הדמיה של Dynamics שטח תא הצמח עם זווית משתנה epifluorescence מיקרוסקופית בזמן אמת

Summary

המטרה של פרוטוקול זה היא להדגים כיצד לפקח דינמיקת fluorescently- מתויג חלבון על משטחי תא צמח עם מיקרוסקופיה epifluorescence זווית משתנה, מראה מהבהב נקודות של PATROL1 מתויג GFP, חלבון סחר קרום, בקליפת התא של המתחם הפיוניות ב thaliana ארבידופסיס.

Abstract

A plant’s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed ‘residence time’) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

Introduction

The plant cell surface, including the plasma membrane and its immediately adjacent cytoplasm, is the main region of a plant cell’s perception and integration of biotic and abiotic cues from the extracellular environment. In response to these cues, cell surface components including plasma membrane proteins and the cortical cytoskeleton undergo dynamic changes, on a time scale of seconds to minutes^1-4. Thus, real-time and high-resolution imaging of fluorescent proteins on the cell surface can illuminate a plant’s responses to environmental cues at the molecular level.

Confocal laser scanning microscopy is a powerful tool for determination of fluorescently-tagged protein localization³, however, it is often difficult to monitor the real-time protein dynamics because of its relatively long capturing times. An emerging technique for real-time monitoring of proteins in the plant cell is variable angle epifluorescence microscopy (VAEM), which is an adaptation of equipment usually used for total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. In TIRF microscopy, the fluorescence-excitation light source is an evanescent light field that is generated when the entry angle of the laser is shallow enough to totally internally reflect light at the glass–water interface. The penetration depth of the evanescent light field is around 100 nm. TIRF microscopy is an outstanding tool for single molecule imaging, such as the detection of exocytosis in animal cells⁵. However, evanescent light cannot reach plasma membranes or the cortical cytoplasm in plant cells, because they have thick cell walls. Recently, TIRF microscopy equipment has been adapted by plant cell biologists, observing that a laser, if angled slightly more deeply than when being used to induce total internal reflection phenomena, could excite the surface of plant cell samples, resulting in high-quality plant cell imaging^6,7. The excitation illumination depth is varied by adjusting the entry angle of the laser; therefore, this technique is described as VAEM. This optical system is also called variable angle TIRF microscopy (VA-TIRFM) because there is a possibility that total reflection may take place at the cell wall-periplasm interface⁷, however, the term VAEM is used in this article, as per the first report in plants⁶.

The goal of this protocol is to demonstrate practical procedures for using VAEM to visualize fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces. Additionally, an image analysis protocol to quantify the residence time (duration of presence) of molecules is described for VAEM movie analysis. GFP-PATROL1 dot blinking on stomatal complex cells in Arabidopsis thaliana cotyledons is used as an example. PATROL1 was identified by forward genetic approaches as a causal gene of a stomatal response defect mutant in A. thaliana⁸. PATROL1 is a plant homolog of MUNC-13, which is a priming factor in synapse vesicle exocytosis⁸. In response to environmental cues, such as light or humidity, it is thought that PATROL1 reversibly regulates the delivery of a proton pump to plasma membranes in the stomatal complex. Stomatal complexes each comprise a pair of guard cells⁸ and subsidiary cells⁹, and they require a proton pump for stomatal movement. In these cells, GFP-tagged PATROL1 localizes to dot-like structures that remain on the plasma membrane for less than 1 min⁹.

Protocol

1. הכנת השתילים

1. לעקר את הזרעים.
   1. הכן את פתרון העיקור על ידי הוספת 500 μl NaClO (כלור זמין: 5.0%) ו1 μl 10% מים סטריליים 500 μl טריטון-100 X.
   2. א 10 המהונדס בערך מקום thaliana זרעי ביצוע GFP-PATROL1 ⁸ לתוך צינור 1.5 מ"ל.
   3. הוסף 1 מיליליטר 70% אתנול פתרון, ומערבבים היטב על ידי היפוך חמש פעמים. השאר דקות 1.
   4. שים לב לזרעים לשקוע לתחתית של התחתית. בזרימה למינרית נקייה, בעדינות להסיר את אתנול 70% באמצעות micropipette, ולהוסיף 1 מיליליטר פתרון עיקור. מערבבים היטב על ידי היפוך חמש פעמים ולהשאיר למשך 5 דקות.
   5. שטוף את הזרעים. עדיין עובד בתנאים אספטיים על ספסל נקי, להסיר בעדינות את הפתרון באמצעות micropipette, ולהוסיף 1 מיליליטר מים סטריליים. חזור חמש פעמים. הזרעים המעוקרים עשויים להיות מאוחסנים במים סטריליים על 4 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים.
2. כךw הזרעים המעוקרים על 0.5% gellan-הגדילו את מסטיק 1/2 צלחת בינונית Murashige וSkoog (pH 5.8) ^9. הדבק את המכסה על הצלחת באמצעות שתי שכבות של קלטת כירורגית.
3. דגירה את הצלחת בחושך על 4 מעלות צלזיוס עם תא אחסון קר, O / N.
4. העבר את הצלחת לתוך תא צמיחה נקבע על 23.5 מעלות צלזיוס עם מחזור אור-חושך / 12-שעות 12 שעות באמצעות 100 מ 'μmol ^-2 שניות ^-1 אורות לבנים, ודגירה של 7 ימים. שתילים עם ארוכת פסיגים של כ 1 מ"מ אז יכולים להיות שנקטפו.

2. שמים בגלילה התקנת דוגמאות טבורית

הערה: גורם חשוב בהכנת דגימה להסתכלות VAEM היא הימנעות מההכללה של בועות אוויר בין הדגימה ומכסה הזכוכית. בועות לצמצם במידה ניכרות את איכות התמונה של VAEM ידי גרימת הבדלים בשבירה. שיטה פשוטה, שיש לנו בשם "טיפת שמים 'הרכבה, יכולה לשמש כדי למנוע בועותבין א ' פסיגים thaliana ומכסה הזכוכית. זה צריך להיעשות באופן מיידי לפני התצפית.

1. מניחים 30 μl של חיץ בסיסי [5 מ"מ 2 (-morpholino N) -ethanesulfonic חומצה-טריס (MES-טריס) ב- pH 6.5, 50 מ"מ KCl, 100 מיקרומטר CaCl _2] במרכז שקופיות זכוכית (גודל: 76 × מ"מ 26, עובי: 1.0-1.2 מ"מ).
2. הסר טבורית משתיל 7 ​​יום בן באמצעות מספריים לנתח. לצוף טבורית עם צד התצפית פונה כלפי מעלה על הירידה הבסיסית חיץ (איור 1, שלב 1).
3. מניחים 30 μl של חיץ בסיס במרכז מכסה זכוכית (גודל: 18 × 18 מ"מ, עובי: .12-.17 מ"מ) (איור 1, שלב 2). הפעל את מכסה הזכוכית בעדינות כלפי מעלה. מתח פנים ימנעו את ירידת החיץ מלנפול. החזק את מכסה הזכוכית עם פינצטה על קצה אחד. הנח את הקצה השני בשקופית הזכוכית כך שירידת החיץ היא כ מעל טבורית.
4. עם הקצה של מכסה הזכוכית עדיין בשקופית, ועדיין מחזיק את הקצה השני עם פינצטה, להתאים את המיקום של ירידת החיץ תחת מכסה הזכוכית, כך שזה ממש מעל מדגם טבורית (איור 1, שלב 3). עזוב את מכסה הזכוכית. הר ירידה במדגם וכתוצאה מכך הכנה ללא בועות אוויר.
5. נגב את החיץ עודף באמצעות רקמות ונטולי מוך. שים לב להכנה מיידית (ראה שלב 3).
   הערה: אין צורך לאטום את הדגימות.

3. VAEM תצפית וסרט רכישה

הערה: מערכת מיקרוסקופ TIRF ⁹ השתמשה במחקר הנוכחי מתוארת כדלקמן: מיקרוסקופ הפוך מצויד ביחידת TIRF ועדשה אובייקטיבית TIRF עם צמצם מספרי של 1.49. לבקרה ממוחשבת של זווית כניסת הלייזר, משמשת תיבת בקרה. חלבון ניאון ירוק (GFP) הוא נרגש עם לייזר 488 ננומטר שאוב אופטי של מוליכים למחצה, ולאהוא הקרינה מזוהה דרך מסנן להקה עובר 510-550 ננומטר כדי למנוע autofluorescence מכלורופלסטים. הערך המרבי שנמדד תפוקת סיבי הכח הוא 13.0-13.5 mW. לגילוי, אלקטרון הכפלת מכשיר תשלום מצמידים מערכת (EM-CCD) ראש המצלמה ויחידת שינוי הגדלת המצלמה C-הר משמש.

1. כייל את מרכוז הלייזר והתמקדות על פי הוראות היצרן.
   הערה: שלב זה הוא קריטי לתצפיות VAEM מדויקות. מומלץ מאוד שבדיקות תקופתיות של נהלי התאמת נתיב לייזר, מתאימות למיקרוסקופ שלך, מתבצעות.
   1. לקבוע את המיקום המרכזי מואר עם נתיב אור ללא עדשה אובייקטיבי על התקרה של החדר מיקרוסקופי. כדי לסמן את המיקום המרכזי, לשים חותם מעגל צבעוני על התקרה (איור 2, שלב 1, 2).
   2. להאיר את התקרה עם עדשה אובייקטיבית (איור 2, שלב 3, 4). הזז אותיlluminated אזור למצב המרכז (איור 2, שלב 5). פוקוס הלייזר (איור 2, שלב 6). לכוונן את המיקום של הלייזר הממוקד למרכז (איור 2, שלב 7).
2. הגדר דגימה על הבמה של המיקרוסקופ ובחר תאים לתצפית באמצעות תאורה בשדה בהירה.
3. בדוק שחלבון פלואורסצנטי ניתן להבחין בתאים, ולהגדיר את עמדת -axis z בתא השטח באמצעות תאורת epifluorescence (איור 3 א).
4. לבצע תצפיות VAEM.
   1. להטות את זווית הכניסה של קרן הלייזר בהדרגה עם תיבת בקר. במקביל, לפקח על תמונת החיה בזהירות. בתחילה, התמונה תהיה מטושטשת (איור 3).
   2. ככל שעולה זווית הלייזר, תמונת VAEM תהיה פחות מטושטשת, סופו של דבר לייצר תמונה ברורה (איור 3 ג ו-ד '). בשלב זה, להפסיק increaלשיר את זווית הלייזר. אם אות הקרינה הולכת לאיבוד, להקטין לזווית רדודה.
   3. לכוונן את זווית כניסת הלייזר כדי להשיג תמונה טובה יותר. כוונון עדין של עמדת -axis z עשוי גם לשפר את התמונה. במידת צורך, להתאים את הפרמטרים האופטיים (כוח לייזר, אורך גל ומערכת סינון) ופרמטרי חיישן תמונה [גודל תמונה, זמן חשיפה, רווח, ורווח digitizer אלקטרונים הכפלה (EM)].
      הערה: במקרה של ציוד מיקרוסקופ TIRF שתואר לעיל, נציג פרמטרים הם כדלקמן. הגדלה של עדשה ממש מול המצלמה: 2X; פלט לייזר: 1.0 mW; גודל תמונה: 512 × 512 פיקסלים; זמן חשיפה: 100 אלפיות שני; קבל: 5 ×; Digitizer: 11 MHz; ורווח EM: 100.
5. לרכוש סרט כקובץ תמונת TIFF מרובים עמודים באמצעות תוכנת מיקרוסקופ המסחרית. הנה, הסרט הוא נקודות שכותרת GFP מהבהבות על פני השטח של תאי הפיוניות.
   הערה: תנאי רכישת תמונת נציג הם כמו folשפל. רכישת מצב: הזרם ל- RAM; מספר המסגרות: 600; וגודל קובץ TIFF מרובי עמודים: ~ 302 MB.

4. רשם גלים ניתוח לכימות של ה- GFP שכותרת דוט מגורים זמן שימוש בתוכנת פיג'י

1. התקן פיג'י ('פיג'י היא רק ImageJ') תוכנה ¹⁰ באמצעות ההוראות של המחברים (http://fiji.sc/Fiji).
2. הפעל פיג'י ולפתוח את קובץ TIFF מרובי עמודים נרכש באמצעות תפריט פיג'י "קובץ-הפתוח".
3. מקום בשורה באתר של עניין, תוך שימוש בתפריט סרגל כלי פיג'י "קו ישר מבחר כלי". לחלופין, להשתמש ב" מקוטע קו מבחר כלי "או" Freehand קו מבחר כלי ". בתוצאות שהוצגו כאן, קו ישר של 100 פיקסלים (המקביל ל 8.0 מיקרומטר) הונח על תא בת (איור 4 א).
4. הפוך תמונת רשם גלים באמצעות תפריט פיג'י "תמונה-ערימות-דינמי Reslice "(http://fiji.sc/Dynamic_Reslice) (איור 4). לחלופין, "Flip האנכי" "90 מעלות סובב" ובחלון תיבת סימון זמין גם (לא השתמש בתוצאות שהוצגו כאן). X וציר y בתמונה רשם גלים לציין את מיקום הקו (100 פיקסלים המתאימים ל 8.0 מיקרומטר) וזמן תצפית (600 פיקסלים מקבילים ל -60 שניות), בהתאמה. אם תמונת רשם גלים אינה משביעה רצון, את המיקום והסוג (ישר, מפולחים וחופשי) של הקו על התמונה מרובות העמודים עשויים להיות שונה. כ שינויי הקו, תמונת רשם גלים דינמית משתנה. שמירת תמונת רשם גלים כקובץ TIFF באמצעות תפריט פיג'י "קובץ-שמירה ב- Tiff".
5. מדוד את האורך של הבועה בכיוון של ציר זמן.
   1. כדי לבצע הפחתת רעש, להחיל מסנן גאוס לתמונות רשם גלים באמצעות תפריט פיג'י "תהליך מסננים-Gaussian Blur". "סיגמא (רדius) "הפרמטר הוא מתכונן (רדיוס 1 פיקסל משמש לתוצאות שהוצגו).
   2. מגזר אזורי האות על ידי thresholding, באמצעות תפריט פיג'י "תמונה התאם-סף".
      הערה: יש כמה אלגוריתמי thresholding לבחירה. בתוצאות שהוצגו, אלגוריתם "הין" נבחר (איור 4C).
   3. הכן למדידת הזמן (Y) -axis אורך של הבועה באמצעות התפריט "נתח-סט מדידות". בדוק את "המלבן התוחמת" בחלון "מדידות הגדר". באופן אידיאלי סט האזור צריך להיות קטן ככל האפשר, כדי לא לכלול רעש. כאן, באזור המינימום נקבע על 50 פיקסלים. מדוד את הזמן (Y) -axis אורך של הבועה באמצעות התפריט "נתח-לנתח חלקיקים". כדי להשיג את תוצאת הערכים ולהוכיח את האמינות של אזורי המדידה, בדוק את "צג התוצאות" ועל "הוסף למנהל </ Em> "קופסות.
   4. ערכים בעמודה "גובה" הם הזמן (Y) -axis אורכים לבועה שנמדדה (איור 4D). שמור את הערכים באמצעות תפריט שולחן תוצאות "כקובץ-שמירה" ולחשב ולעבד את בסיס הנתונים של משכי תמונת בועה באמצעות חבילה סטטיסטית ו / או תוכנת גיליון אלקטרוני (איור 4E).

תוצאות

במאמר זה וידאו, הפרוטוקולים לתצפית VAEM של ה- GFP-PATROL1 בא תאים מורכבים הפיוניות טבורית thaliana מסופקים. הרכבת ירידת שמים היא שיטת הכנה פשוטה שעשויות לעזור להפחית את ההתרחשות של בועות אוויר בהכנות VAEM של א ' פסיגים thaliana (איור 1). Overtilting של לייזר הכנ?...

Discussion

במאמר זה וידאו, ניתנים פרוטוקולים לניטור ומדידת ההתנהגות הדינמית של נקודות GFP-PATROL1 במתחם הפיוניות של thaliana ארבידופסיס. כפי שניתן לראות כאן, התבוננות VAEM היא כלי רב עוצמה עבור הדמיה חיה של משטחי תאי צמח. תחת תנאי הניסוי משמשים כאן לניטור GFP-PATROL1, היה photobleaching הקרינה קט?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inverted microscope	Olympus	IX-73
TIRF unit	Olympus	IX3-RFAEVAW
TIRF objective lens	Olympus	UAPON 100 × OTIRF	NA = 1.49
Laser angle control box	Chuo Seiki	QT-AK
Optically pumped semiconductor laser	Coherent	SapphireTM LP USB 488-20 CDRH Laser
510–550 nm band-pass filter	Olympus	U-FBNA
EM CCD camera	Hamamatsu Photonics	ImagEM C9100-13
C-mount camera magnification change unit	Olympus	U-TVCAC
MetaMorph software	Molecular Devices	MetaMorph version 7.7.11.0
TIRF microscopy manual	Olympus	AX7385	Instructions: Total Internal Reflection Illumination System (Printed in Japan on August 24, 2012)
Immersion oil	Olympus	Immersion Oil Typr-F	ne = 1.518 (23 degrees)