ביטוי יעיל יונקים ניידים וטיהור חד צעד של תאי גליקופרוטאינים להתגבשות

Summary

This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.

Abstract

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.

Introduction

הבנת מבנה חלבון ברמה אטומית היא מפתח לחשיפת הבסיס המולקולרי של מחלות ומסלולים ביולוגיים. קריסטלוגרפיה חלבון X-ray היא השיטה הנפוצה ביותר / ישימה לקביעת מבני macromolecular. האתגר העיקרי של שיטה זו הוא קבלת כמות מספקת של חלבון מקופל כראוי, טהור. זה הופך להיות בעיה במיוחד בעבודה עם חלבונים מופרשים יונקים, שעוברים לאחר translational שינויים ספציפיים.

חלבוני bacterially-הביעו הם המקור העיקרי של חלבונים התגבשו הופקדו בחלבון נתוני בנק ^1. מערכות ביטוי חיידקים במידה רבה הם העדיפו כי הם מהירים, זולים ובדרך כלל לייצר תשואות גבוהות של חלבון. עם זאת, תחומים תאיים של חלבוני יונקים לידי ביטוי בחיידקים לעתים קרובות אינם מקופלים כראוי, שבו נדרשים צעדי מקרה refolding וטיהור נרחבת לקבלת הומוגנית FOחלבון lded. בנוסף, רבים חלבונים יונקים דורשים glycosylation לאחר translational להשיג קיפול נכון ^2. למרות שהביטוי וglycosylation בתאי שמרים או חרק יכולים להתגבר על הבעיה מתקפלת, לאחר translational שינויים, כוללים glycosylation, שונים באופן משמעותי מאלה של תאי יונקים ^3, מניב חלבונים עם שינויים לא נכונים או שאינם הומוגנית.

תאים יונקים להביע כל המכונות מולקולריות הנדרשות על מנת להבטיח שלאחר translational שינויים נכונים ומתקפל; עם זאת, מערכות ביטוי אלה אינן העדיפו בדרך כלל על ידי רוב המעבדות, בשל תשואות מוגבלות ועלויות גבוהות של חומרים כימיים וחומרים מתכלה. Polyethyleneimine (PEI), מגיב transfection סטנדרטי הוא זול יחסית, אך מטיל רעיל רבות ויעילות transfection נמוכה, וכתוצאה מכך העלויות מוגברות בתקשורת סלולארי, ה- DNA, וculturing ציוד. חלופות רבות לPEI הן יקרות. אנו פוניםנושאים אלה על ידי המתאר שילוב של כלים תרבית תאים השתפרו וששונה כימי PEI לשיטה מהירה וזולה יחסית לביטוי של חלבונים מופרשים יונקים, ואחריו טיהור בשלב יחיד. שיטה חזקה זה נותנת תשואות מספיקות ללימודים תפקודיים וביוכימיים ^4, ובמקרים מסוימים, גורמת לחלבון ניתנים לגיבוש ללא טיהור נוספת.

פרוטוקול זה מתאר כמה שיטות למקסם ביטוי ולהניב לחלבונים מופרשים יונקים באדם כליה עוברית (HEK) 293F תאים שגודלו בהשעיה. כל יעילות transfection (ועלות), ייצור חלבון וטיהור משופרת מאוד על ידי הבא בפרוטוקול זה. PEI שונה על ידי התוספת של carbamates באמצעות תגובת טבעת פתיחת שלב יחיד (PEI-TMC-25, סינתזה ותכונות מתוארות בפירוט בנ"צ ⁵⁾ משפרים באופן משמעותי את יעילות transfection, מפחית את רעילה מקטיוניהפרעה קרום ולכן מקטינה את עלויות ניסוי. יתר על כן, כדאיות תא וביטוי חלבון הם השתפרו מאוד עם התוספת של תוספי התרבות לספק גלוקוז וויטמינים. חשוב לציין לייצור חלבונים מסוכרים, טיפול בkifunensine, מעכב כימי רעיל של Mannosidase אני, מייצר חלבונים עם, glycans בוגר מוגדר, אשר ניתן להסירו על ידי EndoHf endoglycosidase להניב חלבונים עם N-acetylglucosamine אחת במקום של באורך מלא N צמוד סוכרים ^6. לבסוף, את ההפרשה של חלבונים לתוך מדיום סרום ללא, הגדרה כימית מאפשרת טיהור מהירה וקלילה ללימודים מבניים ביוכימיים. טיהור שרף חומצת ניקל-nitrilotriacetic (Ni-נת"ע) בשלב יחיד מסירה את רוב זיהום מינים בsupernatant ו, במקרים מסוימים, יכול להניב חלבון של טוהר מספיק לגיבוש.

Protocol

1. הפקה של כמויות מיליגרם של פלסמיד דנ"א לtransfection חולף בקנה מידה גדולה

1. לשכפל את החלבון של עניין לתוך וקטור גבוה עותק מספר יונקים ביטוי באמצעות שיבוט אתר הגבלה, או טכניקה מתאימה אחרת.
   1. לקבלת תוצאות אופטימליות, השתמש pHLsec ⁷ וקטור, שבה יש מובנה 6His תג C-מסוף, רצף חזק אמרגן קוזאק ואות הפרשה מותאמת.
2. להפוך את הפלסמיד על תאים המוסמכים.
   1. הוסף 20 μl של תאי חיידק המוסמכים על 1 מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד ודגירה על קרח למשך 30 דקות.
   2. תאי הלם חום על 42 מעלות צלזיוס במשך 35 שניות, ואז לדגור על קרח למשך 2 דקות.
   3. להוסיף 300 μl של מדיום חיידקי צמיחה (SOC) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות, רועד ב 220 סל"ד.
   4. תאי צלחת על צלחת אגר עם מבחר אנטיביוטי מתאים.
      1. השתמש 100 מיקרוגרם / מיליליטר carbenicillin אם פלסמיד הוא בוקטור pHLsec.
3. מושבות תרבות ב 250 מיליליטר של מרק לוריא (LB) מדיה בתוספת 100 מיקרוגרם O / מיליליטר אנטיביוטיקה (carbenicillin) / N על 37 מעלות צלזיוס, רועדות ב 220 סל"ד.
4. לטהר DNA מתרבות באמצעות ערכת Hi-Speed ​​פלסמיד מקסי פי הפרוטוקול של היצרן.
   1. Elute DNA במאגר EB (10 מ"מ טריס-Cl, pH 8.5), במקום מאגר TE.
   2. Aliquot פלסמיד המטוהר בסכום הדרוש לtransfection ולאחסן ב -20 ° C.

2. בקנה מידה גדול תרבות והחלוף Transfection של תאים 293F

1. תוסף מדיה 1 L 293F עם 10 מיליליטר של גלוטמין ו 5 מיליליטר פן / סטרפטוקוקוס (שני 100x). חנות ב 4 מעלות צלזיוס. 5 מיליליטר פן / סטרפטוקוקוס הוא כוח מספיק בתנאי סרום ללא וריכוז האנטיביוטיקה המופחת משפר כדאיות תא במהלך transfection, אשר משפר את תשואות חלבון.
2. תאי 293F תרבות בתקשורת 300 מיליליטר בפוליקרבונט 1 ליטר מבולבל צלוחיות Erlenmeyer עם כובע פרקים במעלות צלזיוס 37 עם 8% CO _2, תוך רעד בתרבית רקמת חממה סטנדרטית.
3. לדלל תאים עד 5 x 10 ⁵ / מיליליטר צפיפות יום אחד לפני transfection.
4. ביום transfection, בינוני תרבות תוספת על ידי הוספת 10% בנפח של 2% w / v Boost הסלולרי בתקשורת 293F.
   1. למדוד ריכוז סוכר באמצעות מד סוכר לפי הוראות היצרן ותוספי שימוש לפי צורך כדי להשיג ריכוז הגלוקוז של 500 מ"ג / ד"ל.
5. להוסיף kifunensine (1 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז סופי) בשלב זה כדי לשלוט glycosylation חלבון.
6. נפח לחשב של DNA הנדרש לפלסמיד 1 מיקרוגרם לכל 1 x 10 ⁶ תאים. בתנאים סטריליים, לדלל DNA במדיום סרום ללא 5 מיליליטר.
7. חישוב נפח של מגיב transfection נדרש לפלסמיד 1 מיקרוגרם לכל 2 μl מגיב transfection. בתנאים סטריליים, לדלל מגיב transfection (PEI-TMC-25) במדיום סרום ללא 5 מיליליטר.
8. לְהוֹסִיףמגיב transfection לפתרון ה- DNA במרווחים של 1 מיליליטר, ערבוב בעדינות. דגירה של 30 דקות ב RT עבור מתחמים מגיב-דנ"א ליצירת. לאחר מכן להוסיף את הפתרון על גבי התאים בצורה טיפה חכמה.
9. אפשר תאי transfected לבטא חלבון ל72-96 שעות. מוסף עם ~ מדיה 10% שפר נפח תא יומי, או לפי צורך כדי לשמור על רמת סוכר בקריאה 400-600 מ"ג / ד"ל.

3. טיהור

1. למזוג לתוך בקבוק תרבות צנטריפוגות, צנטריפוגות במשך 20 דקות ב 1300 XG כדי גלולה תאים ולאחר מכן לאסוף את supernatant. אם יש צורך, לסובב פעם שנייה ו / או להשתמש במסנן 0.22 מיקרומטר להבהיר supernatant.
2. הוסף חוצץ 10% 10x נפח Ni-נת"ע מחייב (1.5 M NaCl, 0.5 ח"כ _{2 4} HPO, 0.1 מ 'טריס pH 8.5, 50 מ"מ imidazole).
3. הכן עמודה הכבידה על ידי הוספת 2 מיליליטר של תרחיף Ni-נת"ע בטור וequilibrating עם 10 כרכי עמודה (CV) של חיץ מחייב 1x. במידת האפשר, לעשות את כל צעדי הטור בחדר 4 ° C. Alternativאיליי, חלבון צינה וכל המאגרים על קרח לפני צעד טור, ולשמור על חלבון ונאסף זרימה דרך על קרח.
   הערה: תרחיף Ni-נת"ע הוא שרף 50% בנפח והקיבולת מחייבת המוצהרת של הייצור היא 50 מ"ג / מיליליטר. חרוזים Ni-נת"ע ניתן מחדש מחויבים עבור שימושים מרובים
4. לזרום supernatant על השרף ולאסוף זרימה דרך. חזור על שלב זה.
5. לשטוף עם 10 קורות חיים של חיץ לשטוף (300 מ"מ NaCl, 50 מ"מ K _{2 4} HPO, pH imidazole 20 מ"מ 8).
6. Elute החלבון ב5 קורות חיים של חיץ elution (300 מ"מ NaCl, 50 מ"מ K _{2 4} HPO, 250 pH imidazole 8 מ"מ).
7. אם נדרש deglycosylation:
   1. עבור נפח סופי של 0.5 מיליליטר, להתרכז eluate ל0.43 מיליליטר באמצעות concentrator צנטריפוגה. אם משקעים צורה, גלולה כל פסולת על ידי צנטריפוגה ב16,000 XG ו -4 מעלות צלזיוס.
   2. הוסף 50 μl של pH 500 מ"מ Na-ציטראט 5.5.
   3. הוסף 20 μl של EndoHf (1 x 10 ⁶ U / ml). לדגור על RT עבור שעה 2.
      לֹאדואר: האנזים עובד בצורה אופטימלית על 37 מעלות צלזיוס, אשר עלול לגרום לחלבון המרוכז כדי לצבור. להאריך את הדגירה RT, אם deglycosylation, שהוערך על ידי SDS-PAGE או immunoblotting, אינו שלם. האנזים אין פעילות ב 4 מעלות צלזיוס.
   4. כדי להסיר EndoHf: לשטוף amylose שרף 3x בופר פוספט (PBS) או חיץ אחסון סופי. דגירה חלבון עם שרף עבור שעה 1 ב 4 מעלות צלזיוס. ספין 5 דקות XG ב 1000 לגלולת חרוזים ולאסוף את supernatant.
   5. להתרכז חלבון באמצעות מסנן צנטריפוגה המתאים מולקולרי הפסקת משקל וחיץ תמורה למאגר אחסון (150 מ"מ NaCl ו -20 מ"מ HEPES pH 7.5).

תוצאות

במסמך זה המפורט להלן התוצאות של מערכת ביטוי זה חל על תחום אימונוגלובין kDa 13 מופרש (איג) מקולט החלבון מפעילה האדם הביע על תאי מיאלואידית 2 (hTREM2, שאריות 19-132). TREM2 הוא חלבון הטרנסממברני אני סוג המכיל תחום איג תאי יחיד שיש לו שתי אגרות חוב דיסולפיד ושני אתרי glycosylation N צמודים. ב...

Discussion

תאי HEK 293F מציעים ייצור חזק של חלבונים הדורשים שלאחר translational שינויים. מערכת זו מאפשרת ביטוי מהיר וניתן להרחבה של חלבונים מקופלים באופן מקורי המכילים disulfides, glycosylation, וזרחון שאחרת היה היעדר שימוש בכלים ביטוי שיגרתי יותר. בנוסף, מערכת זו יכולה לשמש לביטוי והטיהור של חלבון ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Culture Flasks	GeneMate	F-5909B
293 Freestyle Media	Gibco/Life Technologies	12338-018
GlutaMAX	Gibco/Life Technologies	35050-061	Use in place of Glutamine
Hype 5 transfection reagent	Oz Biosciences	HY01500
293fectin transfection reagent	Life Technologies	12347019
PEI transfection reagent	Sigma-Aldrich	408727
Maxiprep Kit	Qiagen	12162
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30430
Endo Hf	NEB	P0703L
Amylose Resin	NEB	E8021S
Cell Boost R05.2	HyClone	SH30584.02	Cell Culture Supplement
GlucCell	CESCO Bioengineering	DG2032	Glucose Monitoring System
Opti-MEM	Life Technologies	519850.91	Serum Free Medium for DNA transfection
Luria Broth (LB Media)	Life Technologies	10855-001
GC10 Competent Cells	Sigma-Aldrich	G2919