הדמיה נויטרופילים ומונוציטים בmesenteric ורידים על ידי מיקרוסקופית Intravital על עכברים מורדמים בזמן אמת

Summary

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Abstract

תגובה חיסונית יעילה תלויה בגיוס מהיר של כדוריות דם לבנות בדם לאתר של זיהום או פציעה. חוקר הגירת יקוציט in vivo הוא חיוני להבנת הבסיס המולקולרי של הגירת Transendothelial יקוציט ואינטראקציה עם האנדותל של כלי דם. גישה רבת עוצמה אחד כרוכה מיקרוסקופיה intravital בעכברים הטרנסגניים לבטא חלבוני ניאון בתאים של עניין.

כאן אנו מציגים פרוטוקול למונוציטים הדמיה ונויטרופילים בCX ₃ iv עכבר CR1 ^{GFP / WT} הוזרק נויטרופילים שכותרתו צבע כתומים עם מיקרוסקופ confocal הפוך. זמן לשגות סרטים שנאספו מ -30 דקות לכמה שעות של הדמיה מאפשרים הניתוח של התנהגות יקוציט בעורקי mesenteric תחת שני תנאי המדינה ודלקתיים יציבים. אנו גם מתארים את הצעדים כדי לגרום לדלקת בכלי דם באופן מקומי עם TLR2 / TLR1 אגוניסט Pam3SK4 ולפקח על subsequeגיוס NT של נויטרופילים ומונוציטים.

גם הטכניקה שהוצגה ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר אוכלוסיות אחרות של לויקוציטים ולחקור מולקולות מעורבות בגיוס לויקוציטים או סחר באמצעות גירויים אחרים או עכברים מהונדסים.

Introduction

נויטרופילים ומונוציטים הם תאים של מערכת החיסון המולדת, כי כל זמן במחזור הדם. על פציעה או זיהום, אותות דלקתיים לגרום diapedesis לויקוציטים לרקמות שנפגעו ונגועים, במסמך ייזום תגובה חיסונית תאית ^1-3. המהירות של גיוס לויקוציטים קובעת את התוצאה החיובית של התגובה החיסונית. תהליכים מורכבים אלה מסתמכים על מולקולות ספציפיות (למשל, selectins, כמוקינים מאוגדים האנדותל) הנוכחיות על האנדותל המודלק המסייעות להקמת קשר דבק בין כדוריות דם לבנות במחזור והאנדותל ^1-3 בדי לקבל תובנות על המולקולות מעורבות ביקוציט מפל גיוס, חשוב לדמיין את קינטיקה של גיוס תא ולעקוב אחר ההתנהגות של כל תא / אוכלוסייה. שיטה יעילה כרוכה מיקרוסקופיה intravital בעכברים הטרנסגניים לבטא חלבוני ניאון בתאים של עניין.

תוכן "> נכון להיום, כמה גישות באמצעות מיקרוסקופ intravital פותחו לתמונה בכלי הדם ^4,5. לדוגמא, הדמיה של כלי דם הדרמיס אוזן או ורידי mesenteric על ידי מיקרוסקופ confocal intravital שימשה לזהות סיור ההתנהגות של מונוציטים ^נמוכים Ly6C עכברי ואנושי CD14 ^לעמעם CD16 ⁺ מונוציטים בצד luminal של כלי דם בתנאי מצב יציבים ^6-8. מודל כלי דם Cremaster העכבר משמש לעתים קרובות כדי לפקח על התנהגותם של נויטרופילים או מונוציטים ^גבוהים Ly6C הדלקתי בתנאים דלקתיים או איסכמי בעכברים מהונדסים. שב מקרה, Cremaster מגורה באמצעות הזרקת intrascrotal של IL1β, CCL2, TNFβ או fMLP. לאחר 2-4 שעות, רקמות ואז בניתוח exteriorized ונותחו על ידי מיקרוסקופיה confocal intravital ^9-11.

הפרוטוקול הבא מתאר שיטה לניטור מונוציטים ונויטרופילים באותו הזמן עם כלהקרינה הפוכה מיקרוסקופ confocal. יתר על כן, השיטה שלנו מפרטת כיצד תמונה אותו כלי השיט לפני (מצב מצב יציב) ולאחר דלקת ואיך לבצע את קינטיקה של גיוס לויקוציטים. לצורך כך, אנו משתמשים ₃ CR1 עכבר ^{GFP / WT} CX, מונוציטים שלהביע eGFP, הזריק IV עם נויטרופילים עכברי שכותרתו צבע כתום. באמצעות מיקרוסקופ confocal הפוך, זה אפשרי (1) למעקב וניתוח מונוציטים ^{הנמוכים} Ly6C הסיור בתנאי מצב יציבים ו( 2) למעקב הגיוס של שני מונוציטים ונויטרופילים באותו הכלי לאחר דלקת מקומית. כאן אנו יוצרים את המצבים דלקתיים על ידי השימוש באגוניסט TLR2 / TLR1 ¹² Pam3CSK4. יתר על כן, הדמיה כזו עשויה לעזור לקבוע את התפקיד של מולקולות ספציפיות של עניין בשלבים השונים של מפל גיוס לויקוציטים אם בוצע על עכברי נוק-אאוט ספציפיים או בנוכחות של נוגדני חסימת ^6,9,13.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הערה: נהלי בעלי חיים בוצעו בהתאם לוועדה המוסדית האתית של טיפול בבעלי חיים בז'נבה, שווייץ ולשכת הווטרינרית המחוזית. מספר אישור GE / 63/14.

1. הכנת תרחיף תא בודד ממח העצם

1. עכבר קורבן (8-12 בן שבוע) נקע בצוואר רחם. לעקר רגליים אחוריות עם 70% אתנול. להסיר עור מרגליים אחוריות.
2. לנתח את עצמות ירך עכבר וtibias ולהסיר רקמה מרגליים עם אזמל. יש לשטוף את הרגליים עם 90% אתנול ומקום לתוך צלחת תרבות מלאה PBS.
3. מתחת למכסה מנוע התרבות, רקמות נקיות מעצמות ירך וtibias עם אזמל ונפרד במפרק הברך. חותך את כל קצה של העצמות.
4. מח עצם סומק מעצם באמצעות מחט 23G ומזרק 1 מיליליטר מלא בינוני הכנה (DMEM / F12 האדום ללא פנול, 1% בסרום עכברוש), לבורג 50 מיליליטר צינור. לשבש אגרגטים תא על ידי בעדינות passaging דרך ne 23Gedle ומזרק 1 מיליליטר. להביא נפח הכולל עד 25 מיליליטר עם מדיום הכנה.
5. צנטריפוגה XG 250, 5 דקות, 4 ° C. supernatant מחק. Resuspend גלולה ב 1 מיליליטר של תאי דם אדומים חיץ תמוגה RBLC (8.3 גר 'NH ₄ Cl, גרם NaHCO 1 _3, 1 מיליליטר EDTA (100 מ"מ), שלם לL 1 עם מים מזוקקים, לסנן 0.22 מיקרומטר) בצינור 15 מיליליטר בורג. דגירה 30 שניות על קרח.
6. הוסף 10 מיליליטר של מדיום ההכנה וXG 250 צנטריפוגות, 5 דקות, 4 מעלות צלזיוס. בטל supernatant וגלול ב 2 מיליליטר בינוני הכנה.

2. נויטרופילים העשרה על ידי סלקציה שלילית

1. להוסיף 150 μl של קוקטייל העשרת נויטרופילים עכבר (ערכת פלטפורמת בידוד תא כגון EasySep). לערבב דגירה על קרח למשך 10 דקות.
2. להוסיף 10 מיליליטר של פנול אדום DMEM החופשי. הפוך פעם צנטריפוגות 250 XG, 3 דקות, 4 מעלות צלזיוס.
3. supernatant מחק. גלולה גלולה ב1.75 בינוני מיליליטר הכנה ב 5 מיליליטר קלקר עגול צינורות תחתון. הוסף 250 μl ביובקוקטייל בחירה. לערבב דגירה על קרח למשך 10 דקות.
4. מערבולת חלקיקים המגנטיים (מערכת פלטפורמת בידוד תא) למשך 30 שניות כדי resuspend חלקיקים. הוסף 500 חלקיקים מגנטיים μl להשעיה תא. לערבב דגירה על קרח למשך 10 דקות.
5. מניחים את הצינור לתוך המגנט. חכה 3 דקות.
6. הפוך את המגנט על 5 מיליליטר קלקר חדש עגול צינורות תחתון כדי לאסוף את התאים ללא תווית הרצויה. אל תיקח את הטיפה האחרונה התלויה בצינור. תאים לא רצויים יישארו בצינור בתוך המגנט. בטל צינור זה לפסולת ביולוגית מסוכנת.
7. מניחים את הצינור החדש לתוך המגנט. חכה 3 דקות.
8. הפוך את המגנט על 15 מיליליטר חדש לדפוק צינור כדי לאסוף את התאים ללא תווית הרצויה. אל תיקח את הטיפה האחרונה התלויה בצינור.
9. נפח מלא עד 5 מיליליטר עם DMEM החופשי פנול האדום.

3. תיוג של נויטרופילים

1. הוסף 0.5 μl של צבע כתום כגון תא Tracker אורנג ריכוז עבודה (1 מיקרומטר, CMRA - chloromethyl-rodol-אצטט, מניית 10 מ"מ בDMSO). דגירה 2 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
2. להוסיף 2.5 מיליליטר של מדיום הכנה. צנטריפוגה XG 250, 5 דקות, 4 ° C.
3. supernatant מחק. גלולה גלולה במדיום 1 מיליליטר הכנה בצינור 1.5 מיליליטר.
4. קח aliquot לספור עם hematocytometer.
5. דגירה 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה XG 250, 5 דקות, 4 ° C.
6. supernatant מחק. Resuspend גלולה ב 1 מיליליטר PBS. צנטריפוגה XG 250, 5 דקות, 4 ° C כדי לשטוף.
7. supernatant מחק. גלולה גלולה כ10x10 ⁶ תאים לכל 100 μl PBS. שמור על קרח עד הזרקת IV. הערה: תאים צריכים להיות מוזרק iv מהר ככל האפשר. 6-12x10 ⁶ נויטרופילים / עכבר בדרך כלל מתקבל.

4. עכבר הכנה למיקרוסקופי Intravital

הערה:.. שלב 4.1) ו -4.2) צריכה להתבצע בתחילת הניסוי, כדי למנוע זמן ההמתנה ממושך של נויטרופילים שכותרת על ICדואר.

1. לשקול את עכבר CX ₃ CR1 ^GFP (8-12 בן שבוע).
2. הכן 800 μl של הרדמה (60 מ"ג / קילוגרם קטמין, 4.5 מ"ג / קילוגרם xylazine, acepromazone 1.75 מ"ג / קילוגרם בPBS).
3. הרדימי עכבר. IP הזרקה עם 200 μl / 20 גרם של עכבר. הרדמה שליטה על ידי בוהן צביטה ועל ידי בדיקת קצב הנשימה.
4. הזרק נויטרופילים (10x10 ⁶ תאים ב100 μl PBS) לוריד באמצעות ורידי זנב לרוחב או בסינוסים רטרו מסלולית, בנוחות של הנסיין.
5. שים את העכבר על כרית חימום ולהגן על העיניים עם ג'ל העיני.
6. Coverslip זכוכית (35 מ"מ קוטר) הוא לשים בצלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים, שבו יש חור בקוטר 30 מ"מ. שמן שימוש הוא לשמור על צלחת תרבית רקמה במגע עם coverslip.
7. לחתוך עור בטן במספריים כדי לחשוף את הצפק. לחתוך הצפק עם מספריים לחשוף מעי.
8. להוסיף 200 μl PBS (מחומם מראש על 37 מעלות צלזיוס) לעמחלל eritoneal. קח את העכבר ביד שלך ולהפוך אותו עם פנים כלפי מטה, כך שהמעי יוצא מחלל הצפק עם לחץ עדין. מניחים את העכבר בצלחת תרבית רקמה.
9. בעדינות deroll המעי עם ניצני כותנה מעוקרים על coverslip כדי לחשוף את כלי mesenteric.
10. לחתוך רקמות נייר בלהקות ולהרטיב אותם עם 37 מעלות צלזיוס PBS מחומם. לשתק את המעי עם החתיכות של רקמות נייר כדי להקטין את התנועות הנובעות מתנועה פריסטלטית.
11. שים את צלחת תרבית רקמה והעכבר בתוך חדר thermostated 37 ° C על הבמה המגש המותאמת אישית של מיקרוסקופ ההפוכה. להציג את מזרק המכיל sc הרדמה לרגלו האחורית. הערה: בנוסף, העכבר יכול לקבל חמצן (0.5 ליטר / דקה) עם מסכה.
12. עכבר בקרה להרדמה על ידי בוהן צביטה ובדיקת קצב הנשימה בכל 30 דקות. במידת הצורך, לספק דחיפה של הרדמה (20 μl) כדי לשמור על הרדמה כראוי. לֹאE: יש להימנע ייבוש של כלי הדם. לכן, לחותו נשמר על ידי ההרטבה באופן קבוע רקמות נייר משמשות כדי לשתק את המעי עם 37 מעלות PBS חימם-C.

5. התנהגות מדידת נויטרופילים ומונוציטים בכלי שייט מוסת in vivo באמצעות מיקרוסקופית Intravital

1. לייזרי סט ל488- ו561- בהספק הנמוך ביותר הנחוץ כדי למנוע phototoxicity מושרה לייזר. בניסויים שלנו, הוא נמוך מ -0.5%. עוצמה של ה- GFP במונוציטים וצבע כתום בנויטרופילים היא כל כך בהירה, כי בדרך כלל 0.3% הוא מספיק. הערה: זה מייצג כוח לייזר של 0.15-0.25 mW עם המערכת שלנו.
2. לרכוש תמונות של 512 x 512 פיקסלים (כלומר, 635 מיקרומטר) ב 2.2 שניות עם חריר פתוח באמצעות אובייקטיבי היבשה 20X של מיקרוסקופ ההפוכה. השתמש בZ- עומק בין 10 עד 20 מיקרומטר, שמבטיח אות מספיק עם סמכויות לייזר נמוכות.
   הערה: אנחנו בדרך כלל לבצע ניסויים עם Z- עומק בין 12 עד 1656; מ '. במקרה של דמויות וסרטים שהוצגו, Z- העומק הוא 20 מיקרומטר. בניגוד שלב מאפשר זיהוי של קירות אנדותל והדמיה מתבצעת על ורידי mesenteric. מאחר ותאים שסיירו לעבור די לאט עם מהירות של 5-10 מיקרומטר / min ^6, הקלטת תחום העניין בכל 20 שניות היא משביעת רצון. עם ההגדרות שתוארו, השלב הממונע מאפשר ההקלטה של ​​עד 7 תחומי העניין באותו הזמן.
3. מניחים את העכבר וכלי mesenteric בתא התרמוסטט של המיקרוסקופ הם לאפשר להם להתאושש מההכנה למשך 30 דקות לפני הרכישה של הסרט הראשון. במהלך תקופה זו, לבחור כמה תחומי העניין. פוקוס על פני השטח luminal של כלי השיט הקרוב ביותר למטרה. במידת הצורך, לנצל את אוטומטי הקרינה הקלה של האנדותל כדי להגדיר את המיקוד.
   הערה: ניתוח במהלך הכנת עכבר מעט מדגיש את האנדותל. כתוצאה מכך, מתגלגל של נויטרופילים וניתן לצפות / או מונוציטים בהכנת 15 דקות הראשונה שלאחר העכבר.
4. להקליט סרט ראשון למשך 30 דקות בתנאי מצב יציבים, תמונה אחת בכל 20 שניות.
   הערה: התוכנה רוכשת כל תחום העניין ב2.2 שניות והבמה הממונעת עוברת באופן אוטומטי מתחום אחד למשנהו. זה חוזר למצב הראשון בתוך 20 שניות במהלך 30 דקות של סרט ההקלטה.
5. ליזום דלקת בכלי דם, להוסיף טיפה של 20 μl של PBS המכילה TLR2 של 100 מיקרוגרם / TLR1 אגוניסט Pam3CSK4 ¹² ישירות על כלי הדמיה.
6. לשלוט במיקוד לכל תחום העניין.
   הערה: במהלך הרכישה, תמיד יש שינויים קלים של התמקדות בציר z. למרות Z- עומק 10-20 מיקרומטר, זה יכול לגרום לירידה של עוצמת הקרינה. לכן, למקד ידני בכל תחום העניין בסופו של כל סרט, במידת צורך. הקלטת סרטים למשך 30 דקות תקופות ועד 3 שעות לטל לאחר תחילת הדלקת.
7. בסוף הניסוי, להקריב את העכבר הרדים נקע בצוואר רחם.

6. דור של קבצי סרטים ומעקב של לויקוציטים

הערה: רכישת תוכנת ניקון מייצרת .nd2 קבצים אבל ההליך הבא יהיה דומה עם תוכנה ומותגים אחרים.

1. קבצי יצוא סדרת TIFF כ.
2. עבור לתוכנת ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/). לייבא את סדרת TIFF. כל ערוץ כקובץ שונה.
3. החל מסנן חציון ברדיוס של 2.0 פיקסל לערוצים הירוקים ואדום כדי להפחית את רעש רקע (תהליך> מסננים> חציון ...).
4. להמיר קבצים לינארי (תהליך> ינארי> הפוך ינארי). הפעל את התוכנה על מנת לחשב את הסף לכל תמונה.
5. מיזוג ערוצי סדרת תמונה אחת (תמונה> צבע> מיזוג ערוצים ...) ל. בחר מונוציטים בGreeערוץ n, נויטרופילים במסלול האדום והאור מועבר בערוץ האפור.
6. המרת תמונות נערמו לצבעי RGB (תמונה> צבע> מחסנית ל- RGB).
7. שמור את הקובץ כ.אבי
8. נתונים מיובאים והידור בתוכנת Imaris (Bitplane). תנועות של מונוציטים ונויטרופילים לאחר מכן מעקב באמצעות ספוט מעקב האשף.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

כתב היד מתארת ​​פרוטוקול מותאם כדי לפקח על התנהגותם של מונוציטים ונויטרופילים בורידי mesenteric של עכברים מורדמים בזמן אמת בקלות. השימוש בתא thermostated-37 ° C הוא חובה כדי לשמור על הטמפרטורה של העכבר וגם בשל התנועה תלויה בטמפרטורה של לויקוציטים. הכנה של העכבר מוצגת באיור ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מתודולוגיות מתוארות בכתב היד הזה מספקים גישה עקבית ללמוד ביעילות מונוציטים ונויטרופילים התנהגות בעורקי mesenteric בתנאי מדינה ודלקתית יציבים.

הצעד המכריע של ההכנה הוא חוסר תנועה של המעי עם רקמות הרטובות-PBS. אם מבוצע כראוי, כלי mesenteric ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 ml polystyrene round bottom tubes	Beckton Dickinson	352058
10x CFI Plan Apochromat 0.45   DT:4mm	Nikon
20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT:1mm	Nikon
Cell Tracker Orange CMRA Dye	Life Technologies	C34551
EasySep Magnet	Stem Cell Technologies	18000
EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit	Stem Cell Technologies	19762
EDTA	Sigma Aldrich	E6758
FCS	PAA	A15-042
Immersion Oil Type A	Nikon		any viscous oil
Life Box Temperature Control System	Life Imaging
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761
NH4Cl	Sigma Aldrich	A9434
Nikon A1R confocal microscope	Nikon	A1R	inverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software
PBS	Life Technologies	D8537
phenol red free DMEM/F12	Life Technologies	21041-025	any phenol red free medium is suitable
PAM3CSK4	Invivogen	tlrl-pms	reconstitute in PBS
Rat serum	Stem Cell Technologies		included in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit
Tissue culture dish 100	TPP	93100