1) משתרעת על השטח של כל שלושת התאים.
4. הסר את השער וכיסוי לוח ולאפשר הנקבה לחקור באופן חופשי את תיבת הבדיקה, כולל אזורי הצליל.
5. ברגע שהנקבה חקרה שני רשתות שינוי, וחזרה לאזור הניטרלי, להתחיל לשחק קובץ קול 20 שניות שוב ושוב במשך 5 או 10 דקות.
6. לנהל מעקב התנהגות במשך 5 או 10 דקות.
7. כדי להפחית את רמזי חוש הריח לא רצויים שהופקדו מהנושא הקודם, לנקות את כלובי המבחן בין הבדיקות עם 70% אתנול.
8. לעבור המקום של קרינת אולטרא-סאונד ו- B באופן אקראי, כדי למנוע השפעת הטיה צד טבועה כלפי חדרי A או B.

7. ניתוח סטטיסטי

1. שימוש בתוכנת ניקוד אירוע התנהגותיות, לנתח את הפרמטרים הבאים: מספר כולל של ערכים בכל חדר; משך זמן כולל של שהייה בכל אזור מרכז; משך זמן כולל של שהייה בכל אזור צליל; ומשך הזמן הכולל של חיפוש של כל רשת מול פולט אולטרסאונד. איור 1 מדגים מה הכוונה "אזור מרכז" ו- "אזור צליל."
   הערה: במקרים בהם העכבר נשאר על הקו המפריד בין שני האזורים (איור 1, קו מקווקו) להחליט מיקום על ידי הכיוון של הראש. כאשר הראש פונה לצד הרשת, הוא הבקיע כמו שהייה באזור הקול.
2. לכל פרמטר התנהגות, להשוות את תגובות לחדרים ו- B באמצעות בדיקה חתמה דרגה Wilcoxon, או -tests לא זיווג עם רמה מובהקת של 0.05.

תוצאות

USVs נרשם מBALB-זכר אחד (161 הברות לכל 20 שניות), כמו גם רעש רקע שמשו השמעת צלילים בניסוי הנציג מוצג באיור 3. בניסוי זה, 7 עכברים B6 נשיים שמשו בשעת 9 שבועות של גיל . כדי לקבוע את משך הזמן הטוב ביותר של בדיקות של תגובה נשית להשמעת צלילים, הפרמטרים התנהגותיים נותחו בנפרד במ...

Discussion

Here, the results of a representative test showed that female mice can discriminate between artificial male USVs and background noise (Figure 3). The conclusion to be drawn from these results is that the discrimination signal is reflected in the duration of stay in the room and sound zone, and in the duration of searching the mesh in the first 5 min of testing, but not in the second 5 min (Figure 3C, E and F). These data indicate that mice become habituated to the playback sounds, possib...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Soundproof chamber	Muromachi Kikai
Small cage	CLEA Japan	CL-0113-1
Middle cage	CLEA Japan	CL-0103-1
Ultrasound condenser microphones	Avisoft Bioacoustics	CM16/CMPA
A/D converter	Avisoft Bioacoustics	UltraSoundGate116H
Audio software	Avisoft Bioacoustics	RECORDER USGH
Adobe Audition 3.0 / Audio editing software	Adobe Systems	Adobe Audition 3.0
Nc-Si emitter	Original		not commercially available but it is planned to be so in near future
D/A converter	National Instruments	NI USB-6251 BNC
Attenuator	Original
Amplifier	Yamatake
PC	Windows 7 professional		Intel® core i7-2600K CPU @ 3.4GHz, 8GB RAM, 64-bit operating system
Event recorder Excel-macro / Event-scoring software	original		Programmed by Naoto Akagawa & Takeru Yamamoto
CCD Camera
Rubber plates (made of elastomer resin)	Tokyo bouon	TI-75BK B4	Cut them to the proper size http://www.piano-bouon.jp/shopping/?pid=1329272401-447630&ca=6&p=3
Giemsa's azur eosin methylene blue solution	Merck Millipore	1.09204.0500